楊紅++張勇++田啟培等

摘要：以高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞為研究對象，構(gòu)建品種DNA池，PCR擴(kuò)增生長激素（GH）基因所有外顯子和部分內(nèi)含子序列，采用直接測序法對3個雞種的GH基因進(jìn)行多態(tài)性檢測，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測不同多態(tài)性位點(diǎn)對GH基因mRNA二級結(jié)構(gòu)的影響，旨在通過對貴州脛長差異較大的高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞GH基因的多態(tài)性及其生物信息學(xué)進(jìn)行分析，研究GH基因?qū)Σ煌u種脛骨發(fā)育的影響。結(jié)果表明：在高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞3個雞種GH基因中共檢測到8個SNPs位點(diǎn)，其中A1133G、G1166A位于第2內(nèi)含子區(qū)，C2027G、C2030T位于第4外顯子區(qū)，G2152A位于第4內(nèi)含子區(qū)，G3347A位于第5外顯子區(qū)，T3416C和C3436T位于3′非編碼區(qū)。生物信息學(xué)分析顯示位于外顯子區(qū)的3個SNPs均為同義突變，對GH基因的mRNA二級結(jié)構(gòu)有一定影響。

關(guān)鍵詞：DNA池；GH基因；脛骨長度；SNPs；高腳雞；矮腳雞；百宜黑雞

中圖分類號：S831.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2015）11-0038-04

收稿日期：2014-11-03

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃（編號：黔合科NZ字[2012]3007號）；貴州省農(nóng)業(yè)動植物育種專項(xiàng)（編號：黔農(nóng)育專字[2012]10號）；浙江大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（編號：2012XZZX003-1）。

作者簡介：楊紅（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閯游镞z傳育種與種質(zhì)資源創(chuàng)新。Email：15085933126@139.com。

通信作者：王芳芳，女，高級畜牧師，主要從事家禽遺傳育種及飼養(yǎng)管理工作。E-mail：1587676665@qq.com。貴州省地形復(fù)雜、地貌特殊，具有豐富的地方雞種資源，其中包括竹鄉(xiāng)雞、威寧雞、黔東南小香雞、高腳雞、矮腳雞、百宜黑雞等。高腳雞、矮腳雞、百宜黑雞均為貴州省特有的地方雞種，在體型外貌尤其是脛骨長度上存在較大差異。高腳雞是貴州省特有的地方品種，1982年錄入《貴州省畜禽品種志》，2006年錄入《中國畜禽資源名錄》，其脛骨比其他品種雞長3～4 cm，公雞平均脛長13.62 cm、母雞平均脛長 10.92 cm[1]。矮腳雞分布于貴州省黔西南州興義市，其脛長較普通雞短，公雞平均脛長6.5 cm、母雞平均脛長5.9 cm[2]，1993年錄入《貴州省畜禽品種志》。百宜黑雞為貴州優(yōu)質(zhì)地方雞種，主產(chǎn)地為貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鄉(xiāng)[3]，其脛骨長度介于高腳雞和矮腳之間。

雞生長激素（chiken growth hormone，cGH）是由垂體前葉合成和分泌的一種多肽類激素，由191個氨基酸組成。研究報(bào)道稱該激素在雞生長發(fā)育、骨骼生長、脂肪沉積、飼料轉(zhuǎn)化及產(chǎn)蛋等方面具有調(diào)節(jié)作用[4]。該基因位于1號染色體，全長近4 kb，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，且內(nèi)含子遠(yuǎn)大于外顯子[5-6]。國內(nèi)外學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)GH基因的多態(tài)位點(diǎn)對雞各類生長性狀有特定影響[7-10]。對于貴州省境內(nèi)部分雞種的GH基因已有相關(guān)研究，如朱麗莉等對興義矮腳雞GH基因的多態(tài)性研究中發(fā)現(xiàn)該雞種在第一內(nèi)含子區(qū)域存在較多變異[11]。黃波等在對貴州小香雞GH基因研究中，對GH基因2～3外顯子區(qū)域SNP位點(diǎn)進(jìn)行了檢測并開展了相關(guān)性分析[12]。本試驗(yàn)選擇脛骨長度差異較大的高腳雞、矮腳雞、百宜黑雞作為對象，研究GH基因的多態(tài)性，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在檢測GH基因在不同脛長性狀雞種中的差異，以期探究GH基因多態(tài)性與脛骨生長發(fā)育的關(guān)系，為進(jìn)一步研究影響脛骨發(fā)育機(jī)制的功能基因奠定工作基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動物高腳雞92個血樣采自貴州省安順市普定縣，矮腳雞99個血樣采自貴州省黔西南州興義市興牧畜禽水產(chǎn)科技服務(wù)中心矮腳雞養(yǎng)殖場，百宜黑雞69個血樣采自其中心產(chǎn)區(qū)貴州省貴陽市百宜鄉(xiāng)。每羽雞翅下靜脈采血2～3 mL于真空采血管中，肝素鈉抗凝，-20 ℃保存。

