崔雨婷,張睿,陳正禮*,羅啟慧,祝春梅,孫鳳嬌,陳夢(mèng)鹿(.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型研究室,成都60;.成都大學(xué)新藥評(píng)價(jià)研究所,成都6005;.四川普萊美生物科技集團(tuán)有限公司,四川雅安6504)

大鼠自發(fā)性乳腺腫瘤中Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)

崔雨婷1,張睿1,陳正禮1*,羅啟慧1,祝春梅2,孫鳳嬌3,陳夢(mèng)鹿1
(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型研究室,成都611130;2.成都大學(xué)新藥評(píng)價(jià)研究所,成都610051;3.四川普萊美生物科技集團(tuán)有限公司,四川雅安625014)

摘要通過130只(雌雄對(duì)半)Sprague-Dawley(SD)大鼠進(jìn)行自發(fā)性乳腺腫瘤造模,并研究自發(fā)產(chǎn)生的乳腺腫瘤組織的病理變化及B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukmia-2,Bcl-2)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(B cell lymphoma/leukmia-2 associated X protein,Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)在乳腺腫瘤中的蛋白和mRNA表達(dá)變化.造模結(jié)果顯示共有14只雌性大鼠發(fā)生乳腺腫瘤,對(duì)總體而言腫瘤的發(fā)病率為10.77%(14/130);由于雄性大鼠未見乳腺腫瘤,在雌性大鼠中腫瘤的發(fā)病率為21.54% (14/65).蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色病理切片觀察確定腫瘤分型分別為乳腺纖維腺瘤7例,乳腺腺癌3 例,乳腺乳頭狀癌2例,乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌2例.免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)結(jié)果顯示,對(duì)照組(n=5) Bax、Bcl-2和Caspase-3的蛋白表達(dá)量分別為9.75±0.04、8.13±0.35和6.60±0.04,而這3個(gè)因子在良性病變組(n=7)的蛋白表達(dá)量分別為8.16±0.16、9.14±0.22和4.43±0.1.另外,其在惡性病變組(n=7)的蛋白表達(dá)量分別為6.49±0.32、9.24±0.81和3.03±0.10,與對(duì)照組相比,Bax和Caspase-3在病變組的表達(dá)極顯著減少(P＜0.01),而Bcl-2在病變組中的表達(dá)與對(duì)照組相比也顯著增加(P＜0.05),且正常對(duì)照組Bcl-2/Bax比值小于1,而在良性組和惡性組則均大于1.熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative PCR,RTFQ-PCR)結(jié)果通過相對(duì)定量計(jì)算顯示,Bax、Bcl-2和Caspase-3在各組中的mRNA的表達(dá)量變化與蛋白表達(dá)一致,相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01).綜上所述,自發(fā)性乳腺腫瘤在雌性大鼠中的發(fā)病率較高,且病變類型多樣,而雄性發(fā)病率為0;且Bcl-2、Bax和Caspase-3與大鼠自發(fā)性乳腺腫瘤的發(fā)生有著密切的聯(lián)系,從而為臨床乳腺腫瘤的診斷、治療和預(yù)后提供了新的思考方向.

關(guān)鍵詞大鼠;乳腺腫瘤;免疫組織化學(xué);免疫熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2;B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白;半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3

浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版) 42(1):119～126,2016

Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.)

http://www.journals.zju.edu.cn/agr

E-mail:zdxbnsb@zju.edu.cn

第一作者聯(lián)系方式:崔雨婷(http://orcid.org/0000-0001-5702-3703),E-mail:xiaocui.524@163.com

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20151215.1742.004.html

Expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 in spontaneous mammary gland tumors of rats.Journal of
Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2016,42(1):119-126

CUI Yuting1,ZHANG Rui1,CHEN Zhengli1*,LUO Qihui1,ZHU Chunmei2,SUN Fengjiao3,CHEN Menglu1
(1.Laboratory of Animal Disease Model,College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China;2.Institute of New Drug Evaluation,Chengdu University,Chengdu 610051,China;3 Sichuan Primed Biological Technology Company Limited,Ya”an 625014,Sichuan,China)

Summary The investigation on the expression and interaction of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 in the spontaneousmammary gland tumors of Sprague-Dawley(SD)rats was of great importance to provide a reference for the prevention and treatment of clinical mammary gland tumors.

