胡春梅 郭晶 嚴(yán)虹 施旭東 張俠

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·論著·

熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法在結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)中的應(yīng)用

胡春梅 郭晶 嚴(yán)虹 施旭東 張俠

目的 應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法檢測(cè)耐多藥結(jié)核病患者的臨床分離菌株對(duì)一線(xiàn)抗結(jié)核藥物的耐藥基因突變。方法 于2009年1月1日至2012年12月31日留取南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科門(mén)診部或住院的所有肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本，每人3～5 ml，均進(jìn)行痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)，分離出結(jié)核分枝桿菌菌株67株。應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法，根據(jù)靶序列熔點(diǎn)變化，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)核病患者的臨床分離標(biāo)本對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥情況；通過(guò)與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)2種結(jié)果不一致的菌株進(jìn)行基因測(cè)序分析，探討其發(fā)生突變的位點(diǎn)差異，并觀察在治療中的變化。結(jié)果 利福平和異煙肼的表型和基因型檢測(cè)具有較高的一致性，分別為99%(66/67)和97%(65/67)，不一致的菌株都是表型檢測(cè)法為耐藥，而基因型檢測(cè)為敏感，測(cè)序未檢測(cè)到突變。乙胺丁醇和鏈霉素的表型和基因型檢測(cè)一致性較低，分別為60%(40/67)和75%(50/67)。測(cè)序發(fā)現(xiàn)，乙胺丁醇的突變發(fā)生在embB306和embB406位點(diǎn)上；鏈霉素突變發(fā)生在rrs基因517位點(diǎn)和907位點(diǎn)，以及rpsL43耐藥密碼子。結(jié)論 應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法，能快速篩查結(jié)核分枝桿菌對(duì)一線(xiàn)抗結(jié)核藥物的耐藥情況。

探針熔解曲線(xiàn)法； 結(jié)核，肺； 抗藥性，多種，細(xì)菌； 耐藥基因； 突變

耐多藥結(jié)核病是結(jié)核病治療中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，開(kāi)展結(jié)核分枝桿菌耐藥性的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，是結(jié)核病控制工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容，也是制訂抗結(jié)核化療方案的重要依據(jù)。筆者曾對(duì)耐多藥肺結(jié)核患者在治療中的不同時(shí)間點(diǎn)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)有獲得耐藥性及恢復(fù)敏感性的現(xiàn)象發(fā)生，其中異煙肼和利福平表現(xiàn)為高度耐藥性且穩(wěn)定，乙胺丁醇和左氧氟沙星表現(xiàn)為高獲得性耐藥[1-2]。結(jié)核分枝桿菌痰培養(yǎng)和藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)，是目前檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，很難達(dá)到快速檢測(cè)的要求，具有一定局限性[3]?；蛐湍退帣z測(cè)，通過(guò)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特定基因組區(qū)域的突變來(lái)預(yù)測(cè)耐藥，因其耗時(shí)短，能較快地指導(dǎo)臨床用藥，逐漸成為結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測(cè)的趨勢(shì)[4]。但有文獻(xiàn)報(bào)道，在臨床應(yīng)用中基因型耐藥檢測(cè)與表型耐藥檢測(cè)存在不一致[5-6]。因此，本研究設(shè)想應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法檢測(cè)耐多藥結(jié)核病患者的臨床分離菌株對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥基因突變，并與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)法進(jìn)行對(duì)比，衡量基因型檢測(cè)的一致性；對(duì)不一致性的菌株進(jìn)行基因測(cè)序，探尋是否有新的突變位點(diǎn)，觀察耐多藥肺結(jié)核患者的耐多藥菌株在抗結(jié)核治療過(guò)程中，對(duì)一線(xiàn)抗結(jié)核藥物表型和基因型耐藥性的動(dòng)態(tài)變化，為耐多藥肺結(jié)核治療方案的調(diào)整提供參考。

材料和方法

一、菌株來(lái)源

于2009年1月1日至2012年12月31日，留取南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科門(mén)診部或住院的所有肺結(jié)核患者的痰液標(biāo)本3～5 ml，均進(jìn)行痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn)。

