Study on molecular detection ofeggs

梁亦龍**樊　晶　何　睿（重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院，重慶　400005）

雞蛋分子檢測技術(shù)的研究*

Study on molecular detection ofeggs*

梁亦龍**樊晶何睿
（重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院，重慶400005）

**梁亦龍，男，1972年出生，2001年畢業(yè)于云南大學(xué)生物化學(xué)分子生物學(xué)專業(yè)，碩士，副教授。

蛋白質(zhì)是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，它不僅是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，而且是生命活動的主要承擔(dān)者，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。蛋白質(zhì)的主要來源是肉、蛋、奶和豆類食品，一般而言，動物蛋白品質(zhì)較高，含有充足的必需氨基酸。必需氨基酸有8種，無法由人體自行合成，必須從食物中攝取。蛋類含蛋白質(zhì)11%～14%，是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源。蛋類作為中國居民重要動物性食品之一，其營養(yǎng)豐富，為人類蛋白質(zhì)的主要來源。蛋中含有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪、卵磷脂、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分，其蛋清中含卵白蛋白，蛋黃蛋白質(zhì)含量豐富，蛋白質(zhì)的消化吸收率高，對人體生長十分有益。

雞蛋是人類獲得蛋白質(zhì)的主要來源之一，其質(zhì)量安全關(guān)系到人體健康，更是關(guān)系國計民生的重大問題。雞蛋的質(zhì)量高低，尤其是蛋品的真?zhèn)侮P(guān)系到千家萬戶的飲食安全。近幾年，一些不法商販為了牟取暴利，采用化學(xué)試劑人工合成雞蛋，“人造雞蛋”在深圳、杭州等地己相繼被發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重?fù)p害了消費者的健康。研究表明，“人造雞蛋”與真雞蛋蛋殼的主要成分都是碳酸鈣，但是蛋清蛋黃的成分不同，人造雞蛋中主要成分是樹脂、淀粉、凝固劑、色素等化學(xué)物質(zhì)，毫無營養(yǎng)價值且對人體有害。目前國家尚未出臺相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測真?zhèn)坞u蛋，消費者僅能憑感覺和經(jīng)驗識別，無法實現(xiàn)對蛋品真?zhèn)蔚默F(xiàn)場技術(shù)檢測。湯青萍等對仿土雞蛋的蛋品質(zhì)分析及變化規(guī)律進(jìn)行了研究，主要集中在蛋白質(zhì)的含量、蛋黃蛋白比、維生素含量上，沒有提及區(qū)分假雞蛋的檢測方法。

分子檢測技術(shù)是一種利用現(xiàn)代生物技術(shù)水平的檢測技術(shù)，具有靈敏度高、選擇性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，是新時期食品安全的戰(zhàn)略制高點之一。與常用的毛細(xì)管電泳法、光譜法以及各種聯(lián)用技術(shù)如氣質(zhì)聯(lián)用等法相比，后者雖然靈敏度高、測量結(jié)果準(zhǔn)確，但是操作復(fù)雜、設(shè)備價格昂貴、費時費力、不易攜帶、檢測成本高。因此，采用分子檢測技術(shù)對市售雞蛋進(jìn)行分析。結(jié)果表明，本方法快速、簡便，為商品檢驗人員對蛋品市場進(jìn)行廣泛的監(jiān)測提供科學(xué)的手段，為保護(hù)消費者權(quán)益提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

雞蛋，購于黃桷埡市場；農(nóng)村土雞蛋，農(nóng)戶購買。

電子精密天平，上海奧豪斯公司；DYCZ-24D雙垂直電泳槽；DYY- 6C電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

丙烯酞胺、N- N亞甲基雙丙烯酚胺、三羥基甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、過硫酸胺、三氯醋酸、考馬斯亮藍(lán)250、甲醇、冰醋酸，均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1引物設(shè)計

參見卵清蛋白基因設(shè)計，上游引物5'GACACAGATAAATAAGGTTGTTCGC- 3'，下游引物5'TTTCTCAGAAGCCATTGATGATGCCACT- 3'，引物由TaKaRa公司合成。

