王維庭 王雪梅 徐恒雁 呂良

清腸疏風(fēng)涼血膠囊的質(zhì)量標準研究

王維庭 王雪梅 徐恒雁 呂良

目的建立清腸疏風(fēng)涼血膠囊質(zhì)量標準。方法確立清腸疏風(fēng)涼血膠囊中黃芩、大黃、防風(fēng)、麩炒枳殼和黃連的薄層色譜法(TLC)方法,確立黃芩中黃芩苷含量測定的高效液相色譜法(HPLC)方法。色譜條件：安捷倫ZORBAX SB-C18；色譜柱(250mm×4.6mm；5 μm)；流動相：甲醇-水-磷酸(47：53：0.2)；流速：1.0ml/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μl。結(jié)果薄層色譜鑒別斑點顯示清晰；高效液相色譜法定量準確,陰性對照無干擾。黃芩苷的檢測濃度在0.105～1.575 μg,具有良好的線性關(guān)系(r2=0.9996),平均回收率為99.16%,RSD=0.70%(n=6)。結(jié)論本法簡單,可行,操作簡便,可以有效保證該制劑的質(zhì)量。

清腸疏風(fēng)涼血膠囊；質(zhì)量標準；薄層色譜法；高效液相色譜法

清腸疏風(fēng)膠囊為龍口中醫(yī)醫(yī)院研制的醫(yī)療機構(gòu)制劑,由炒槐花、黃芩、炒槐角、側(cè)柏炭、黃柏、黃連等15味中藥組成,具有清腸疏風(fēng)、涼血止血之功效,主要用于治療痔瘡,屬風(fēng)熱濕毒、傷及腸絡(luò)證等。在本文中作者主要采用薄層色譜法和高效液相色譜法制定了清腸疏風(fēng)涼血膠囊的質(zhì)量標準,從定性和定量兩個方面控制產(chǎn)品的質(zhì)量,保證了該制劑的質(zhì)量,保證患者用藥安全。現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DYQ-Ⅱ薄層點樣器； KQ3200DE 型超聲波處理器；Agilent 1260高效液相色譜儀；超純水處理器；1/100000分析天平(Mettler ToledoAB204-N)。

1.2 試藥 黃芩苷對照品(批號：110715-201436) ；色譜級甲醇。薄層色譜硅膠預(yù)制板(煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所),清腸疏風(fēng)涼血膠囊(規(guī)格：0.4 g/粒,自制)。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 黃芩的鑒別［1］取內(nèi)容物2 g,加乙酸乙酯與甲醇體積比為3:1的混合溶液30ml,加熱回流30min,將溶液放冷后過濾,并將濾液蒸干,蒸干后的濾液放冷后再加入5ml的甲醇使溶解,取其上清作為供試品溶液。同法制成陰性樣品溶液。再取漢黃芩素對照品,加甲醇制成0.5mg/ml的對照品溶液。吸取對照品溶液1 μl、供試品溶液和缺黃芩的陰性樣品溶液各2 μl,點在聚酰胺薄膜上,置甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇 (10：3： 2：1)中展開,取出,晾干,置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與漢黃芩素色譜相對應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性樣品無干擾。

2.1.2 大黃的鑒別 取內(nèi)容物6 g,加鹽酸溶液(3→20) 10ml,混勻,加入三氯甲烷30ml,加熱回流1 h,放冷,濾過,用分液漏斗分離取出三氯甲烷液,將三氯甲烷液蒸干,蒸干后的殘渣用2ml甲醇溶解,將其作為供試品溶液。同法制成缺大黃藥材的陰性樣品溶液。再取大黃對照藥材0.4 g,制成大黃對照藥材溶液。吸取大黃對照藥材溶液、供試品溶液和缺大黃的陰性樣品溶液各5 μl,點于同一硅膠G板上,置甲苯-甲酸乙酯-甲醇-水-甲酸(6：2：0.4：1：0.1)的上層溶液中展開,取出,晾干,放置于氨試液飽和30min的展開缸內(nèi)。供試品色譜在與大黃對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性樣品無干擾。