野生型菌株為國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供的結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株。

二、 方法

1.痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)：按WHO和全國(guó)結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證要求[8-11]，進(jìn)行痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定，證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌。用絕對(duì)濃度法[9]進(jìn)行4種一線(xiàn)抗結(jié)核藥物耐藥性的檢測(cè)。各藥物均設(shè)高低2個(gè)濃度，試驗(yàn)濃度分別為：Sm(10，100) μg/ml，INH(1，10) μg/ml，EMB (5，50) μg/ml，RFP(25，250) μg/ml。以對(duì)照管生長(zhǎng)，含藥高、低濃度管均不生長(zhǎng)為敏感；含藥低濃度管生長(zhǎng)、高濃度管不生長(zhǎng)為中度耐藥；含藥高、低濃度管均生長(zhǎng)為高度耐藥。本研究所指的耐藥包括中度耐藥和高度耐藥。其中用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行常規(guī)質(zhì)量控制，同時(shí)運(yùn)用比例法與絕對(duì)濃度法進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，以此對(duì)絕對(duì)濃度法進(jìn)行質(zhì)量控制。

2.耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)一線(xiàn)抗結(jié)核藥物耐藥相關(guān)基因突變的檢測(cè)：對(duì)67株待檢測(cè)的耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行復(fù)活、接種、滅活，采用煮沸法提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA(經(jīng)紫外定量，要求結(jié)核分枝桿菌含量不低于103拷貝/μl)進(jìn)行加樣。同時(shí)設(shè)立陰性(無(wú)菌雙蒸水)和陽(yáng)性對(duì)照品(H37Rv菌株)DNA各5 μl，用CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)，伯樂(lè)公司)進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法(耐藥突變檢測(cè)試劑盒，廈門(mén)致善生物科技有限公司)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌菌株對(duì)利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的突變，進(jìn)行耐藥篩選，用于獲得結(jié)核分枝桿菌對(duì)4種藥的耐藥信息。其中，利福平檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群rpoB基因507～533共27個(gè)氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)(81 bp，利福平耐藥決定區(qū))的突變。異煙肼檢測(cè)ahpC啟動(dòng)子區(qū)(-44～-30以及 -15～3位點(diǎn))、inhA94密碼子、inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17～-8位點(diǎn))及katG315密碼子的突變，具體可檢測(cè)的耐藥突變位點(diǎn)包括ahpC啟動(dòng)子 -44A、-42C、-39T、-34C、-32A、-30T、-15T、-12T、-10A、-10G、-10T、-9A、-6A、-4G，ahpC4T，inhA94GCG，inhA啟動(dòng)子 -17T、-16G、-15T、-11T、-8A、-8C，katG315AGG、katG315CGC、katG315CTC、katG315ACC、katG315AAC、katG315ATC、katG315ACA。乙胺丁醇檢測(cè)embB306、embB497、embB368、embB378、embB380和embB406位密碼子是否突變。鏈霉素檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌rpsL基因43位密碼子和88位密碼子，以及rrs基因513～517位點(diǎn)和905～908位點(diǎn)的突變。

采用梯度稀釋的野生型標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv DNA考察探針熔解曲線(xiàn)分析法的分析敏感度，然后用標(biāo)準(zhǔn)盤(pán)驗(yàn)證其檢測(cè)特異度。對(duì)熔解曲線(xiàn)法與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本進(jìn)行測(cè)序。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本試驗(yàn)用Chromas 2軟件分析測(cè)序結(jié)果，用Clustalx軟件比對(duì)是否突變，將整理后的突變數(shù)據(jù)和耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株藥敏試驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同一菌株的突變數(shù)據(jù)和耐藥數(shù)據(jù)相互對(duì)應(yīng)。

結(jié) 果

一、菌株的提取

參照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)[7]《耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南》，制定抗結(jié)核治療方案為6 Am(Cm)、Lfx(Mfx)-Pto(E)-Pa-Z/18Lfx(Mfx)-Pto(E)-Pa-Z，治療共24個(gè)月，每3個(gè)月進(jìn)行1次痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)治療期間痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性2次以上(包括治療前)的耐多藥肺結(jié)核患者，共14例。其中男7例，女7例，年齡(35.0±9.0)歲，共獲得結(jié)核分枝桿菌菌株67株，-70 ℃冷凍保存在南京市胸科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室菌株庫(kù)，進(jìn)行治療前后4種常用抗結(jié)核藥物表型和基因型耐藥檢測(cè)的對(duì)比分析。

