王麗萍，張曉梅，呂芳，潘宇，李雪麗，何笑，魯軍，潘云龍

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多囊卵巢綜合征生物樣本庫建設(shè)及管理

王麗萍，張曉梅，呂芳，潘宇，李雪麗，何笑，魯軍，潘云龍

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡女性最常見的一種生殖內(nèi)分泌疾病，影響世界 5% ~ 10% 的育齡婦女[1]，其臨床表現(xiàn)呈多態(tài)性，包括月經(jīng)紊亂或稀發(fā)、閉經(jīng)，多毛和肥胖，伴卵巢多囊性增大等。PCOS 與不孕和肥胖有關(guān)，可增加患 II 型糖尿病、胰島素抵抗、高血壓、氧化應(yīng)激、血脂異常和心血管等疾病的終身風(fēng)險[2]，PCOS 的研究已經(jīng)取得了很大的進展，但是發(fā)病機制至今不明，目前認為是環(huán)境[3]和遺傳因素[4]的共同作用的結(jié)果。PCOS 基因組研究揭示異?；蚋淖儏⑴c多方面生物過程，主要包括細胞分化[5]、細胞增生[6]、細胞凋亡[7-8]、基因[9]及蛋白表達[10]等。明確多囊卵巢綜合征發(fā)生發(fā)展的機制、個性化治療方案、療效的隨訪、藥物敏感性研究及新藥研發(fā)等離不開大量的生物樣本，因此，江蘇省蘇北人民醫(yī)院建立了高質(zhì)量、標準化、規(guī)范化、信息化的多囊卵巢綜合征生物樣本庫。

生物樣本庫又稱生物銀行（biobank），主要是指標準化收集、處理、儲存和應(yīng)用健康和疾病生物體的生物大分子、細胞、組織和器官等樣本，包括人體器官組織、全血、血漿、血清、生物體液或經(jīng)處理過的生物樣本（DNA、RNA、蛋白等）以及與這些生物樣本相關(guān)的臨床、病理、治療、隨訪、知情同意等資料及其質(zhì)量控制、信息管理與應(yīng)用的系統(tǒng)。我院生物樣本庫規(guī)劃為樣本處理區(qū)和樣本存儲區(qū)，目前存儲設(shè)備可滿足 40 萬 ~ 50 萬份大規(guī)?？蒲袠颖敬鎯π枨?，希望能夠為多囊卵巢綜合征早期干預(yù)、抑制疾病發(fā)展提供強有力的支持。

1 材料與方法

1.1 組織架構(gòu)

我院生物樣本庫設(shè)有管理委員會、學(xué)術(shù)委員會及倫理委員會，由專職人員負責(zé)管理。

1.2 環(huán)境設(shè)施

生物樣本庫占地面積約 400 m2，設(shè)有標本取材室、體液處理室、組織處理室、核酸提取室、資料室及低溫存儲室。主要設(shè)備有–196 ℃液氮罐（Taylor-wharton）、–86 ℃超低溫冰箱（Thermo）及室溫石蠟切片柜、24 h 溫控系統(tǒng)（Haier）、4 ℃低溫離心機（Thermo）、制冰機（Panasonic）、低溫條碼打印機（Brady）、石蠟切片機（Leica）、冰凍切片機（Thermo）、全自動封片染片機（Sakura）、超微量分光光度計（Thermo）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）等。

1.3 信息系統(tǒng)

采用無錫唐頤生物樣本庫智能信息管理系統(tǒng)，可根據(jù)臨床資料個性化設(shè)置需求模塊。液氮罐、冰箱、石蠟柜均實現(xiàn)可視化存儲，能夠與院內(nèi) HIS、LIS、PACS 接口對接，實時獲取臨床資料。貝迪打印機、掃碼機、條碼采用低溫二維碼打印并于標簽顯示其樣本編碼、采集日期、類型、存儲方式以及存儲位置等。例如，PC-1600720-BS-F-02，代表多囊卵巢綜合征，2016 年第 720 號入庫，血清，冰凍存儲，第二復(fù)份。