One hundred and thirty(half male and female)SD rats were dissected after feeding 60 weeks,then the tumors were collected for pathological observation,and to measure the protein expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 by immunohistochemistry(IHC),and the mRNA expression of the above factors were detected by real-time fluorescence quantitative PCR(RTFQ-PCR)method.

Gross anatomy and pathology showed that 14 female rats had mammary gland tumors,the total incidence of tumors was 10.77%(14/130).However,in male rats,breast tumor had not been observed,meanwhile,the tumor occurrence rate in females was 21.54%(14/65),including 7 cases of breast fibroadenoma,3 cases of mammary adenocarcinoma,2 cases of mammary papillary carcinoma,and 2 cases of mammary invasive ductal carcinoma,respectively.IHC results showed that in the control group(n=5),the protein expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 were 9.75±0.04,8.13± 0.35 and 6.60±0.04,respectively;in the benign group(n=7),the protein expression levels of these three factors were 8.16±0.16,9.14±0.22 and 4.43±0.1,respectively,while in its malignant lesion group(n=7)were 6.49±0.32,9.24±0.81 and 3.03±0.10,respectively.In addition,compared with the control group,the expression of Bax and Caspase-3 was significantly reduced(P＜0.01)in the diseased groups,and the expression of Bcl-2 in lesion groups was significantly increased(P＜0.05).Moreover,in the control group,the Bcl-2/Bax ratio was less than 1,which was more than 1 in benign and malignant groups.Compared with the IHC results,the RTFQ-PCR results showed that the mRNA expression of above factors were consistent with the protein expression,also showed highly significance(P＜0.01).

It is concluded that female rats have a high incidence of mammary tumors,which was not observed in males;Bcl-2,Bax and Caspase-3 are closely related to spontaneous mammary gland tumor,which may provide a new idea for diagnosis,treatment and prognosis of clinical breast tumor.

Key words rats;breast cancer;immunohistochemistry;real-time fluorescent quantitative PCR;B cell lymphoma/leukmia-2 associated X protein(Bax);B cell lymphoma/leukmia-2(Bcl-2);cysteinyl aspartate specific proteinase-3(Caspase-3)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率近年來在世界范圍內(nèi)均呈上升趨勢(shì)[1],其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多步驟、多基因、多階段的復(fù)雜過程[2].男性乳腺癌的發(fā)生雖只占乳腺癌發(fā)病率的1%左右[3],但是最近20年,男性乳腺癌的發(fā)病比例呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)[4].研究表明,乳腺癌的發(fā)生不僅與某些原癌基因的過度活化或抑癌基因的失活(或缺失)有關(guān),還與細(xì)胞凋亡被抑制有關(guān).B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukmia-2,Bcl-2)和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(Bcell lymphoma/leukmia-2 associated X protein,Bax)是調(diào)控凋亡的重要胞內(nèi)蛋白質(zhì),兩者在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[5].半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心蛋白酶及細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)最關(guān)鍵的執(zhí)行者,在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐作用[6].近年來,關(guān)于乳腺癌的研究表明,Bcl-2、Bax 和Caspase-3在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用,但是鮮有在自發(fā)性乳腺腫瘤中聯(lián)合3個(gè)因子進(jìn)行研究的報(bào)道.因此,研究上述基因在自發(fā)性乳腺腫瘤中的表達(dá)和相互作用,對(duì)于揭示乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制有著十分重要的意義.

1　材料與方法

1.1材料

無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠(SCXK(滬)2012-0002);鼠全價(jià)顆粒飼料(GB14924.3-2001);兔抗鼠Bax(rabbit anti-Bax)、Bcl-2(rabbit anti-Bcl-2)與Caspase-3(rabbit anti-Caspase-3)一抗、鏈霉素親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)試劑盒(SABC Kit)、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(DAB Kit)購自武漢博士德生物工程有限公司;總RNA提取試劑盒(Total RNA Extractor Kit)購自生工生物工程有限公司(上海);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT reagent Kit with gDNA Eraser)和熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)均購自大連寶生物工程有限公司(大連).