二、耐藥表型及基因型檢測(cè)的一致性

結(jié)核分枝桿菌菌株對(duì)4種抗結(jié)核藥物耐藥的表型及基因型檢測(cè)的一致性分別為：利福平99%(66/67)、異煙肼97%(65/67)、乙胺丁醇60%(40/67)、鏈霉素75%(50/67)。

三、耐藥表型及基因型檢測(cè)不一致的菌株分析

用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平、異煙肼耐藥，與藥敏試驗(yàn)法結(jié)果不一致的菌株分別僅為1株、2株，都是表型檢測(cè)法為耐藥，而基因型檢測(cè)為敏感。對(duì)不一致菌株進(jìn)行了測(cè)序，未檢測(cè)到突變。對(duì)乙胺丁醇耐藥檢測(cè)，2種方法不一致的菌株為27株，其中乙胺丁醇表型檢測(cè)法為耐藥，而基因型檢測(cè)為敏感有14株，對(duì)14株測(cè)序，相應(yīng)檢測(cè)位點(diǎn)峰型為單峰，未檢測(cè)到突變。對(duì)乙胺丁醇表型檢測(cè)敏感但基因型檢測(cè)耐藥的有13株，有10株樣本的突變發(fā)生在embB306位點(diǎn)上，其中有7株出現(xiàn)ATG→GTG突變，1株為ATG→CTG突變，1株為ATG→ATT突變，1株為ATG→ATA突變；有3株樣本的突變發(fā)生在embB406位點(diǎn)上，出現(xiàn)GGC→GCC突變。對(duì)鏈霉素耐藥檢測(cè)，2種方法不一致的菌株有17株菌株。其中6株表型檢測(cè)法結(jié)果為耐藥，而基因型檢測(cè)法結(jié)果為敏感，測(cè)序未檢測(cè)到突變；而11株表型檢測(cè)法為敏感，而基因型檢測(cè)法結(jié)果為耐藥，對(duì)其測(cè)序發(fā)現(xiàn)，有9株發(fā)生rrs基因517位點(diǎn)的C→T突變，1株發(fā)生rrs基因907位點(diǎn)的A→T突變，1株發(fā)生rpsL43耐藥密碼子的AAG→AGG突變。

四、菌株耐藥的動(dòng)態(tài)變化

14例耐多藥結(jié)核病患者的67株菌株對(duì)利福平、異煙肼表型耐藥穩(wěn)定，沒(méi)有動(dòng)態(tài)改變，呈持續(xù)耐藥；基因型耐藥檢測(cè)顯示也相對(duì)穩(wěn)定，僅有1例患者的結(jié)核分枝桿菌菌株發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，該例患者的結(jié)核分枝桿菌菌株在治療前基因型檢測(cè)是耐藥，而治療后基因型檢測(cè)是1株對(duì)利福平、2株對(duì)異煙肼敏感但無(wú)突變。然而對(duì)乙胺丁醇、鏈霉素的表型和基因型耐藥檢測(cè)提示均不穩(wěn)定，其耐藥性可能會(huì)發(fā)生改變。其中乙胺丁醇表型檢測(cè)顯示：1例患者出現(xiàn)復(fù)敏，1例出現(xiàn)繼發(fā)耐藥，1例出現(xiàn)復(fù)敏后再次繼發(fā)耐藥；基因型檢測(cè)有1例發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，從耐藥基因有突變到無(wú)突變又再次突變。鏈霉素的表型耐藥檢測(cè)2例出現(xiàn)繼發(fā)耐藥，1例出現(xiàn)復(fù)敏；基因型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有3例發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，其中2例耐藥基因從無(wú)突變到突變。

