王逾男　綜述　尹愛華　審校

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院，廣東 廣州　511442)

基于孕婦外周血漿游離胎兒DNA的地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷研究進展

王逾男綜述尹愛華*審校

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省婦兒醫(yī)院，廣東 廣州511442)

【摘要】地中海貧血是我國長江以南各省發(fā)病率最高、影響最大的單基因遺傳病，目前尚無有效的治療方法。在地貧高發(fā)地區(qū)有效開展婚前、孕前篩查以及對夫妻雙方攜帶同種地貧基因的孕婦進行產(chǎn)前診斷是預(yù)防重度患兒出生的首選方法。目前胎兒地貧基因檢測基于有創(chuàng)性手術(shù)獲得胎兒DNA進一步基因診斷，有一定的流產(chǎn)和宮內(nèi)感染的風(fēng)險。我們迫切需要找到安全、無創(chuàng)、準(zhǔn)確、簡便、早期診斷的方法，cffDNA的發(fā)現(xiàn)開啟了無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的新篇章，且基于二代測序平臺的NIPT技術(shù)無創(chuàng)產(chǎn)前診斷胎兒唐氏綜合征已廣泛應(yīng)用于臨床，其準(zhǔn)確性可達99%，這為地貧無創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究提供了新的思路。本文旨在綜述基于孕婦外周血漿胎兒游離DNA的地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)研究進展。

【關(guān)鍵詞】地中海貧血；無創(chuàng)產(chǎn)前診斷；游離胎兒DNA

地中海貧血(簡稱“地貧”)是一種因珠蛋白合成障礙所致的遺傳性溶血性疾病，分α地中海貧血 (簡稱“α地貧”)和β地中海貧血(簡稱“β地貧”)兩種。我國以南方地區(qū)多見，尤以廣東、廣西和海南為甚，是長江以南各省發(fā)病率最高、影響最大的單基因遺傳病[1]。目前地貧尚無有效的治療方法，重度α地貧兒一般在出生的24～48小時之內(nèi)死亡，重度β地貧兒和部分中間型α地貧兒在出生后3～6個月開始出現(xiàn)貧血癥狀并進行性加重，嚴(yán)重者必須依靠輸血和聯(lián)合鐵螯合劑的長期治療，但治療價格昂貴，而骨髓移植又需要嚴(yán)格的供體，因此目前并沒有理想的治療方法。故在地貧高發(fā)地區(qū)對夫妻雙方攜帶同種地貧基因的孕婦進行產(chǎn)前診斷是預(yù)防重度患兒出生的首選方法。目前胎兒地貧基因檢測基于有創(chuàng)性手術(shù)獲得胎兒DNA進一步基因診斷，有一定的流產(chǎn)和宮內(nèi)感染的風(fēng)險。我們迫切需要找到安全、無創(chuàng)、準(zhǔn)確、簡便、早期診斷的方法，cffDNA(cell free fetal DNA,cffDNA)的發(fā)現(xiàn)開啟了無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的新篇章，而基于二代測序平臺的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)(next-generation sequencing-based non-invasive prenatal testing，NIPT)診斷胎兒唐氏綜合征已廣泛應(yīng)用于臨床，其準(zhǔn)確性可達99%[2]。這些為地貧無創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究提供了新的思路。本文旨在綜述基于孕婦外周血漿胎兒游離DNA的地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)研究進展。

1cffDNA的發(fā)現(xiàn)與特點

1997年，Lo等[3]選用染色體上特定的SRY基因作為胎兒源性DNA的研究標(biāo)記物，首次用常規(guī)PCR在孕婦血漿中檢測到cffDNA的存在，為基于孕婦外周血漿中cffDNA的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷走向臨床開辟了道路。

