陳虹

非諾貝特與吡格列酮對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠抗炎作用研究

陳虹

【摘要】目的探討非諾貝特與吡格列酮對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的抗炎效果。方法24只雄性Lewis大鼠隨機(jī)分成4組，空白組、模型對照組:給予等量的羧甲基纖維素;非諾貝特組: 100mg·kg－1·d－1、吡格列酮組: 30mg·kg－1·d－1，于造模后開始給藥，共給藥21 d。大鼠尾靜脈皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑每只0.1ml，制備AA大鼠模型。關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度是由臨床觀察(體重，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，足跟腫脹度)進(jìn)行評估。骨密度(BMD)，骨礦物質(zhì)含量(BMC)于給藥20 d由雙能X線骨密度儀測定。應(yīng)用real-time PCR法檢測IL-1β，IL-6和IL-10mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果與模型對照組相比，非諾貝特組和吡格列酮組關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和足跟腫脹度明顯降低(P＜0.05)，骨密度和骨礦物質(zhì)含量明顯增加(P＜0.05)，IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)水平明顯增加(P＜0.05)，IL-10mRNA的表達(dá)水平降低(P＜0.05)。結(jié)論非諾貝特和吡格列酮對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用。

【關(guān)鍵詞】佐劑性關(guān)節(jié)炎;非諾貝特;吡格列酮;骨

【中圖分類號】R 966

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002－7386(2015)16－2422－04

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.006

【Abstract】Objective To investigate the anti-inflammatory effect of fenofibrate and pioglitazone on adjuvant arthritis(AA)in rats.Methods Twenty-fourmale Lewis rats were randomly divided into four groups.The rats in blank group andmodel group were treated orally with same doses of carboxymethylcellulose for 21 days，however，the rats in fenofibrate group or pioglitazone group were treated orally with fenofibrate 100mg－1·kg－1day－1or pioglitazone 30mg－1·kg－1·day－1for 21 days，respectively.The ratmodels with AA were established by caudal vein intradermal injection with complete Freund’s adjuvant 1mg/each rat.The severity of AA was evaluated by observing clinical indexes including body weight，AA index score，swelling degree of heel.Bonemineral density(BMD)and femoral bonemineral content(BMC)weremeasured by dual-energy X-ray absorptiometry at day 20.The expression levels of IL-1β，IL-6 and IL-10mRNA were detected by Real-time RT-PCR.Results As compared with those inmodel group，the AA index score and swelling degree of heel were significantly decreased in fenofibrate group(100mg－1·kg－1·d－1)and pioglitazone group(30mg－1·kg－1·d－1)(P＜0.05)，however，BMD and BMC were significantly increased，so were the expression levels of IL-1β，IL-6mRNA(P＜0.05)，but the expression levels of IL-10mRNA were obviously decreased(P＜0.05).Conclusion Both pioglitazone and fenofibrate have certain therapeutic effects on experimental adjuvant arthritis in rats.

收稿日期:(2015－02－03)

作者單位: 300162天津市，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院藥材科

The anti-inflammatory effect of fenofibrate and pioglitazone on adjuvant arthritis in rats

CHEN Hong.Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Tianjin Armed Police Logistics College，Tianjin 300162，China

【Key words】adjuvant arthritis; fenofibrate; pioglitazone; bone

基因轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)屬核激素受體超家族，是一種細(xì)胞核內(nèi)受體，由激活劑活化后可調(diào)控多種核內(nèi)靶基因的表達(dá)，影響人體糖脂代謝、細(xì)胞發(fā)育等過程［1］。PPARs共有PPARα、PPARγ、PPARδ三種亞型。PPAR-α和PPAR-γ是PPARs家族的主要成員，參與脂質(zhì)代謝、炎癥、能量動態(tài)平衡和胰島素敏感性調(diào)節(jié)等許多生物學(xué)過程，它們的相關(guān)作用可能與脂肪因子和脂肪細(xì)胞來源的信號分子有關(guān)［2］。非諾貝特(Fenofibrate)是PPARα激動劑，目前臨床上用于降血脂的藥物［3］。吡格列酮(Pioglitazone)是PPARγ激動劑，作為一種新型胰島素增敏劑，與胰島素抵抗和糖脂類代謝密切相關(guān)，主要用于降低II型糖尿病患者血糖［4］。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種不明病因的慢性和系統(tǒng)性自身免疫性疾病。RA以慢性疼痛和多關(guān)節(jié)的腫脹為主要臨床表現(xiàn)，主要導(dǎo)致滑膜增生，骨質(zhì)破壞和軟骨退化等病理特征［5］。本研究中，比較PPAR-α激動劑(非諾貝特)和PPAR-γ激動劑(吡格列酮)對關(guān)節(jié)炎發(fā)展和炎性因子的影響。

