許長春　許可鵬

【摘要】目的探討聯(lián)合應(yīng)用姜黃素與神經(jīng)干細胞治療脊髓損傷的效果。方法選取30只成年Wistar大鼠，將模型動物隨機分為三組：正常組、損傷組及聯(lián)合移植組，每組10只。觀察三組的BBB評分，誘發(fā)電位潛伏期及板試驗角度值的變化。結(jié)果聯(lián)合移植組的1，2，4，8周的BBB評分皆明顯高于損傷組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而兩組的BBB評分顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。大鼠CSEP的波形為“W”形，所有大鼠在術(shù)前和正常組術(shù)后的潛伏期正常。4周后，聯(lián)合移植組出現(xiàn)“W”形，但是誘發(fā)電位潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。自損傷后1周起，各時間點損傷組及聯(lián)合移植組大鼠行斜板試驗角度值均逐漸上升，聯(lián)合移植組所測得角度值均大于單純損傷組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論聯(lián)合應(yīng)用姜黃素與神經(jīng)干細胞治療脊髓損傷，可以激活Wnt/p-catenin信號通路使脊髓損傷后部分內(nèi)源性神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，減輕膠質(zhì)瘢痕，從而改善大鼠后肢功能的恢復。

【關(guān)鍵詞】姜黃素；神經(jīng)干細胞；治療；脊髓損傷；聯(lián)合應(yīng)用；臨床療效

【中圖分類號】R651.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-0616（2015）21-30-04

脊髓損傷（spinal cotd injury，SCI）是一種嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）創(chuàng)傷，目前尚無有效的治療手段。傳統(tǒng)觀念認為，困擾脊髓損傷后神經(jīng)功能修復的關(guān)鍵問題是損傷的神經(jīng)組織及細胞無法再生。干細胞的發(fā)現(xiàn)使中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究進入了新的領(lǐng)域。目前，SCI后的細胞替代治療已成為神經(jīng)功能修復的熱點問題。常用的方法有外源性干細胞移植與激活并誘導內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（endogenous neural stemcells，ENSCs），與外源性干細胞移植相比，激活并誘導內(nèi)源性神經(jīng)干細胞來修復脊髓損傷，不存在安全及倫理問題，其新生的神經(jīng)組織細胞在與機體整合上具有同源性，不存在排斥反應(yīng)。本研究通過聯(lián)合應(yīng)用姜黃素與神經(jīng)干細胞干預大鼠脊髓挫傷模型，觀察損傷后大鼠神經(jīng)功能修復情況，分析其效果，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

30只成年Wistar大鼠，體重（250.0±50.0）g，雌雄不拘，合格證號00005907，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。將模型動物隨機分為三組：正常組、損傷組及聯(lián)合移植組，每組10只。三組月齡、體重等一般資料比餃，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2脊髓損傷模型的制備

動物腹腔麻醉后，背部剪毛，常規(guī)碘酒酒精消毒。沿脊柱正中切開皮膚，分離肌肉，暴露椎骨，用咬骨鉗仔細咬去椎板，在T₉與T₁₁椎骨平面打開椎管，充分暴露T₁₀節(jié)段脊髓背面及兩側(cè)，用彎頭眼科鑷將脊髓輕輕挑起，用眼科剪將脊髓完全剪斷，將分離的肌肉縫合封閉椎管缺損，縫合皮膚，制成脊髓損傷模型。

1.3方法

正常組：僅行切皮、打開椎管，不施行SCI。

損傷組：脊髓全橫斷損傷。

聯(lián)合移植組：在脊髓完全橫斷后1周移植大鼠NSCs懸液+姜黃素組（500nmol/L）。

1.4神經(jīng)干細胞的提取、培養(yǎng)及鑒定

取孕14.5d左右的SD大鼠。常規(guī)消毒后用5mL注射器按0.06mL/10g劑量抽取適量5%水合氯醛腹腔麻醉，胚胎組織取出于無菌PBS中清洗，取胚胎額頂部2/3組織于盛有適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用刀片小心切碎后用200目濾網(wǎng)濾過，以去除大的組織塊、血管、腦膜等組織。用5mL槍頭小心用力均勻吹打15～20次，再經(jīng)過400目細胞篩過濾來制成單細胞懸液。將制好的單細胞懸液分裝到25mL無菌培養(yǎng)瓶，置于恒溫培養(yǎng)箱孵育中進行培養(yǎng)。Nestin抗體及熒光二抗進行標識。

1.5BBB功能評分評價大鼠下肢功能行為學檢測參照Basso等提出的大鼠SCI后功能評判標準（簡稱BBB評分法）對各實驗動物后肢的運動功能進行評分。所有觀察都在上午進行，評分前應(yīng)將所有動物的膀胱排空，時間為4min，評分時采用雙盲法。分別對損傷后1，2，4，8周的BBB評分進行比較。