與母親外周血中的胎兒細胞相比，cffDNA相對豐富，較胎兒細胞大約多出20倍[3]，于妊娠5周就能從母體血液中檢測到，妊娠11周即占母體血漿總DNA的0.39%，并隨孕周增長而增加，于妊娠晚期可達母體血漿總DNA的6.2%。而胎盤娩出后，胎兒DNA以16分鐘左右的半衰期從孕婦血漿中清除，產(chǎn)后2小時即可從母親外周血中完全消失。孕婦血漿DNA由孕婦自身DNA和cffDNA混合組成，其中孕婦自身的DNA占90%以上。cffDNA主要來源于滋養(yǎng)層細胞或胎盤細胞的凋亡，少量來源于胎兒血循環(huán)或胎兒細胞。約85%的胎兒DNA分子片段長度在100～300 bp之間，而大部分孕婦自身DNA分子片段長度大于1000 bp，這為利用分子片段大小分離法分離母血漿中胎兒DNA提供了可能性[4]。2010年，Lo團隊借助高通量測序技術(shù)完成了母血中胎兒的全部組基因組圖譜的繪制，證實了利用cffDNA進行胎兒基因檢測是完全可行的[5]?；谝陨咸攸c，cffDNA一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便成為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷最理想的靶標(biāo)物質(zhì)。

2基于孕婦外周血漿游離胎兒DNA的無創(chuàng)產(chǎn)前檢查應(yīng)用研究

cffDNA最先應(yīng)用是檢測cffDNA中的性別決定基因以排除X連鎖遺傳病和Rhesus D基因為Rh陰性妊娠婦女的胎兒處置提供診斷依據(jù)，其檢測準(zhǔn)確性均可達99%。另外還有胎兒染色體21、18、13-三體、染色體微重復(fù)微缺失綜合征、父源關(guān)系鑒定等檢測，而雙胎合子類型鑒別[6]、囊性纖維化、軟骨發(fā)育不良、亨廷頓式舞蹈病、地中海貧血等單基因遺傳病的產(chǎn)前診斷也迅速成為研究熱點。

2.1染色體非整倍體的檢測2008年第二代測序技術(shù)(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)首次應(yīng)用于胎兒非整倍體產(chǎn)前基因檢測的研究[7]，此后多個團隊研究表明，NGS可分辨孕有唐氏綜合征患兒的母血中21-三體的總量與孕有正常核型胎兒母血中21-三體的總量的微小差異[8]，以Z值為3作為截斷值，可獲得特異性100%，敏感性99%的檢測結(jié)果[9]。經(jīng)過相同方法以及標(biāo)準(zhǔn)化Z值分析后，18-三體檢測敏感性提高至91.9%、13-三體檢測敏感性100%，特異性98%[9]。目前該方法已廣泛應(yīng)用于臨床。本中心從2012年開始研究基于半導(dǎo)體測序平臺的胎兒21、18、13-三體的產(chǎn)前基因篩查方法[10]，檢測了1760例高風(fēng)險孕婦，發(fā)現(xiàn)9例21-三體，3例18-三體、3例13單體，以及1例XO綜合征胎兒，經(jīng)核型分析驗證準(zhǔn)確率達99%，2015年獲得國家衛(wèi)計委批準(zhǔn)的開展高通量基因測序產(chǎn)前篩查和臨床應(yīng)用試點單位，至今已完成數(shù)千例無創(chuàng)21、18、13-三體產(chǎn)前基因篩查，準(zhǔn)確率達99%。

2.2染色體微重復(fù)微缺失綜合征的檢測2011年新英格蘭雜志報道了1例通過測序檢測胎兒12號染色體上4.2M的缺失案例[11]，首次報道了cffDNA在微缺失綜合征中的應(yīng)用研究，此后也有多為學(xué)者針對染色體微小結(jié)構(gòu)異常的研究。2012年Jensen等[12]利用2例已經(jīng)確診胎兒為22q11.2綜合征孕婦的外周血，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)患者在22q11.2區(qū)域的cffDNA片段含量少于正常孕婦。Srinivasan等[13]隨后選取11位胎兒異常核型的孕婦，測序結(jié)果提示可檢測出所有的21-三體綜合征以及微重復(fù)微缺失，不適用嵌合體檢測，易位樣本可通過斷裂點附近的小片段缺失判斷斷裂位置，無法提示平衡易位。通過提高測序深度，發(fā)現(xiàn)了諸多染色體核型分析不能分辨的微小病變。本中心從2013年也開始研究無創(chuàng)染色體結(jié)構(gòu)異常的檢測，利用母胎游離DNA片段比例建立了估算孕婦游離DNA中胎兒的比例的方法，為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了質(zhì)控。并已完成1476例無創(chuàng)染色體結(jié)構(gòu)異常樣本的檢測，在測序量為3M reads時，對于大于5M的異常，靈敏度為98.3%，特異度為98.1%。