五、菌株發(fā)生耐藥動(dòng)態(tài)變化的臨床病例分析

在治療過(guò)程中，14例耐多藥結(jié)核病患者的耐藥基因發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，主要集中在3例患者的38株。臨床共同特點(diǎn)是：復(fù)治多年、肺部病灶廣泛(病灶范圍≥3個(gè)肺葉)、伴有1個(gè)以上空洞或肺葉毀損。臨床治療方案是：對(duì)氨基水楊酸異煙肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、左氧氟沙星或莫西沙星、阿米卡星靜脈滴注6個(gè)月。

討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)造成結(jié)核分枝桿菌耐藥的分子機(jī)制與基因突變有關(guān)。不同的基因突變使感染人體的結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生不同的藥物耐受性。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)將擴(kuò)增和檢測(cè)兩步驟合一，具有實(shí)時(shí)擴(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)、高效、快捷、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，可以同時(shí)對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥多個(gè)相關(guān)基因突變同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，特別適用于大批量篩查[12-15]。

因此，筆者應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法，根據(jù)靶序列熔點(diǎn)變化，實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因組中的耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)變化，以分析耐藥情況。對(duì)67株耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行4種一線(xiàn)抗結(jié)核藥物耐藥基因型檢測(cè)，和傳統(tǒng)的表型檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)相比較，結(jié)果表明利福平和異煙肼的表型和基因型檢測(cè)具有較高的一致性，分別達(dá)99%和97%，而乙胺丁醇和鏈霉素的表型和基因型檢測(cè)一致性相對(duì)偏低。對(duì)2種檢測(cè)方法不一致的菌株進(jìn)行乙胺丁醇和鏈霉素的基因測(cè)序，進(jìn)一步探索其他基因或基因區(qū)引起的突變，發(fā)現(xiàn)對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果為耐藥但用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法結(jié)果為敏感的菌株進(jìn)行基因測(cè)序，未檢測(cè)到基因突變；對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果為敏感但用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法結(jié)果為耐藥的菌株進(jìn)行基因測(cè)序，乙胺丁醇存在embB306、406基因位點(diǎn)突變，鏈霉素存在rrs基因517、907位點(diǎn)和rpsL43耐藥密碼子的點(diǎn)突變，這些突變位點(diǎn)均是既往已經(jīng)報(bào)道過(guò)的[16-17]，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的基因突變位點(diǎn)。

分析2種檢測(cè)方法不一致的原因可能如下：(1)耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株對(duì)乙胺丁醇和鏈霉素的表型耐藥動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)：存在不穩(wěn)定性，可能會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化[1-2]。(2)表型檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果雖然是當(dāng)前檢測(cè)耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在局限性；(3)本試驗(yàn)的耐藥突變檢測(cè)，只篩選核酸序列而不是氨基酸序列。因此，有可能不引起氨基酸改變的突變(沉默突變)也會(huì)被判為突變型。(4)如檢測(cè)樣品出現(xiàn)不均一耐藥菌株，耐藥菌株的比例偏低，需要結(jié)合熔解曲線(xiàn)峰型具體判斷突變比例，有可能出現(xiàn)假陰性，而判定為敏感無(wú)突變。(5)可能是與新的耐藥機(jī)制有關(guān)，如已知耐藥基因以外的其他基因突變和外排泵機(jī)制等，也可能存在異質(zhì)性耐藥或外源性再感染、混合感染以及藥敏試驗(yàn)結(jié)果誤差等[5-6,18]，仍需要擴(kuò)大基因庫(kù)及進(jìn)一步研究。

另外，對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株在治療過(guò)程中對(duì)4種抗結(jié)核藥物的耐藥性的動(dòng)態(tài)變化分析發(fā)現(xiàn)，不管用表型還是基因型檢測(cè)，利福平和異煙肼的耐藥性都很少發(fā)生改變；但是乙胺丁醇和鏈霉素均顯示相對(duì)不穩(wěn)定，說(shuō)明在治療過(guò)程中對(duì)乙胺丁醇和鏈霉素的耐藥性可能會(huì)發(fā)生改變。因此，在臨床治療過(guò)程中，筆者建議要對(duì)乙胺丁醇和鏈霉素進(jìn)行動(dòng)態(tài)的耐藥檢測(cè)，以便及時(shí)調(diào)整治療方案。