1.4 流程管理

按照中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會生物樣本庫標準[11]、國際生物和環(huán)境樣本庫協(xié)會（ISBER）樣本庫管理規(guī)范[12]，結(jié)合我院實際情況制定生物樣本庫制度職責(zé)及標準操作流程（SOPs），其中包括人員管理、儀器設(shè)備管理、實驗管理、醫(yī)院感染管理、檔案管理，樣本采集、處理、存儲、質(zhì)量控制、運輸流程、銷毀管理等。

多囊卵巢綜合征生物樣本庫的建立已通過江蘇省蘇北人民醫(yī)院倫理委員會審核，具體采集計劃由臨床科室、樣本庫工作人員共同制定并確定一名臨床協(xié)調(diào)人員，每日可采集病例由臨床醫(yī)生確定并簽署知情同意書，一式三份，由臨床科室、生物樣本庫、患者各執(zhí)一份留存。

1.5 臨床資料收集

我院 PCOS 入庫樣本臨床資料已達到標準化、規(guī)范化，其中包括：基本信息（姓名、性別、年齡、身份證號、家庭住址、聯(lián)系方式等），現(xiàn)病史（初診日期、不孕類型、不孕年限、月經(jīng)是否規(guī)律等），既往史（外傷手術(shù)史、預(yù)防接種史、輸血及輸血制品史），必備的檢驗/檢查（血常規(guī)、尿常規(guī)、血型、基礎(chǔ)內(nèi)分泌、TORCH、甲狀腺功能、血胰島素、染色體及陰道 B 超等），診療計劃（ART 方式、周期類型、治療方式、治療方案、用藥方案、精子來源方式、卵子來源、存儲方式以及培養(yǎng)方式等），手術(shù)記錄（取卵日期、取卵時間、麻醉方式、卵巢大小、卵泡數(shù)量等），胚胎移植記錄（移植日期、移植時間、子宮位置、導(dǎo)管進入宮腔次數(shù)、移植個數(shù)、胚胎殘留、有無污染及移植后用藥等），卵子處理記錄（取卵日期、取卵時間、穿刺卵泡數(shù)、獲卵數(shù)等），胚胎培養(yǎng)情況（培養(yǎng)囊胚數(shù)、形成囊胚數(shù)、高評分囊胚數(shù)、囊胚胚胎移植數(shù)等）以及隨訪資料等。

1.6 血液標本采集流程

符合納入標準的患者均采集血液標本，血液樣本進行術(shù)前血采集，其中 8 ml EDTA 抗凝和 5 ml 非抗凝真空采血管采集靜脈血。詳細填寫樣本采集登記表，室溫靜置 30 min 后，4 ℃低溫離心 10 min，分離血清、血漿，按照每管 300 μl分裝成 5 份，400 ×低溫離心 30 min，于白膜層部提取白細胞，按照每管 300 μl 分裝成 3 份，所有流程在 2 h 內(nèi)分裝完畢，置于–80 ℃保存。

1.7 卵泡液標本采集流程

符合納入標準的患者均進行卵泡液標本采集，術(shù)中穿刺卵泡液 50 ml，詳細填寫樣本采集登記表，室溫靜置 30 min 后，4 ℃低溫 3000 r/min 離心 10 min，分離上清、沉淀，按照每管 15 ml 分裝成 3 份并于–80 ℃保存。

1.8 質(zhì)量控制流程

我院多囊卵巢綜合征樣本庫定期對庫內(nèi)樣本隨機抽檢進行質(zhì)量控制，分別對 DNA 質(zhì)量、定量和純度、RNA 完整性以及樣本的位置信息、臨床信息（基本信息、手術(shù)記錄、臨床診斷、必須檢查、輔助檢查、治療方案、隨訪信息）等規(guī)范性及完整性進行檢測檢查，同時第一時間獲取科研使用者結(jié)果反饋。