1.6動物皮層體感誘發(fā)電位（CSEP）的測定

模型動物在術(shù)后1d及9周行CSEP檢查。每只動物均測雙下肢。

1.7斜板試驗

將厚度為1cm表面帶有溝槽的膠墊固定于一木板上，在術(shù)前及術(shù)后相應(yīng)時間點將大鼠置于測試斜板上，斜板一端位置固定，另一端由水平位，即0度角逐漸升高，直至大鼠在斜板上所處位置無法停留達到5s時，用電子角度尺測量斜板與地面之間的夾角，獲得該次斜板試驗的角度值。每只大鼠共進行三次斜板試驗，取平均值。

1.8統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以百分比表示，采用x²檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1脊髓組織標本形態(tài)觀察

假手術(shù)組脊髓組織形態(tài)正常，表面光滑，呈白色，橫截面呈橢圓形。單純損傷組及姜黃素干預組在脊髓夾傷后即刻便可見損傷部位一橫行血腫帶。損傷后1d脊髓組織標本可見夾傷部位有一暗紅色、寬約1mm的橫行出血帶，自損傷部位向上及向下2～3個脊髓節(jié)段可見脊髓實質(zhì)彌散性出血，呈紅褐色，但脊髓外觀大體形態(tài)基本正常。損傷后1周脊髓組織標本可見血腫大部分吸收，脊髓鉗夾部位可見一呈淡黃色的橫行損傷帶。自損傷后2周起脊髓背側(cè)因缺乏椎板骨質(zhì)，與周圍肌肉或軟組織粘連明顯，出血基本吸收完全，損傷部位開始出現(xiàn)較明顯的縮窄，隨時間推移上述情況逐漸加重，至8周時單純損傷組損傷節(jié)段縮窄明顯，損傷部位上下端脊髓連接疏松，在剝離脊髓過程中如操作不慎極易離斷，部分標本在強光下可見損傷部位脊髓實質(zhì)中有囊腔形成。endprint

2.2大鼠脊髓損傷后各時間點BBB評分

聯(lián)合移植組的1，2，4，8周的BBB評分皆明顯高于損傷組兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），兩組的BBB評分顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3三組動物的皮層體感誘發(fā)電位潛伏期比較

大鼠CSEP的波形為“W”形，所有大鼠在術(shù)前和正常組術(shù)后的潛伏期正常。4周后，聯(lián)合移植組出現(xiàn)“W”形，但是誘發(fā)電位潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示脊髓傳導速度明顯下降。見表2。

2.4三組大鼠脊髓損傷后各時間點斜板試驗角度值比較

自損傷后1周起，各時間點損傷組及聯(lián)合移植組大鼠行斜板試驗角度值均逐漸上升，聯(lián)合移植組所測得角度值均大于單純損傷組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

3討論

脊髓損傷是一種嚴重致殘性神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，傷后立即出現(xiàn)損傷水平以下運動、感覺和括約肌功能障礙。世界范圍總發(fā)生率為每年12.1～57.8/百萬人，交通意外及高處墜落為最常見致傷因素。至今尚無有效的治療措施。

脊髓損傷的病理生理過程經(jīng)歷了由機械外力引起的原發(fā)性損傷并觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng)導致繼發(fā)性損傷，細胞損害由最初的損傷部位向臨近區(qū)域及遠側(cè)的白質(zhì)及灰質(zhì)擴散。對繼發(fā)性損傷的研究提示眾多有害因素同時出現(xiàn)，包括缺血、自由基的產(chǎn)生、脂質(zhì)過氧化及有害的離子流等進一步加劇損傷程度。

由于脊髓損傷是突發(fā)機械性創(chuàng)傷導致的出血、組織壞死，原發(fā)損傷及繼發(fā)損傷多種相關(guān)的病理生理改變恰好與姜黃素的抗氧化、抗纖維化、抗炎、抗膠質(zhì)細胞等特性相契合。因此，我們將姜黃素作為干預措施，觀察其對預防和治療脊髓損傷的功效。

姜黃素（curcmnin）是姜科姜黃屬植物根莖的提取物，作為傳統(tǒng)中藥材，廣泛應(yīng)用于風濕病、發(fā)熱、腸道疾病、外傷、閉經(jīng)等，當代研究表明姜黃素對炎癥、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、代謝性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等多種疾病均有療效而無明顯毒副作用。近年來對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究顯示姜黃素具有明顯的神經(jīng)保護作用，并且姜黃素可刺激胚胎神經(jīng)前體細胞增殖，也可增強成年海馬的神經(jīng)發(fā)生。

本研究中，聯(lián)合移植組的1，2，4，8周的BBB評分皆明顯高于損傷組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而兩組的BBB評分顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。大鼠CSEP的波形為“W”形，所有大鼠在術(shù)前和正常組術(shù)后的潛伏期正常。4周后，聯(lián)合移植組出現(xiàn)“W”形，但是誘發(fā)電位潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。自損傷后1周起，各時間點損傷組及聯(lián)合移植組大鼠行斜板試驗角度值均逐漸上升，聯(lián)合移植組所測得角度值均大于單純損傷組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

綜上所述，聯(lián)合應(yīng)用姜黃素與神經(jīng)干細胞治療脊髓損傷，可以激活Wnt/p-catenin信號通路使脊髓損傷后部分內(nèi)源性神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，減輕膠質(zhì)瘢痕，從而改善大鼠后肢功能的恢復。endprint