2.1.3 防風(fēng)的鑒別 取內(nèi)容物5 g,加入30ml甲醇,超聲25min,濾過,蒸干,殘渣加水20ml溶解,乙酸乙酯洗3次,每次20ml,棄去乙酸乙酯溶液,用水飽和的正丁醇提取2次,每次20ml,合并正丁醇溶液,蒸干,加2ml甲醇溶解,作為供試品溶液。同法制成缺防風(fēng)藥材的陰性樣品5 g。再取5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品,加甲醇制成1mg/ml的5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶液。吸取5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶液1 μl、供試品溶液及陰性樣品溶液各5 μl,點于同一硅膠G板上,置三氯甲烷-甲醇(4：1)中展開,取出,晾干,噴10%硫酸乙醇,加熱至顯色清晰,置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色斑點,陰性樣品無干擾。

2.1.4 枳殼的鑒別 取內(nèi)容物2 g,加入乙酸乙酯25ml,回流1 h,濾過,蒸干,殘渣加1ml甲醇溶解,作為供試品溶液。同法制成缺枳殼的陰性樣品溶液。取柚皮苷對照品,加甲醇制成1mg/ml的對照品溶液。吸取柚皮苷對照品溶液1 μl,供試品溶液及陰性對照溶液各5 μl,分別點于同一硅膠G板上,以乙酸乙酯-甲醇-水(100：17：13)為展開劑,展距約為5cm,再置甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20：10：1：1)的上層溶液的展開劑中,展開,取出,晾干,噴以三氯化鋁試液,置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜在與柚皮苷對照品色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色斑點,陰性樣品無干擾。

2.1.5 黃連的鑒別 取清腸疏風(fēng)涼血膠囊內(nèi)容物1 g,加入乙醇20ml,超聲25min,濾過,濃縮濾液至約2ml,作為供試品溶液。同法制成缺黃連的陰性樣品溶液。取黃連對照藥材0.5 g,同法制成對照藥材溶液。吸取黃連對照藥材溶液1 μl,供試品溶液及缺黃連的陰性對照溶液各5 μl,點于同一高效硅膠G板上,置環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3：3.5：1：1.5：0.5：1)及氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)進行展開,取出,晾干,置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜在與黃連對照藥材色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色斑點,陰性樣品無干擾。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18 色譜柱 (250mm×4.6mm,5 μm)；流動相：甲醇-水-磷酸(47：53：0.2)；檢測波長：280 nm；流速：1.0ml/min ；進樣量：10 μl。理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計算≥2500。

2.2.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品,精密稱定,加甲醇制成約20mg/ml的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品約1 g,精密稱定,加70%乙醇40ml,超聲處理30min,放冷,濾過,精密量取續(xù)濾液1ml,置5ml容量瓶中,加70%乙醇稀釋至5ml,取續(xù)濾液,即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取缺黃芩的陰性樣品,制成陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別吸取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定,結(jié)果顯示陰性對照無干擾。

2.3.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取相當對照品0.105、0.315、0.525、1.050、1.575 μg的對照品溶液,注入高效液相色譜儀,得回歸方程：Y=3485.8X+45.107,r2=0.9996,黃芩苷在0.105～1.575 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗 黃芩苷平均峰面積為3766.0,RSD= 0.03%,結(jié)果表明其精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 黃芩平均峰面積為2101.4,RSD=0.08%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗 精密稱取供試品6份,結(jié)果測定溶液中黃芩苷的平均含量為4.36mg/粒,RSD=0.98%,結(jié)果表明重復(fù)性試驗良好。

2.2.10 回收率試驗 取同批已知含量的樣品約0.5 g,精密稱定,取6份,分別加入黃芩苷5.0048mg(加入1ml含黃芩苷5.0048mg的溶液1.0ml) ,同法制成各試驗溶液,測定各樣品中黃芩苷的含量。結(jié)果顯示,本品回收率均在95.0%～105.0%,RSD=0.70%,回收率良好。

2.2.11 黃芩苷的含量測定 按上述色譜條件,共檢測9批本制劑樣品的黃芩苷含量,結(jié)果范圍在3.94～4.75mg/粒,考慮到差異,將本品黃芩苷含量限度定為每粒含黃芩苷 (C21H18O11)≥3.0mg。