1.2動(dòng)物處理

選擇3周齡SPF級(jí)SD大鼠,雌雄對(duì)半共130只于中國醫(yī)藥集團(tuán)安全性評(píng)價(jià)研究中心屏障系統(tǒng)[SYXK(川)2009-021]中,在晝夜交替的自然光周期下飼養(yǎng),自由飲水進(jìn)食.環(huán)境溫度為22～26℃,濕度高于40%.飼養(yǎng)60周后進(jìn)行集體剖殺,取大鼠乳腺組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn),由于在組織學(xué)形態(tài)上大鼠乳腺腫瘤與人類乳腺腫瘤有著很高的相似度[7],故本文將把2012年由多個(gè)國家毒性病理學(xué)會(huì)聯(lián)合發(fā)布的大鼠乳腺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[8]與世界衛(wèi)生組織乳腺腫瘤組織學(xué)分類(2003)標(biāo)準(zhǔn)作為本次乳腺腫瘤分類的一個(gè)依據(jù)來判定實(shí)驗(yàn)中自發(fā)性乳腺腫瘤的具體病理分類.實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定.

1.3大體解剖及蘇木精-伊紅染色

動(dòng)物飼養(yǎng)60周后所有大鼠用2%的戊巴比妥鈉溶液按動(dòng)物體質(zhì)量的0.2倍進(jìn)行麻醉,麻醉后進(jìn)行解剖,解剖時(shí)肉眼觀察并記錄乳房組織的大小、顏色.

取正常乳腺及乳腺腫瘤組織固定于4%多聚甲醛溶液.組織固定至少48 h后,取材1 cm×1 cm× 0.5 cm經(jīng)自來水沖洗、70%～100%梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,制成5μm厚切片.切片在恒溫烘箱中37℃烘干過夜,次日二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后經(jīng)蘇木精染色10 min、自來水返藍(lán),再入伊紅染色2 min,隨后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片.鏡檢觀察并照相.

1.4免疫組織化學(xué)法

將多聚賴氨酸與蒸餾水1∶5混勻,用干凈棉簽蘸取涂抹于載玻片正面,即為防脫片處理過的載玻片,自然晾干后保存?zhèn)溆?取出固定于4%多聚甲醛的乳腺組織,放在脫水盒中自來水沖洗過夜,經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后進(jìn)行切片至5 μm厚.切片貼于防脫片處理后的載玻片上,經(jīng)恒溫烘箱60℃烤片4 h以上,二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、磷酸鹽緩沖液洗滌,3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性20 min,磷酸鹽緩沖液洗滌后,將切片置于0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液(p H6.0)中微波爐加熱煮沸后斷電,10 min后重復(fù)第2次以修復(fù)抗原,自然冷卻至室溫磷酸鹽緩沖液洗滌.封閉液孵育40 min后,加入磷酸鹽緩沖液稀釋(1∶100)～(1∶200)的一抗4℃過夜.次日取出,經(jīng)多次洗滌后,加入生物素化的二抗(兔抗大鼠)37℃下孵育40 min后洗滌.滴加試劑SABC 37℃20 min后磷酸鹽緩沖液洗滌4次,然后加入到DAB顯色液中顯色,在光學(xué)顯微鏡下對(duì)其染色程度進(jìn)行控制,上色后及時(shí)加入雙蒸水中終止染色,后脫水透明并用中性樹脂封片.分別用光學(xué)顯微鏡100倍、200倍和400倍進(jìn)行觀察并拍照,然后進(jìn)行陽性表達(dá)分析.

1.5熒光定量PCR

取組織RNA并檢測(cè)其質(zhì)量,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,熒光定量PCR采用BIO-RAD CFX96序列檢測(cè)系統(tǒng)來進(jìn)行.在含有Mix、SYBR GreenⅠ、2μL cDNA以及上下游各0.5μL的25μL總反應(yīng)體系中,進(jìn)行如下擴(kuò)增:95℃預(yù)變性3 min;95℃10 s,60℃30 s,72℃10 s共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后72℃下延伸10 min.各待測(cè)樣品分別以內(nèi)參基因(β-actin)作為對(duì)照,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(不加模板),每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)3次,3次得到的CT值結(jié)果平均值為最終測(cè)定結(jié)果.引物由大連寶生物工程有限公司合成,引物序列見表1.