1.2.2卵清蛋白基因PCR擴(kuò)增

選取7種市售雞蛋，提取雞蛋的基因組DNA。用槍頭取蛋清100 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL核酸裂解緩沖液，混勻后于恒溫箱中65℃反應(yīng)1 h，期間不時搖勻；在樣品液中加入等體積酚/氯仿（1/1，v/v），混勻，于臺式低溫離心機(jī)4℃下12 000 r/min離心5 min；取上清于干凈離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇（1/1，v/v），混勻，于4℃下12 000 r/min離心5 min；取上清于干凈離心管中，加入2倍體積冷的無水乙醇，- 20℃放置過夜，于4℃下12 000 r/min離心5 min，小心去上清，加500 μL 70%乙醇，于4℃下12 000 r/min離心5 min，小心去上清，空氣中晾干，加入200 μL無菌水，充分溶解，DNA溶液保存于- 20℃。以其做模板，用引物擴(kuò)增卵清蛋白，擴(kuò)增PCR片段，反應(yīng)在PE DNA 9600儀器中進(jìn)行。PCR循環(huán)參數(shù)：變性階段94℃，5 min；循環(huán)階段94℃，1 min，55℃，35 s，72℃，1 min，共30次；復(fù)性階段72℃，10 min，凝膠電泳分析。

1.2.3卵黃蛋白的SDS- PAGE電泳

選取7種市售雞蛋，用槍頭取蛋黃100 μL，裂解液提取雞蛋黃蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度（生工試劑盒），并進(jìn)行SDS- PAGE蛋白質(zhì)電泳，上樣量為20 μg/mL。

1.2.4雞蛋卵磷脂的檢測

卵磷脂在蛋黃中含量較高，通過提取卵磷脂也可檢測雞蛋的成分。取100 μL蛋黃，1 mL冷丙酮，混勻10 000 r/min離心10 min，取沉淀，加入5 mL石油醚和15 mL乙醇，放入燒杯中混合均勻。離心10 000 r/min離心10 min，收集上清。將濾液收集，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀溫度設(shè)為40℃。收集產(chǎn)品，進(jìn)行薄層層析檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1卵清蛋白基因PCR結(jié)果與分析

卵清蛋白是動物卵中的貯藏蛋白，給發(fā)育中的胚胎提供氨基酸，也是食物中重要的蛋白質(zhì)來源，對人體健康具有多種改善和提高作用。通過檢測卵清蛋白能進(jìn)行雞蛋真?zhèn)蔚蔫b別。

卵清蛋白基因PCR電泳片段約為520 bp，結(jié)果如圖1所示。此片斷經(jīng)測序后，序列與已登錄的雞卵清蛋白基因序列一致。由圖1可知，市售真雞蛋與農(nóng)村土雞蛋的卵清蛋白擴(kuò)增片段一致。由于人造雞蛋主要樹脂、淀粉、凝固劑、色素等化學(xué)物質(zhì)，如果進(jìn)行DNA提取后，根本無法獲得卵清蛋白基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，檢測應(yīng)該為無電泳條帶。故此圖中未顯示假雞蛋的電泳條帶。

圖1　卵清蛋白PCR擴(kuò)增圖

2.2卵黃蛋白的SDS- PAGE電泳結(jié)果與分析

雞蛋的卵黃中含有大量的蛋白質(zhì)，每100 g雞蛋含蛋白質(zhì)12.8 g，蛋黃多居于蛋白的中央，由系帶懸于兩極。蛋黃體積約全蛋的30%~32%，主要組成物質(zhì)為卵黃磷蛋白，其中含有人體必需的8種氨基酸，并與人體蛋白的組成極為近似，人體對雞蛋蛋白質(zhì)的吸收率可高達(dá)98%。

SDS- PAGE電泳既可分析蛋白質(zhì)的純度，也可對蛋白質(zhì)的濃度進(jìn)行鑒定分析，它在生化物質(zhì)分析及生物活性物質(zhì)的分離、制備中和純度鑒定中具有廣泛應(yīng)用前景。

通過提取雞蛋蛋黃發(fā)現(xiàn)，在同樣的體積下，5泳道的蛋白質(zhì)染色要比2～4泳道的蛋白質(zhì)染色條帶深，表明其總蛋白質(zhì)含量農(nóng)村土雞蛋要大于雞場雞蛋，但其兩者的電泳圖的圖形條帶數(shù)量差別不大，結(jié)果見圖2。但如果要進(jìn)行農(nóng)村土雞蛋與雞場雞蛋的分子鑒定，用該方法不精確，應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行農(nóng)村母雞和雞場母雞的微衛(wèi)星序列鑒定分析才能確定，故本試驗中的方法不適合農(nóng)村土雞蛋和雞場雞蛋的鑒定分析。