2.3妊娠相關(guān)疾病母血漿中cffDNA的增加還可作為多種妊娠相關(guān)疾病的臨床診斷指標(biāo)，許多研究定量檢測母血中cffDNA的含量，發(fā)現(xiàn)在子癇前期、胎盤源性胎兒生長發(fā)育受限、胎盤植入、早產(chǎn)、以及妊娠肝內(nèi)膽汁淤積綜合征的孕婦中，母血中cffDNA的含量異常增高[14]，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，因此cffDNA可作為諸多病理妊娠的診斷指標(biāo)并可用于動態(tài)監(jiān)測疾病發(fā)展變化。但由于其含量個體差異較大，尚不能確定一個最優(yōu)閾值來指導(dǎo)臨床。

2.4單基因病的檢測單基因遺傳病是由一對等位基因控制的遺傳性疾病，它的遺傳方式遵循孟德爾分離定律。位于不同染色體上的致病基因，其遺傳方式也不同，可分為常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病、伴X染色體顯性遺傳病、伴X染色體隱性遺傳病、伴Y染色體遺傳病5種。目前，利用cffDNA檢測胎兒單基因疾病的研究主要集中在常染色體遺傳疾病以及X-連鎖疾病的診斷中，研究疾病包括軟骨發(fā)育不良[15]、多發(fā)性內(nèi)分泌瘤2A型[16]、阿佩爾綜合征[17]、強直性肌營養(yǎng)不良[18]、亨廷頓舞蹈癥[19]等共14種，其中，地中海貧血的研究最為熱烈，其他疾病由于人群發(fā)病率較低，僅有少量小樣本的研究報道。

3地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的研究進展

3.1地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷應(yīng)用概述地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究至今大致分為3個階段：第一階段檢測父源性致病位點，適用于檢測父母雙方攜帶不同的地貧致病位點時此方法僅能通過陰性結(jié)果排除胎兒致病純合子的可能。針對不同疾病，突變位點可能為點突變，也可能是幾個堿基的缺失和重復(fù)，各研究者根據(jù)突變類型不同選擇不同的擴增方法以及分析方法進行研究。第二階段檢測父源性遺傳序列中雜合度高的STR位點或SNP位點，此方法改進了單純檢測父源性致病基因的方法，擴大了檢測范圍，即夫妻雙方擁有相同的突變位點，也可通過可提供信息的SNP位點排除胎兒的純合突變，陰性的結(jié)果可避免進一步的檢測，亦因無需分離cffDNA，減低了技術(shù)難度。但此方法仍局限于檢測來自父親的基因突變位點，且需建立與各突變連鎖的有診斷價值的SNP數(shù)據(jù)庫，限制了其發(fā)展。第三階段的檢測借助數(shù)字PCR，高通量測序技術(shù)等結(jié)合單倍型的相對定量診斷策略，此方法采用二代測序技術(shù)對目標(biāo)區(qū)域進行捕獲或者數(shù)字PCR技術(shù)針對含突變位點區(qū)域分別進行正常和突變等位基因的短片段擴增，對母血漿總的游離DNA中的含SNP位點的序列進行定量檢測，分析目標(biāo)區(qū)域中的一組由SNP構(gòu)成的單倍體劑量，確定雙親單倍體型及cffDNA的單倍體信息，從而推斷胎兒的基因型。