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s),通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行ANOVA和Dunnett-t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.免疫組織化學(xué)法和RT-PCR結(jié)果通過SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)性雙因素Pearson統(tǒng)計(jì)分析,檢驗(yàn)2種方法間的相關(guān)性,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2　結(jié)果

2.1大體解剖及HE染色鏡檢結(jié)果

大體解剖發(fā)現(xiàn)14只動(dòng)物出現(xiàn)腫瘤的相關(guān)大體病變,部分大體病變見圖1.圖1A所示大鼠右側(cè)倒數(shù)第二對(duì)乳腺處有一腫塊,黃豆粒大小,質(zhì)硬,可移動(dòng);尿道口周圍大小不等腫塊,質(zhì)硬,最大約黃豆大小.圖1B為大鼠尿道口右側(cè)有6 cm×5.2 cm包塊,質(zhì)地軟,表面光滑,觸之可移動(dòng),邊界清晰.圖1C為尿道口右側(cè)有一約3.2 cm×3.0 cm包塊,質(zhì)地軟,表面光滑,邊界清晰,可移動(dòng),隨時(shí)間推移,包塊漸長(zhǎng),且包塊表面脫毛,顏色變黑.

乳腺腫瘤組織切片在光鏡下進(jìn)行病理觀察并記錄(圖2),并根據(jù)病理變化對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)分類(表2).病理觀察可見,與對(duì)照組相比,乳腺纖維腺瘤可見間質(zhì)纖維大量增生,小葉萎縮.整體呈分葉狀,腺泡大小不一,部分腺泡上皮細(xì)胞變性壞死(圖2D,E,F);乳腺腺癌鏡檢可見腺上皮呈不規(guī)則增生,單層或多層排列,腫瘤細(xì)胞大小不同,核質(zhì)比增加,核深染,可見核分裂(圖2G,H,I);乳腺乳頭狀癌:單層多層惡性上皮細(xì)胞群,纖維結(jié)締組織和肌上皮細(xì)胞支持乳頭狀突起,多見有絲分裂,細(xì)胞異型性高(圖2J,K,L);乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌:腺泡間呈融合狀,間質(zhì)減少,管腔內(nèi)有漿液性分泌物,細(xì)胞異型性高,核分裂廣泛存在(圖2M,N,O).由于癌變組織樣本較少,故將乳腺腺癌、乳頭狀癌、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌統(tǒng)一歸為惡性腫瘤組.

2.2免疫組織化學(xué)染色圖片和結(jié)果

SD大鼠乳腺中Bcl-2、Bax、Caspase-3的染色圖片見圖3,免疫組織化學(xué)結(jié)果(表3)顯示,與對(duì)照組相比,良性組與惡性組的Bax及Caspase-3的蛋白表達(dá)有明顯的降低,相比差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),而Bcl-2的蛋白表達(dá)則明顯增加(P＜0.05).

Bcl-2/Bax的比值由表3可知,在對(duì)照組其比值小于1,而在良性組和惡性腫瘤組中比值均變大,都大于1,可見在乳腺腫瘤中細(xì)胞凋亡受到抑制.

2.3熒光定量PCR結(jié)果

通過熒光定量PCR檢測(cè)SD大鼠乳腺中Bax、Bcl-2、Caspase-3的m RNA的表達(dá)量(圖4)顯示,良性組和惡性組的Bcl-2 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P＜0.01),而良性組和惡性組大鼠Bax、Caspsase-3 mRNA表達(dá)水平則低于對(duì)照組(P＜0.05).m RNA的表達(dá)量通過2-ΔΔCT±s來表達(dá).免疫組織化學(xué)法與熒光定量PCR結(jié)果的相關(guān)性分析(表4)顯示,在所有試驗(yàn)組中,Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表達(dá)量變化與m RNA表達(dá)量變化具有很高的相關(guān)性(P＜0.01).

3　討論

乳腺癌現(xiàn)今已成為女性最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅到了女性的健康以及家庭和社會(huì)的幸福指數(shù).乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是環(huán)境與遺傳相互作用、多基因、多步驟的一個(gè)過程,其機(jī)制尚未完全闡明.細(xì)胞凋亡異常常常引起多種疾病的發(fā)生如自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病以及惡性腫瘤[9].

本文65例雌性大鼠中有14例發(fā)生乳腺腫瘤,發(fā)病率為21.54%,而雄性未見乳腺腫瘤的發(fā)生.馬超亞等[10]經(jīng)研究表明雌性SD大鼠的乳腺腫瘤發(fā)病率為46.50%;而趙磊等[11]在大鼠自發(fā)性乳腺腫瘤流行病學(xué)的研究中指出其大鼠乳腺腫瘤的發(fā)病率為10.5%.2篇文章關(guān)于自發(fā)性乳腺腫瘤發(fā)病率的差異很大,本文的結(jié)果介于兩者之間,也存在很大的差異,這可能與大鼠的個(gè)體差異、飼養(yǎng)環(huán)境、觀察周期的長(zhǎng)短以及遺傳因素的影響有關(guān).