1.1.2主要試劑血液基因組DNA提取試劑盒、2×Taq Master Mix、核酸染料、DL2000 DNA Marker 等試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。實(shí)驗(yàn)室自備試劑為去離子水、無水乙醇、TAE緩沖液等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取、檢測及構(gòu)建DNA池運(yùn)用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，凝膠成像系統(tǒng)照相保存，并用紫外分光光度計(jì)測量DNA樣品濃度，每個樣品測量3次，取平均值。用ddH2O將所有DNA樣品調(diào)至100 ng/μL，各取10 μL構(gòu)建品種DNA池[13]，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增參照GenBank（登錄號為 NC_006114.3）提供的雞GH基因序列，運(yùn)用 Primer Premier 6.0 和 Oligo 6.0 設(shè)計(jì)引物，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列及擴(kuò)增條件如表1。

2結(jié)果與分析

2.1DNA提取結(jié)果

將提取的DNA用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可見，DNA條帶集中，整齊明亮無拖尾，可用于下一步試驗(yàn)。

2.2PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果

PCR產(chǎn)物用含核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2：所檢測片段與預(yù)期片段大小相符，條帶清晰、整齊無拖尾，PCR產(chǎn)物特異性較好，可用于進(jìn)一步測序分析。

2.3序列分析

在所擴(kuò)增的序列中共發(fā)現(xiàn)6個SNPs 位點(diǎn)：第2內(nèi)含子A1133G、G1166A，第4外顯子C2027G、C2030T，第4內(nèi)含子G2152A，第5外顯子G3347A，3′非編碼區(qū)T3416C、 C3436T（圖3）。

2.4等位基因頻率估算

從表2可見，3個雞種在A1133G、G1166A、C2027G、G2152A、C3436T這5個SNPs位點(diǎn)上基因頻率存在較大差異。

2.5GH基因所有外顯子RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

采用在線軟件 RNAfold web server分別對在GH基因外顯子中的3個 SNPs 位點(diǎn) mRNA進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果見圖4。

3討論

雞脛骨為全身長骨之一，其生長過程受到多種激素及細(xì)胞因子調(diào)控，且存在不同的信號通路。GH基因是調(diào)控禽類整個機(jī)體的重要激素，具有加快肌肉和骨骼生長、促進(jìn)生長發(fā)育及提高飼料報(bào)酬的作用[15-17]，也有研究報(bào)道稱GH基因可促進(jìn)雞長骨和軟骨的發(fā)育[18]。朱麗莉等對貴州個體較小的矮腳雞、小香雞的GH基因進(jìn)行了多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)較多變異位點(diǎn)，通過關(guān)聯(lián)性分析得到該基因?qū)w斜長、脛長、脛圍等生長性狀有一定的影響[11-12]。

本研究對脛長差異較大的高腳雞、矮腳雞和百宜黑雞的GH基因所有外顯子和部分內(nèi)含子進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)了8個可能與脛長性狀相關(guān)的SNPs位點(diǎn)，分別為A1133G、G1166A、C2027G、C2030T、G2152A、G3347A、T3416C、C3436T。其中C2027G、C2030T等2個SNPs位點(diǎn)位于第4外顯子區(qū)，G3347A位于第5外顯子區(qū)，3個位于外顯子區(qū)域的SNP位點(diǎn)均為同義突變。

各SNPs位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，在第2內(nèi)含子區(qū)A1133G處，只有高腳雞發(fā)生了突變，矮腳雞與百宜黑雞均未發(fā)生突變；第4內(nèi)含子G2152A處，高腳雞的優(yōu)勢堿基為G，矮腳雞與百宜黑雞的優(yōu)勢堿基則為A；3′非編碼區(qū)C3436T處，高腳雞未發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)，而矮腳雞、百宜黑雞卻存在突變。這表明高腳雞在A1133G、G2152A、C3436T這3個SNPs位點(diǎn)上與其他2個雞種存在較大差異，推測這2個SNPs位點(diǎn)可能對高腳雞脛骨長度有較大影響。在G1166A、C2027G位點(diǎn)處，矮腳雞發(fā)生突變的基因頻率與高腳雞和百宜黑雞差異較大，推測這2個SNPs位點(diǎn)可能與矮腳雞脛骨較短存在相關(guān)性。同時，在C2027G位點(diǎn)處，這3個貴州地方雞種的優(yōu)勢堿基均為G，而GenBank（登錄號為NC_006114.3）中所報(bào)道的則為C，這可能是貴州地方雞種的一個共同特征，同時也是貴州地方雞種與其他雞種之間所存在的普遍差異。

真核生物的基因一般由若干個外顯子和內(nèi)含子組成，為斷裂基因，外顯子的功能是構(gòu)成編碼區(qū)編碼功能蛋白，編碼區(qū)內(nèi)核苷酸的變異可能導(dǎo)致基因mRNA二級結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而影響其生物功能[15]。本研究中所檢測出的3個SNPs位點(diǎn)均未引起所編碼氨基酸改變，為同義突變。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所檢測到的3個SNPs位點(diǎn)均導(dǎo)致了GH基因mRNA二級結(jié)構(gòu)改變，使其最小自由能發(fā)生變化，從而影響mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。當(dāng)C2027G發(fā)生C→G突變后，GH基因mRNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能增加了167.894 kJ/mol，其穩(wěn)定性減弱；當(dāng)C2030T發(fā)生C→T突變后，GH基因mRNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能減少了2.51 kJ/mol，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加；當(dāng)G3347A發(fā)生G→T突變后，GH基因mRNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能增加了7.093 kJ/mol，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性減弱。GH基因突變與雞脛骨長度的關(guān)系及其引起的mRNA二級結(jié)構(gòu)變化所發(fā)生的生物學(xué)意義將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步加以研究。

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