3.2α地貧無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的應(yīng)用從2002年開始國內(nèi)外研究者就開始了無創(chuàng)地貧的探索，迄今為止國內(nèi)外共有10篇文獻進行了相關(guān)研究。其研究方向有：①排除性診斷：因雙親攜帶相同類型致病基因，無法通過檢測父源性致病位點來排除父源性遺傳，借助檢測父源性致病基因連鎖的與母體不同的STR及SNP位點可達到排除診斷目的。此方法需要在檢測前篩選父母雙方STR/SNP位點，若夫婦雙方候選位點相同，則不能通過這種方法檢測。Ho等[20]2006年發(fā)表了利用SEA斷裂范圍內(nèi)兩個STR位點排除父源性水腫胎的文章，可排除1/3水腫胎患兒；Yan等[21]于2011年利用SEA缺失范圍內(nèi)9個SNPs排除父源性水腫胎，診斷率49.3%。②確定性診斷：通過檢測缺失后重新拼接的片段，或選擇斷裂范圍內(nèi)的marker，定量檢測拷貝數(shù)。Chen[22]、Tungwiwat[23]、Pornprasert[24, 25]優(yōu)化了gap-PCR方法，將PCR引物設(shè)置于SEA缺失斷裂點兩端，半巢氏PCR擴增，探針或染料熒光定量，發(fā)現(xiàn)孕有重度α地貧兒的孕母外周血中擴增拷貝數(shù)高于孕有其他基因型胎兒的孕婦，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義。 Long等[26]選擇α1和α2基因之間、無其他同源性的一段基因作為目的基因．共管擴增α珠蛋白鏈上部分基因，毛細管電泳分析胎兒兩種產(chǎn)物峰面積來檢測Bart’s水腫胎，cffDNA富集依靠瓊脂糖凝膠電泳回收，39例水腫胎中檢出30例。Chen[27]、Pornprasert和Srichotiyakul[28]等針對野生型以及SEA缺失片段設(shè)計兩對引物，分別用多重PCR、雙等位基因特異性PCR、QF-PCR擴增，應(yīng)用毛細管電泳或定量ROC曲線分析不同胎兒基因型孕母外周血中兩種產(chǎn)物的比例，統(tǒng)計推算重度地貧兒△CT值；在Pornprasert試驗中，他們僅從7例水腫胎的樣本中檢測出3例；Sirichotiyakul則可區(qū)分79.2%的重度地貧兒與非重度地貧兒。Ge等[29]應(yīng)用探針捕獲SEA缺失范圍內(nèi)SNPs位點，借助二代測序，選擇父母雙方純合的SNP位點為靶位點，利用拷貝數(shù)變異，排除水腫胎，但是因為此方法對胎兒濃度要求較高，仍需要進一步研究。

綜上所述，缺失型α地中海貧血的無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷技術(shù)較為單一，分為排除性診斷與確定性診斷兩種，排除性診斷需篩選與確定一組人群特異性標(biāo)簽SNP/STR位點，應(yīng)用時將標(biāo)簽SNP/STR在夫妻間進行分析，檢測兩者間不同的靶點，此方法費時費力，且不具有普適性，難以走向臨床。確定性診斷無論是通過Gap-PCR檢測缺失后重新拼接的片段，或選擇斷裂范圍內(nèi)的marker，定量檢測拷貝數(shù)，均對胎兒DNA濃度要求較高，且方法均不穩(wěn)定，檢出率都較低，亦難以達到臨床檢測的標(biāo)準(zhǔn)。

3.3β地貧無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的應(yīng)用自2002年以來，國內(nèi)外已有多篇文獻對無創(chuàng)產(chǎn)前檢測β地貧進行了多種方法學(xué)的探討，包括數(shù)字PCR，單個位點堿基延伸反應(yīng)，位點特異性實時PCR，以及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF)等。

與α地貧類似，排除性診斷方法研究者們將研究重心聚焦于檢測父親致病性SNP/STR上，Papasavva等[30]選用β珠蛋白基因中4個塞浦路斯人高度雜合的11個SNP位點，并結(jié)合單體型分析的方法，成功地對10個家系中8個樣本進行了父源遺傳分析。Li等[31]則利用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)，達到了100%的敏感度和92.1%的特異度，但該方法僅用于東南亞人群中最常見的5種父源突變，也未對母親來源的致病位點進行分析。此類研究受引物中SNP位置及數(shù)量影響較大，需要建立有效地突變連鎖有診斷價值的SNPs數(shù)據(jù)庫，而且沒有從數(shù)據(jù)中獲得母親的遺傳給胎兒的位點信息。故排除性診斷的臨床應(yīng)用受到了限制。