Bcl-2家族蛋白在凋亡中扮演了一個(gè)極其重要的角色,且其與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系[12].Bcl-2家族具有雙重的效應(yīng),既可以促進(jìn)凋亡如Bid、Bax,又能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖阻止細(xì)胞凋亡[13],如Bcl-2、Bcl-X.Bcl-2基因(即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因)是一種原癌基因,Bcl-2能夠阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì),抑制Caspase蛋白的水解從而抑制了細(xì)胞凋亡[14],是較為肯定的抗凋亡基因,其功能失調(diào)是乳腺癌形成的一個(gè)重要機(jī)制.Bax蛋白(Bcl-2 associated X protein)即Bcl-2相關(guān)X蛋白,是Bcl-2的顯性抑制因子,它是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因代表,Bax和Bcl-2通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;Bax與Bcl-2形成異源二聚體時(shí)則實(shí)現(xiàn)了Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的功能[15].Bax和Bcl-2形成了細(xì)胞凋亡的正負(fù)調(diào)控,兩者比例決定了細(xì)胞凋亡的走向[16].若Bcl-2/Bax比例增高,則抑制細(xì)胞凋亡;反之,則促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17 18].本研究表明,在大鼠自發(fā)性乳腺腫瘤中,與對(duì)照組相比,Bax的蛋白及mRNA的表達(dá)量均呈下降趨勢(shì),而Bcl-2的蛋白及mRNA的表達(dá)量則升高,且Bcl-2/Bax的比例不斷升高,說明當(dāng)發(fā)生乳腺腫瘤時(shí),細(xì)胞凋亡功能被抑制,這與腫瘤細(xì)胞能無限增殖的現(xiàn)象相一致.該結(jié)果與曲文志等[19]、張丙信等[20]的研究結(jié)果是一致的.但是王美玲[21]在對(duì)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的研究中發(fā)現(xiàn),Bax在癌旁組織和癌組織中表達(dá)差異不明顯,但是在癌組織中Bcl-2的表達(dá)顯著高于癌旁組織.本文結(jié)果結(jié)合前人的研究說明隨著乳腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,細(xì)胞凋亡受到抑制,癌細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性降低,導(dǎo)致細(xì)胞存活周期變長(zhǎng).Bcl-2、Bax的表達(dá)以及Bcl-2/Bax比例的變化與自發(fā)型乳腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系,且Bcl-2和Bax之間相互作用,對(duì)乳腺腫瘤的形成和發(fā)展起著至關(guān)重要的作用,可部分反映乳腺腫瘤的生物學(xué)行為.

目前研究表明,已知的3條凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均要依賴Caspase家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng),其中Caspase-3處于各條通路的樞紐環(huán)節(jié),是最重要的凋亡效應(yīng)分子[22].國外文獻(xiàn)記載[23],Bcl-2是通過干擾細(xì)胞色素C的釋放而阻斷上游Caspase蛋白酶的激活,抑制細(xì)胞的凋亡.WINTER等[24]發(fā)現(xiàn)與正常前列腺組織相比,Caspase-3在前列腺癌中蛋白表達(dá)減少.HOSHI等[25]通過免疫組織化學(xué)的方法研究了Caspase-3在胃癌中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)Caspase-3在胃癌組織中的蛋白陽性表達(dá)率明顯低于癌旁胃黏膜組織,并認(rèn)為胃癌的形成與Caspase-3蛋白表達(dá)降低有關(guān).PANG等[26]發(fā)現(xiàn)IL-8通過上調(diào)Bcl-2下調(diào)Caspase-3來抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的凋亡.與前人相關(guān)報(bào)道一致,本文結(jié)果顯示與正常對(duì)照組織相比,Caspase-3的蛋白和mRNA的表達(dá)量隨著乳腺腫瘤病變程度的加深而不斷降低,且Caspase-3的表達(dá)與Bcl-2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),可能是在乳腺腫瘤發(fā)展過程中隨著Bcl-2表達(dá)的增加,抑制了Caspase-3的活性,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡被抑制,從而使癌細(xì)胞不斷增殖.本文結(jié)果提示Caspase-3與大鼠自發(fā)型乳腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中的細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)系,Caspase-3參與了一系列與凋亡相關(guān)的細(xì)胞變化過程,且與Bcl-2共同參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制,在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,提示其有可能成為乳腺癌靶向治療和預(yù)后評(píng)估的參考.