圖2　雞蛋蛋黃SDS- PAGE電泳圖

2.3雞蛋卵磷脂的檢測結(jié)果與分析

雞蛋卵磷脂也可作為一檢測指標(biāo)，蛋黃卵磷脂中的主成分是磷脂酰膽堿（PC），卵磷脂是細(xì)胞膜的主要組成成分，適量補充卵磷脂有利于細(xì)胞的新陳代謝，恢復(fù)組織器官的功能，延緩衰老。雞蛋蛋黃卵磷脂薄層圖譜如圖3所示。雞蛋樣品具有卵磷脂，如果是假雞蛋，由樹脂、淀粉等構(gòu)成，根本不可能有卵磷脂的陽性結(jié)果存在，故卵磷脂的薄層層析檢測也可作為鑒別真假雞蛋的方法。

圖3　雞蛋蛋黃卵磷脂薄層圖譜

3　討論

本試驗結(jié)果顯示，市售雞場雞蛋與農(nóng)村土雞蛋都有共同的擴(kuò)增卵清蛋白基因片段，市售雞場雞蛋與農(nóng)村土雞蛋的SDS- PAGE凝膠電泳條帶類似，這兩種均可作為分子技術(shù)檢測蛋白質(zhì)的方法。該檢測技術(shù)可避免以往單憑感官檢驗的缺陷，可作為一種準(zhǔn)確、快速、高效的檢測真假雞蛋的有力措施。而對于市售假雞蛋，這兩種檢測方式都無法獲得陽性結(jié)果，即不能通過雞蛋的DNA提取獲得卵清蛋白的基因片段，也不能通過SDS- PAGE凝膠電泳獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)條帶。雞蛋的卵磷脂薄層層析圖也顯示，如果是真雞蛋，則會有卵磷脂的存在，可通過薄層層析檢測到陽性結(jié)果，否則沒有。雞場雞蛋與農(nóng)村土雞蛋檢測結(jié)果表明，這3種方法都可以作為真假雞蛋的鑒定方法，而農(nóng)村土雞蛋與雞場雞蛋的區(qū)別如果要從分子水平上進(jìn)行區(qū)分，這3種方法都難以進(jìn)行定量確定?？赏ㄟ^微衛(wèi)星序列獲得相應(yīng)農(nóng)村母雞和農(nóng)村土雞蛋的微衛(wèi)星序列進(jìn)行分析鑒定，進(jìn)而精確判斷。本試驗研究的3種鑒定方法適用于真假雞蛋的鑒定，如果為真雞蛋，用此3種方法為陽性結(jié)果，反之則為陰性結(jié)果，該研究可為更好地保護(hù)人們的健康和進(jìn)一步落實食品質(zhì)量安全市場準(zhǔn)入制度提供技術(shù)保障。

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LIANGYilong**FANJin HE Rui
（College ofbiological information，Chongqinguniversityofposts and telecommunications，Chongqing 400005，China）

摘要采用PCR方法檢測市售雞蛋的卵清蛋白基因片段，分析市售雞蛋的蛋白質(zhì)含量及蛋白質(zhì)電泳圖譜，用薄層層析檢測卵磷脂，以作為區(qū)別市售真假雞蛋的鑒別方法，為分子技術(shù)鑒別真假雞蛋奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞卵清蛋白基因；電泳；蛋黃

AbstractInthepaper,theovalbumingeneweremagnificationbyPCRtoanalysistheprotein contentand protein electrophoreticpatternsofcommerciallyavailableeggs,andlecithinweredetectedbythinlayerchromatography.Thesecanbe used as identification method for distinguishing between true and false eggs and lay the foundation for molecular techniquestoidentifytrueandfalseeggs.

Keywordsovalbumin gene；electrophoresis；yolk

收稿日期：2015- 06- 02

*基金項目：重慶市自然科學(xué)基金（CSCT，2009BB1288）；重慶郵電大學(xué)創(chuàng)新實驗計劃（2014061，2014062）；重慶市教委項目（KJ130520）。

DOI：10.3969/j.issn.1673- 6044.2015.02.010

文章編號：1673- 6044（2015）02- 0031- 03

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：TS253.7