1　材料與方法

1.1動物與試劑Lewis大鼠24只，雄性，清潔級，體重150～175 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，適應(yīng)喂養(yǎng)7 d用于實(shí)驗(yàn)。非諾貝特(每片100mg):徐州恩華制藥廠;吡格列酮(每片15mg):北京太洋藥業(yè)有限公司;完全弗氏佐劑(Freund’s adju-

vant)，Sigma公司產(chǎn)品;

1.2實(shí)驗(yàn)分組24只大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只:空白組、模型對照組、非諾貝特組:100mg·kg－1·d－1、吡格列酮組:30mg·kg－1·d－1。非諾貝特和吡格列酮均溶于水后口服給藥，根據(jù)體重按1ml/100 g給藥，空白對照組和模型組給予等量的羧甲基纖維素。

1.3佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型的建立及給藥除空白組外，另3組18只大鼠，將大鼠右后跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1ml致炎，制成AA模型，致炎當(dāng)天記為0 d。治療組從0～21 d持續(xù)給藥。

1.4檢測指標(biāo)

1.4.1體重:所有大鼠每4天測量1次體重，從第0 ～21天。

1.4.2關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分:造模后12 d，每隔3～4 d對4組大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分: 0分:關(guān)節(jié)無紅腫; 1 分:小趾關(guān)節(jié)稍腫;2分:合足趾和趾關(guān)節(jié)腫脹;3分:踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹; 4分:包括踝關(guān)節(jié)全部足爪腫脹。把各個關(guān)節(jié)的積分累計起來，即為每只大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，每只大鼠分?jǐn)?shù)最高16分。

1.4.3足跟腫脹度的測定:分別于造模第0、5、9、13、17、20天使用足跖容積測量儀測量大鼠對側(cè)腳踝關(guān)節(jié)及足跖部腫脹，詳細(xì)記錄計算腫脹度(ml)。

1.5骨密度測量采用GE Lunar Prodigy型雙能X線骨密度儀分別于20 d檢測大鼠整體及左股骨為興趣區(qū)(ROI)的骨密度值(Bonemineral density，BMD)(g/cm2)和0～20 d檢測整體骨礦物質(zhì)含量(Bonemineral content，BMC，g/cm)，每組數(shù)據(jù)重復(fù)測量3次取平均值。

1.6 RT-PCR檢測細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況末次給藥后2 h，無菌分離滑膜組織，液氮中保存?zhèn)溆?。以TRIZOL提取組織中的總RNA，取1 μg總RNA配置逆轉(zhuǎn)錄反映體系，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板利用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。其中在PCR反應(yīng)中所使用的引物分別為: IL-1β:正義鏈，5’-CAAGTCTCCCACCAGCTCTGTA-3’，反義鏈，5’-GGGCTTCTTCAGCTTCTCCAA-3’; IL-6:正義鏈，5’-TTAAGTACATCCTCGGCAAAATCT-3’，反義鏈: 5’-CAGTGCCTCTTTGCTGTCTTCA’; IL-10:正義鏈，5’-CGGGAGGGTGAAGACTTTCT-3’，反義鏈，5’-GGCATCACCTCCTCCAAGTA-3’［6］。檢測按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。定量PCR采用的體系為: dNTPs 2 μl，10×buffer 5 μl，上下游引物各10 pmol，Pfu酶0.5 μl，模板2 μl，加三蒸水至總體積50 μl;擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94℃5min，進(jìn)入循環(huán)，變性94℃1min，退火60℃ 1min，延伸72℃3min，30個循環(huán)后，72℃延伸5min。以β-actin為內(nèi)參，依據(jù)2-ΔΔCT法計算各組細(xì)胞mRNA的相對表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1非諾貝特和吡格列酮對大鼠關(guān)節(jié)損傷程度的影響4組大鼠體重均有所增加，AA大鼠體重8 d達(dá)到高峰，之后隨之下降，模型對照組和吡格列酮組體重變化相似，非諾貝特組AA大鼠接受藥物治療12 d后，體重較模型對照組明顯增加(P＜0.05)。見圖1，表1。

圖1　4組大鼠體重

表1　4組大鼠體重　g

非諾貝特和吡格列酮用藥12 d后與模型對照組比較關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯降低，用藥12 d，16 d，20 d差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。非諾貝特組優(yōu)于吡格列酮組。見圖2，表2。