綜上所述,乳腺腫瘤在雌性大鼠中發(fā)病較高,但是在本試驗(yàn)中卻未見雄性乳腺腫瘤的發(fā)生.Bcl-2、Bax 和Caspase-3均參與了自發(fā)性乳腺腫瘤的發(fā)生過程.Caspase-3、Bax表達(dá)的降低以及Bcl-2表達(dá)的升高可能與自發(fā)性乳腺腫瘤惡化有關(guān),且Bcl-2與Caspase-3 和Bax分別有著密切的關(guān)系,將Bcl-2、Bax和Caspase-3聯(lián)合分析,完全將促凋亡、抗凋亡以及凋亡執(zhí)行者聯(lián)合起來,使臨床上聯(lián)合三者來進(jìn)行乳腺腫瘤的早期診斷成為一種可能,同時(shí)也可利用這些敏感指標(biāo)判定乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后.

參考文獻(xiàn)(References):

[1]PORTER P.“Westernizing”women’s risks?Breast cancer in lower-income countries.New England Journal of Medicine,2008,358(3):213-6.

[2]ITO Y,YOSHIDA H,NAKANO K,et al.Bag-1 expression in thyroid neoplasm:its correlation with Bcl-2 expression and carcinoma dedifferentiation.Anticancer Research,2003,23(1B):569-576.

[3]于志強(qiáng),羅明華,韋偉,等.男性乳腺癌臨床分析.罕少疾病雜志,2006,13(5):20-21.YU Z Q,LUO M H,WEI W,et al.Clinical characteristic of male breast cancer.Journal of Rare and Uncommon Diseases,2006,13(5):20-21.(in Chinese)

[4]雷小芹,張美菊,蘇捷,等.男性雙側(cè)乳腺癌1例報(bào)告.罕少疾病雜志,2008,15(1):62.LEI X Q,ZHANG M J,SHU J,et al.One case of bilateral breast cancer report in male.Journal of Rare and Uncommon Diseases,2008,15(1):62.(in Chinese)

[5]夏同禮.腫瘤實(shí)驗(yàn)診斷學(xué).北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社,2005:44-45.XIA T L.The Tumor Laboratory Diagnosis.Beijing:Beijing Science and Technology Press,2005:44-45.(in Chinese)

[6]POP C,SALVESEN G S.Human caspases:activation,specificity,and regulation.Journal of Biological Chemistry,2009,284(33):21777-21781.

[7]張帆,張乃鑫.大鼠化學(xué)誘發(fā)性乳癌的形態(tài)發(fā)生及其生物標(biāo)記物的研究狀況.中國腫瘤臨床,1999,26:64-67.ZHANG F,ZHANG N X.Research status of morphogenesis and biomarkers of chemical induced breast cancer in rats.Chinese Journal of Clinical,1999,26:64-67.(in Chinese)

[8]RUDMANN D,CARDIFF R,CHOUINARD L,et al.Proliferative and nonproliferative lesions of the rat and mouse mammary,Zymbal’s,preputial,and clitoral glands.Toxicologic Pathology,2012,40(Suppl.6):7-39.

[9]WONG R S.Apoptosis in cancer:from pathogenesis to treatment.Journal of Experimental and Clinical Cancer Research,2011,30(1):87.

[10]馬超亞,宋向榮,高洪彬,等.雌性SD大鼠自發(fā)性乳腺腫瘤發(fā)生情況及其生存分析.中國職業(yè)醫(yī)學(xué),2013,40(6):505-510.MA C Y,SONG X R,GAO H B,et al.Occurrence of spontaneous mammary neoplasm in female SD rats and their survival analysis.China Occupational Medicine,2013,40(6):505-510.(in Chinese with English abstract)

[11]趙磊,谷長(zhǎng)勤,張萬坡,等.SPF級(jí)大鼠自發(fā)性乳腺腫瘤的流行病學(xué)與病理學(xué)特點(diǎn).中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2007,15(2):116-119.ZHAO L,GU C Q,ZHANG W P,et al.Epidemiologic and pathologic characteristics of spontaneous breast tumors in SPF rats.Acta Laboratorium Animals Scientia Sinica,2007,15(2):116-119.(in Chinese with English abstract)