2 結(jié)果

我院生物樣本庫已建有三種存儲方式，分別為–196 ℃大型液氮存儲、–86 ℃低溫冰箱存儲以及室溫存儲，多囊卵巢綜合征卵泡液及血液樣本于–86 ℃低溫冰箱存儲，同時按照標準化操作流程實施多囊卵巢綜合征采集計劃。截至 2016 年 10 月 28 日，我院成功收集百余例多囊卵巢綜合征（包括原發(fā)不孕、繼發(fā)不孕、子宮內(nèi)膜異位癥等）卵泡液（上清、沉淀），血液樣本（血清、血漿、白細胞）。樣本核酸提取及鑒定結(jié)果顯示，DNA 完整性、RNA 純度及總量完全滿足科研需求。

3 討論

近年來，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)已經(jīng)成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究與臨床治療連接，快速實現(xiàn)科學(xué)研究向工程應(yīng)用的重要學(xué)科。生物樣本庫的構(gòu)建能夠?qū)⒋罅康呐R床獲取的有效樣本統(tǒng)一標準化、規(guī)范化采集、處理，將疾病標本充分地用于基礎(chǔ)性研究。使得臨床疾病標本能夠更加有效利用，基礎(chǔ)研究的取樣來源更加快捷可靠。樣本庫對于樣本的信息直接從臨床管理系統(tǒng)中獲取，來源更加準確快捷，避免了中間人工傳抄的誤差，同時又能夠快速地將實驗研究的信息反饋于臨床的?？漆t(yī)生，信息傳達位點更加精確，打破了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究到應(yīng)用發(fā)展模式中的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用之間的堅冰壁壘，使得基礎(chǔ)信息和臨床思維反復(fù)快速地整合，極大地促進了轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展。

隨著自然環(huán)境因素和社會心理因素的改變，相比過去，年輕的生育群體中不孕不育以及多囊卵巢綜合征患者數(shù)量呈明顯升高趨勢。尤其我國開放了二胎政策后，生育能力已經(jīng)明顯下降的大齡婦女要求生二胎的需求在不斷增多。越來越多的人群開始關(guān)注生殖健康問題，多囊卵巢綜合征除了會導(dǎo)致月經(jīng)稀發(fā)和不孕不育等，還與代謝疾?。ㄌ悄虿13]、胰島素抵抗[14-15]、代謝綜合征等[16]），心血管疾病[17]，腫瘤（子宮內(nèi)膜癌[18]）等問題有較高的關(guān)聯(lián)性和并發(fā)性?；谌和暾纳飿颖編鞂崟r更新和信息的共享，可以完整地評價疾病標本對于開展的各項相關(guān)研究的價值性，有選擇地參與多囊卵巢綜合征不同方向、不同層次、不同組別的實驗隊列研究。此外，多囊卵巢綜合征的生物標本，尤其是卵泡液標本，采集技術(shù)要求高，來源方式單一，基于多囊卵巢的相關(guān)調(diào)查研究，在樣本容量和樣本代表性上有很大的困難需要克服。

我院有發(fā)展規(guī)模成熟的生殖中心，長期穩(wěn)定地開展各項輔助生殖技術(shù)，在院內(nèi)已有的生物樣本庫的基礎(chǔ)上，增設(shè)多囊卵巢綜合征生物樣本庫，可以實時跟蹤利用輔助生殖技術(shù)行卵巢穿刺取卵術(shù)過程中獲取的卵泡液標本，并進行信息化管理與應(yīng)用。堅持“來源于臨床，服務(wù)于科研，資源共享、開放利用”的原則，極力構(gòu)建標準化的多囊卵巢綜合征生物樣本庫，深入開展多囊卵巢綜合征及不孕不育等相關(guān)疾病的基礎(chǔ)研究，促進多囊卵巢綜合征相關(guān)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

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國家自然科學(xué)基金（81601343）；揚州市自然科學(xué)基金（YZ2016110）；揚州市科技計劃項目（YZ2015068）；江蘇省蘇北人民醫(yī)院院基金（yzucms201425）

225001 揚州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/江蘇省蘇北人民醫(yī)院生物樣本庫（王麗萍、魯軍、潘云龍），生殖醫(yī)學(xué)中心（張曉梅、呂芳、潘宇、李雪麗、何笑）

潘云龍，Email：yzpyl@medmail.com.cn

2016-11-01

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2016.06.013