圖2　4組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分重

表2　4組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分

非諾貝特和吡格列酮用藥1～8 d時與同期空白

組和模型對照組相比，足腫脹無明顯變化，甚至有個別加重趨勢。待用藥后8 d后，非諾貝特和吡格列酮用藥AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度較模型組有降低趨勢，用藥12 d，16 d，20 d差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖3，表3。

圖3　4組大鼠腫脹度

表3　4組大鼠腫脹度　ml

2.2非諾貝特和吡格列酮對AA大鼠BMD和BMC的影響采用雙能X線骨密度儀檢測BMD和BMC的改變，非諾貝特組AA大鼠接受藥物治療20 d后，全身及ROI區(qū)骨密度較模型對照組明顯改善(P＜0.05)，吡格列酮組與模型對照組無顯著性差別。AA大鼠ROI區(qū)骨礦物質(zhì)含量(BMC)明顯降低，非諾貝特和吡格列酮治療后，AA大鼠BMC含量明顯增加(P ＜0.05)。見圖4、5，表4、5。

圖4　非諾貝特和吡格列酮對AA大鼠BMD的影響

表4　非諾貝特和吡格列酮對AA大鼠BMD的影響

圖5　非諾貝特和吡格列酮對AA大鼠BMC的影響

表5　非諾貝特和吡格列酮對AA大鼠BMC的影響　g/cm

2.3 PPAR激動劑對細(xì)胞因子的表達(dá)RT-PCR法檢測滑膜組織中IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)水平，模型對照組中IL-1β和IL-6的表達(dá)均高于空白組，非諾貝特和吡格列酮可使AA大鼠IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)降低。模型對照組中IL-10的含量顯著低于正常組，連續(xù)給藥21 d后，非諾貝特和吡格列酮可顯著提高IL-10mRNA水平的表達(dá)量。見圖6，表6。

圖6　非諾貝特和吡格列酮對IL-1β、IL-6和IL10mRNA表達(dá)的影響

表6　非諾貝特和吡格列酮對IL-1β、IL-6和IL-10mRNA表達(dá)的影響

3　討論

貝特類降脂藥和格列酮類降糖藥分別被確認(rèn)為是PPAR-α和PPAR-γ的特異性激活劑，同時它們對炎癥反應(yīng)的控制作用，也逐漸引起了人們的重視［7］。有關(guān)PPAR-α和PPAR-γ激活劑在關(guān)節(jié)炎中的抗炎作用報道極少。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織，以非化膿性炎癥為主的慢性自身免疫性疾?。?］。早期表現(xiàn)為關(guān)節(jié)明顯腫脹，滑膜紅腫，多侵犯小關(guān)節(jié)如手、腕和足，對稱性發(fā)生較多見。AA動物模型于是目前研究RA應(yīng)用較為廣泛的動物模型，普遍認(rèn)為AA在臨床表現(xiàn)、血清學(xué)特點(diǎn)和病理改變等方面與RA非常相似，是研究、篩選治療RA藥物常用的模型之一。IL-lβ是一種在RA患者關(guān)節(jié)滑液、滑膜組織和血液中均可測到的促炎因子［9］。IL-6是RA患者滑膜組織中存在較為廣泛的細(xì)胞因子，主要來源于成纖維樣滑膜細(xì)胞和B型滑液襯細(xì)胞，因此它的釋放與關(guān)節(jié)損傷直接相關(guān)［10］。IL-10是體內(nèi)最主要的抑炎性細(xì)胞因子，主要由Th2細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等分泌，抑制單核巨噬細(xì)胞的激活、粘附與遷移及炎癥因子的合成和釋放，減輕全身及關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)［11］。

本研究中，非諾貝特100mg·kg－1·d－1、吡格列酮30mg·kg－1·d－1可降低關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，如腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，并使AA大鼠體重上升。雙能X線骨密度儀檢測全身及ROI區(qū)BMD和BMC的變化，非諾貝特組全身及ROI區(qū)BMD較模型對照組明顯改善，吡格列酮組與模型對照組無顯著性差別。非諾貝特和吡格列酮治療后，AA大鼠BMC含量明顯增加。同時，非諾貝特和吡格列酮可使AA大鼠IL-1β 和IL-6mRNA的表達(dá)水平降低，顯著提高IL-10mRNA的表達(dá)水平。綜上所述，本研究結(jié)果提示非諾貝特和吡格列酮對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用，為其臨床用治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎提供有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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