[12]徐云峰,劉松堅(jiān).Bcl-2家族的研究進(jìn)展.中國療養(yǎng)醫(yī)學(xué),2014,23(10):884-886.XU Y F,LIU S J.Research progress of the Bcl-2 family.Chinese Journal of Convalescent Medicine,2014,23(10):884-886.(in Chinese with English abstract)

[13]UYTTENDAELE H,SORIANOJ V,MONTESANO R,et al.Notch 4 and Wnt-1 proteins function to regulate branching morphogenesis of mammary epithelial cells in an opposing fashion.Developmental Biology,1998,196(2):204-217.

[14]SORIANO J V,UYTTENDAELE H,KITAJEWSKI J,et al.Expression of an activated Notch4(int-3)oncoprotein disrupts morphogenesis and induces an invasive phenotype in mammary epithelial cells in vitro.International Journal of Cancer,2000,86(5):652-659.

[15]LALIER L,CARTRON P F,JUIN P,et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis.Apoptosis,2007,12 (5):887-896.

[16]KARAMANOLIS D G,KYRLAGKITSIS I,KONSTANTINOU K,et al.The Bcl-2/Bax system and apoptosis in ulcerative colitis.Hepato-gastroenterology,2007,54(76):1085-1088.

[17]KRAJEWSHI S,KRAJEWSKA M,SHABAIK A,et al.Immunohistochemical determination of in vivo distribution of Bax,a dominant inhibitor of Bcl-2.The American Journal of Pathology,1994,145(6):1323-1336.

[18]WILLIAMS G T,SMITH C A.Molecular regulation of apoptosis:genetic controls on cell death.Cell,1993,74:777-779.

[19]曲文志,陳靜,孫玉華,等.Bcl-2和Bax的比值與乳腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2006,16(7):1010-1012.QU W Z,CHEN J,SUN Y H,et al.Relationship between ratio Bcl-2/Bax gene and biological behavior of breast cancer.China Journal of Modern Medicine,2006,16(7):1010-1012.(in Chinese with English abstract)

[20]張丙信,趙霞,陳雪,等.Caspase-9、Bcl-2和Bax在基底細(xì)胞樣乳腺癌組織中的表達(dá)及意義.山東醫(yī)藥,2014,54(46):8-10.ZHANG B X,ZHAO X,CHEN X,et al.Expression and clinical significance of Caspase-9,Bcl-2 and Bax in basal-like breast carcinoma.Shandong Medical Journal,2014,54(46):8-10.(in Chinese with English abstract)

[21]王美玲.Bax、Bag-1、Bcl-2在乳腺腫瘤組織中的表達(dá)及意義.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014,11:1472-1474.WANG M L.Expression and significance of Bax,Bag-1,Bcl-2 in breast cancer tissues.Journal of Hainan Medical University,2014,11:1472-1474.(in Chinese with English abstract)

[22]FUCHS Y,STELLER H.Programmed cell death in animal development and disease.Cell,2011,147(4):742-758.

[23]VOUTSADAKIS I A.Apoptosis and the pathogenesis of lymphoma.Acta Oncologica,2000,39:151-156.

[24]WINTER R N,KRAMER A,BORKOWAKI A,et al.Lose of Caspase-1 and Caspase-3 protein expression in human prostate cancer.Cancer Research,2001,61(3):1227-1232.

[25]HOSHI T,SASANO H,KATO K,et al.Immunohistochemistry of Caspase3/CPP32 in human stomach cancer and its correlation with cell proliferation and apoptosis.Anticancer Research,1998,18:4347-4353.

[26]PANG X,LI K,WEI L,et al.IL-8 inhibits the apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells by up-regulating Bcl-2 and down-regulating Caspase-3.Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology,2015,31(3):307-311.

收稿日期(Received):2015-03-16;接受日期(Accepted):2015-06-19;網(wǎng)絡(luò)出版日期(Published online):2015-12-15

*通信作者(

Corresponding author):陳正禮(http://orcid.org/0000-0002-9850-528X),E-mail:chzhli75@163.com

基金項(xiàng)目:國家科技支撐計(jì)劃課題(2014BAI03B01);國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2013YQ49085906);四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2013TD0015).

DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2015.03.161

中圖分類號(hào)R 730.261;S 852

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A