總之，本研究用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法，實(shí)時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌基因組中的耐一線(xiàn)抗結(jié)核藥相關(guān)突變位點(diǎn)變化，以判斷是否耐藥；并和傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌菌株對(duì)利福平、異煙肼的基因檢測(cè)與藥敏試驗(yàn)結(jié)果、測(cè)序結(jié)果具有較高的一致性。對(duì)不一致的菌株再次進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法檢測(cè)為敏感的菌株未檢測(cè)到基因突變；而用熒光定量PCR探針熔解曲線(xiàn)法檢測(cè)為耐藥的菌株確實(shí)存在基因位點(diǎn)突變，但突變位點(diǎn)均是已經(jīng)報(bào)道過(guò)的，在待檢的菌株中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)新的基因突變位點(diǎn)。耐藥基因檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于快速了解耐藥基因位點(diǎn)突變，篩查耐多藥肺結(jié)核，并在治療中進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，及時(shí)了解患者耐藥信息和突變位點(diǎn)的變化，精確尋找到耐藥的原因并指導(dǎo)調(diào)整有效的治療方案，為精準(zhǔn)個(gè)體化醫(yī)療奠定基礎(chǔ)，有利于結(jié)核病的控制和阻斷耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播，具有較大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，值得臨床推廣。然而，本研究只檢測(cè)了67份藥敏試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)的耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株標(biāo)本，樣本量偏少，且沒(méi)有檢測(cè)敏感結(jié)核分枝桿菌菌株、明確有無(wú)外源性再感染、混合感染或異質(zhì)性耐藥等，還存在一定局限性。

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(本文編輯：王然 李敬文)

Fluorescence quantitative PCR probe melting curve method in detection of drug resistance genes in

MycobacteriumtuberculosisHUChun-mei,GUOJing,YANHong,SHIXu-dong,ZHANGXia.

DepartmentofTuberculosis,NanjingChestHospital,Jiangsu，Nanjing210029，China

s:ZHANGXia,Email:zhangxia365@sina.com

Objective By fluorescence quantitative PCR probe melting curve method, to detect the resistance mutations of multidrug-resistant tuberculosis clinical isolates to first-line anti-tuberculosis drug, and to provide re-ference for multidrug-resistant tuberculosis treatment. Methods Collecting sputum of all TB patients visiting Nanjing chest hospital between January 1, 2009 and December 31, 2012, 3-5 ml per person, did culture and identification ofMycobacteriumtuberculosisand drug sensitivity test. Sixty seven strains ofMycobacteriumtuberculosiswere isolated. According to the target sequence changes in melting point, to test Rifampicin, Isoniazid, Ethambutol, and Streptomycin resistance by fluorescence quantitative PCR probe melting curve method. By comparison with the conventional susceptibility testing, to analyze the inconsistency of strain genome sequencing of 2 kinds of methods and explore the site differences in mutation, and observe the changes in treatment. Results The phenotypic and genotypic characteristics of the strains resisting to Rifampicin and Isoniazid had a high consistency, which was 99% (66/67) and 97% (65/67), respectively. Testing different strains were phenotypic resistance but genotypic sensitive, which was not detected by sequencing mutation. However, the consistency between the phenotype and genotype of anti-ethambutol and streptomycin strains was 60% (40/67) and 75% (50/67), respectively. Sequencing found Ethambutol mutation occurred in theembB306 andembB406 sites. Streptomycin gene mutations occurred inrrs517,rrs907 andrpsL43. Conclusion The application of the fluorescence quantitative PCR probe melting curve can rapidly screenMycobacteriumtuberculosisdrug resistance to first-line anti-tuberculosis drugs.

Probe melting curve method； Tuberculosis, pulmonary; Drug resistance, multiple, bacterial; Genetic mutations; Genotype analysis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.01.009

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(ZKX12035)

210029 江蘇省南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科(胡春梅、郭晶、張俠)，檢驗(yàn)科(嚴(yán)虹、施旭東)

張俠，Email：zhangxia365@sina.com

2015-06-15)