二代測序技術(shù)的發(fā)展，極大地促進了基于cffDNA進行的分子檢測的靈敏度。Lo團隊[32]對β地貧家系進行全基因組水平的高通量測序，通過孕婦外周血血漿DNA獲得了胎兒和孕婦的全基因組圖譜，并成功地檢出1例β地貧攜帶者。該研究通過父親中的SNP位點推導(dǎo)父源胎兒基因組，利用父親純合但母親雜合的SNP位點推導(dǎo)母源胎兒基因組，然后用RHDO(relative haplotype dosage，RHDO)分析法對孕婦血漿中單體型的相對含量進行計算。RHDO的基本原理為，母本染色體成對存在，來自母本父親的DNA與來自母本母親的DNA比例為1∶1，因胎兒會釋放一些母本DNA進入到母親血漿中，導(dǎo)致1∶1失衡。通過此原理經(jīng)過統(tǒng)計算法，得到胎兒從母本遺傳的基因組。此方法存在測序成本高昂，操作復(fù)雜，耗時較長，RHDO分析方法復(fù)雜等問題，從而限制了其在臨床中的應(yīng)用。后續(xù)的研究使用目標(biāo)區(qū)域捕獲方法對特定區(qū)域進行檢測。Lam等報道液相雜交方法進行目標(biāo)區(qū)域的捕獲測序，研究中對不同單基因的多個基因組區(qū)域同時進行分析，捕獲覆蓋度達200次以上，以檢測HBB基因簇上數(shù)千個SNPs，然后用目標(biāo)區(qū)域同樣使用RHDO方法進行分析。此方法的局限性在于人工定制捕獲探針，實驗周期長，及捕獲效率低以及RHDO不是直接對突變位點進行檢測，不同種的疾病，需要在待測基因上下游選擇足夠多的有效SNP及多個家系特異性SNP，且針對SNP信息不足的區(qū)域檢測效果不佳等問題。

綜上所述，當(dāng)父母攜帶不同的β地貧致病位點時，排除性診斷是有診斷價值的；當(dāng)父母攜帶β地貧致病位點相同時，排除性診斷需要通過尋找父母不一致的SNP位點來解決，此類研究受引物中SNP位置及數(shù)量影響較大。目前主流的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測方法均基于父母及胎兒單體型。其存在的問題包括：對胎兒及父母進行全基因組SNP分析，成本昂貴；數(shù)字PCR的單體型鑒定，操作復(fù)雜煩瑣，實驗的成功受GC含量和分析區(qū)域的SNP分布影響；且RHDO不是直接對突變位點進行檢測，不同種的疾病，需要在待測基因上下游選擇足夠多的有效SNP及多個家系特異性SNP；由于cfDNA含量較低而導(dǎo)致擴增效率低，且無法解決特異性擴增帶來的偏差；需要人工定制捕獲探針，導(dǎo)致實驗周期長。故迄今，β地貧的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷還無法走向臨床。

4地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的展望

地貧無創(chuàng)產(chǎn)前診斷是產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用研究領(lǐng)域的重要發(fā)展方向，可對胎兒進行早期的無創(chuàng)檢測。迄今為止，由于全基因組SNP分析成本昂貴，數(shù)字PCR的單體型鑒定操作復(fù)雜煩瑣，捕獲探針效率低且人工定制導(dǎo)致實驗周期長，cfDNA含量較低而導(dǎo)致擴增效率低，且無法解決特異性擴增帶來的偏差等原因地貧無創(chuàng)產(chǎn)前診斷還無法走向臨床。而針對無創(chuàng)單基因病循環(huán)單分子擴增和重測序技術(shù)[33]的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測方法的發(fā)現(xiàn)，大大提高cffDNA在擴增中的利用率，同時引入了barcode序列，消除了因擴增特異性帶來的不同序列比例的影響，理論上有望應(yīng)用于地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前檢測。我們寄希望于更多方法學(xué)的探索與發(fā)展，推動地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)早日走向臨床。

參 考 文 獻

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編輯：宋文穎

DOI:10.13470/j.cnki.cjpd.2016.03.012

*通訊作者：尹愛華，E-mail：yinaiwa@vip.126.com

【中圖分類號】R714.55

【文獻標(biāo)識碼】A

(收稿日期：2015-09-15)