3 討論

3.1 定性鑒別研究 清腸疏風(fēng)涼血膠囊是由15味藥組成的中藥制劑,成分復(fù)雜,因而在薄層色譜鑒別中對提取方法以及展開劑的選擇上具有很高的要求。作者對本制劑中的黃芩、黃柏、黃連、大黃、防風(fēng)、烏梅、荊芥、炒槐花等藥材分別進行了薄層色譜鑒別的研究,其中黃芩、黃連的鑒別效果好,薄層色譜清晰,陰性樣品無干擾,直接納入質(zhì)量標準中；大黃、防風(fēng)和麩炒枳殼在薄層色譜鑒別試驗中,因為分離效果不好,薄層色譜斑點不清晰,后來通過改變提取條件和展開劑系統(tǒng),也達到了滿意的效果,因此,大黃、防風(fēng)和麩炒枳殼也被納入標準；黃柏、烏梅、荊芥等其余藥材或因為陰性存在干擾或未顯示出有效特征斑點等原因,沒有納入該制劑的質(zhì)量標準中。結(jié)果表明,清腸疏風(fēng)涼血膠囊中黃芩、大黃、防風(fēng)、枳殼和黃連等5味藥采用文中薄層色譜方法進行定性鑒別,色譜特征斑點清晰,專屬性強,可用于該制劑的定性鑒別。

3.2 流動相系統(tǒng)的選擇 作者通過查閱相關(guān)的文獻,試驗了多種不同類型和比例的流動相系統(tǒng),結(jié)果樣品中黃芩苷的分離度不好,與其他色譜峰未分開,后經(jīng)進一步摸索和多次嘗試,發(fā)現(xiàn)用甲醇-水-磷酸(47：53：0.2)作為流動相,能夠得到滿意的特征色譜峰。

3.3 提取溶劑的選擇 通過預(yù)實驗,在供試品溶劑的制備中分別采用70%乙醇、75%乙醇和70%甲醇、75%甲醇進行提取。通過試驗結(jié)果表明,75%乙醇、70%甲醇和75%甲醇作為提取溶劑,黃芩苷與其他色譜峰的分離度不好,而采用70%乙醇作為提取溶劑,黃芩苷與其他雜質(zhì)分離度好,保留時間穩(wěn)定,黃芩苷的含量符合要求。

4 討論

疏風(fēng)涼血膠囊是在槐角丸基礎(chǔ)上結(jié)合臨床經(jīng)驗化裁而成,方中炒槐花性涼苦降,能清泄血分之熱,黃芩清熱燥濕,瀉火解毒,止血,共為君藥［2］。炒槐角清降泄熱之力較強,且能潤腸,常用于痔瘡腫痛出血之證,側(cè)柏炭性涼味澀,既能涼血,又能收斂止血,主要用于血熱妄行之證,黃柏、黃連清熱燥濕,涼血解毒,除腸中濕熱而止血,荊芥解表疏風(fēng),共為臣藥。地榆炭涼血止血、解毒斂瘡,大黃清熱瀉火,活血祛瘀,防風(fēng)祛風(fēng)解表、勝濕以祛外來之風(fēng),川芎活血行氣,祛風(fēng)止痛,與當歸配伍,可增強活血散瘀、行氣止痛之功,地黃清熱涼血,三藥理血行氣,烏梅治內(nèi)動之風(fēng),共為佐藥。麩炒枳殼下氣寬腸,引藥下行,為使藥。諸藥合用,使?jié)窕療崆?風(fēng)消血止,氣暢腑清,共湊清腸疏風(fēng)、涼血止血之功效。

本文作者主要對清腸疏風(fēng)涼血膠囊質(zhì)量標準進行了研究,確定了黃芩、大黃、防風(fēng)、麩炒枳殼和黃連5味藥材薄層色譜的鑒別方法,該方法簡單易行,專屬性強,可用于本品的定性檢測指標；采用高效液相色譜法,以黃芩苷作為清腸疏風(fēng)涼血膠囊含量測定的指標,在本色譜條件下特征峰不受雜質(zhì)峰的干擾,方法專屬性好,陰性無干擾。本標準所采用的供試品溶液制備方法簡單,定性和定量指標方法專屬性強、重現(xiàn)性好、靈敏度高,所建標準可用于本品的質(zhì)量控制。

［1］國家藥典委員會.中國藥典(一部).北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:322.

［2］趙志軍,王連水.小柴胡顆粒薄層鑒別及黃芩苷含量測定方法的研究.中國實驗方劑學(xué)雜志,2005,11(3):22-23.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.07.214

2015-11-06］

265701 龍口市中醫(yī)醫(yī)院(王維庭 呂良)；龍口市人民醫(yī)院(王雪梅 徐恒雁)