張瑋亮， 秦 鵬， 呂善進(jìn)， 劉廣宇， 梁宏基　(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

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響應(yīng)面法優(yōu)化巴西蟲草多糖培養(yǎng)工藝

張瑋亮， 秦 鵬， 呂善進(jìn)， 劉廣宇， 梁宏基(廣州市微生物研究所，廣東廣州 510663)

冬蟲夏草(Cordyceossinensis)是我國(guó)傳統(tǒng)名貴的強(qiáng)壯滋補(bǔ)藥材，由于其生長(zhǎng)條件和寄生條件特殊，多長(zhǎng)于高原地區(qū)，加上近年來人們過度開采，生長(zhǎng)環(huán)境受到破壞，天然的蟲草非常緊缺[1]。天然冬蟲夏草以及人工冬蟲夏草的提取多糖經(jīng)成分分析發(fā)現(xiàn)其主要成分為甘露糖、半乳糖、葡萄糖等，為高度分枝的雜多糖[2]。蟲草多糖無色無味，具有良好的水溶性和穩(wěn)定性，無毒副作用，可以提高機(jī)體免疫力，抑制腫瘤和增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞吞噬能力，能應(yīng)用于醫(yī)療保健領(lǐng)域，目前已有相關(guān)研究[3]。

1988年廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所的研究人員采集到了一株蟲草菌種，經(jīng)鑒定為巴西蟲草(CordycesbrasilienesisHenn.),該菌株GC-88-4已保存于廣州市微生物研究所，并已有初步的研究[4]。近年來已有用正交設(shè)計(jì)法和單因素分析對(duì)巴西蟲草的液體培養(yǎng)基優(yōu)化的報(bào)道[5]。正交方法注重科學(xué)合理安排試驗(yàn)，可以同時(shí)考慮多個(gè)因素，但該方法的局限性在于不能綜合考慮多因素之間的交互作用，優(yōu)化出的工藝通常不是最優(yōu)方案。而Plackett-Burman和響應(yīng)面分析法的應(yīng)用則能綜合考慮到因素間的交互作用，目前已經(jīng)在微生物培養(yǎng)方法的優(yōu)化工作中開始使用，并已有成效。蔡友華等利用響應(yīng)面法對(duì)巴西蟲草培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，提高了其菌絲體生物量[6]。筆者選取9個(gè)對(duì)巴西蟲草生產(chǎn)菌株GC-88-4分泌多糖的因素進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選出對(duì)其分泌多糖有顯著影響作用的因子，再使用響應(yīng)面中心組合的分析方法，通過數(shù)據(jù)分析，得出回歸方程并解得最優(yōu)條件，在500 L規(guī)模進(jìn)行中試發(fā)酵試驗(yàn)，并進(jìn)行驗(yàn)證，為日后的研究提供幫助。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種。巴西蟲草生產(chǎn)菌GC-88-4為廣州市微生物研究所保藏。

1.1.2培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，酵母粉10.0 g/L,MgSO4·7H2O 3.0 g/L,KH2PO43.0 g/L,(NH4)2SO410.0 g/L,pH 6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：米粉15.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，蠶蛹水解物10.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，pH 7。固體斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨20.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂粉20.0 g/L，pH 7。

1.1.3儀器設(shè)備。752型分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；pHS-25 數(shù)顯酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；50、500 L不銹鋼發(fā)酵罐(上海洋格生物工程設(shè)備有限公司)。

1.2菌株培養(yǎng)方法及樣品處理蟲草斜面活化后，轉(zhuǎn)接入500 ml種子搖瓶中，每瓶裝液量為100 ml，培養(yǎng)條件為200 r/min、28 ℃，培養(yǎng)26 h后以5%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵搖瓶中，每瓶裝液量為100 ml，200 r/min、28 ℃培養(yǎng)7 d，按照如下步驟進(jìn)行樣品處理。將發(fā)酵液4 000 r/min離心，棄去上清，于60 ℃烘干。稱量2 g樣品粉末，加入80 ml純化水后加熱煮沸1 h，過程中適量補(bǔ)水，最終定容至80 ml，過濾取上清5 ml濾液加入20 ml乙醇，于4 ℃靜置，4 000 r/min離心得粗多糖產(chǎn)物。

1.3蟲草多糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法[7]。

1.3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.06 g，并加水溶解定容至250 ml，配成0.24 mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml置于25 ml比色管中，加水補(bǔ)足至1 ml，并加入新鮮配制的5%苯酚溶液1.5 ml，濃硫酸7.5 ml，水浴煮沸15 min，補(bǔ)水至10.0 ml，于488 nm下測(cè)定吸光度，并制作葡萄糖含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2樣品測(cè)定。按照“1.2”中方法處理樣品后，用水溶解粗多糖產(chǎn)物，定容至10 ml，取0.1 ml至25 ml比色管，加水至1 ml，按照“1.3.1”方法顯色，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，乘以稀釋倍數(shù)，測(cè)得多糖含量。

1.4培養(yǎng)基優(yōu)化方法

1.4.1Plackett-Burman法篩選影響產(chǎn)多糖的重要因素。歸納影響巴西蟲草分泌多糖含量的可能因素為米粉、葡萄糖、蠶蛹水解物、硫酸二氫鉀、硫酸鎂、初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量以及接種齡9個(gè)因素， Design Expert軟件運(yùn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8]見表1，按照設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)并根據(jù)反饋數(shù)據(jù)的P值確定各因素的顯著水平。

表1　Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.2中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。對(duì)Plachett-Burman試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析可知，米粉、葡萄糖、硫酸鎂3個(gè)因子是影響巴西蟲草分泌多糖的顯著因素(P<0.05)，因此其余因素不變，將這3個(gè)因素作為中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)研究對(duì)象進(jìn)行爬坡試驗(yàn)，然后以巴西蟲草分泌的多糖含量作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)，根據(jù)Design Expert軟件設(shè)計(jì)出的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)得出最優(yōu)條件。中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平以及編碼見表2。

2結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman法篩選影響巴西蟲草分泌多糖的重要因素以巴西蟲草分泌的多糖含量為響應(yīng)值分別對(duì)米粉、葡萄糖、蠶蛹水解物、硫酸鎂、硫酸二氫鉀、初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量以及接種齡9個(gè)因子進(jìn)行計(jì)算，得出各因子的顯著水平。按試驗(yàn)因素的水平，利用Plackett-Burman進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)出的試驗(yàn)共進(jìn)行12次，根據(jù)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)得到相應(yīng)的巴西蟲草分泌多糖含量，試驗(yàn)結(jié)果見表3。根據(jù)其P值得出各因素顯著性結(jié)果，具體數(shù)據(jù)見表4。

表2　中心組合試驗(yàn)因素水平編碼　g/L

表3　Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)以及試驗(yàn)結(jié)果

表4　Plackett-Burman試驗(yàn)因素效應(yīng)分析

由表4可知，因素B、C、F的P值均小于0.05，因此可以認(rèn)為米粉、葡萄糖、硫酸鎂是影響巴西蟲草分泌多糖含量的顯著因子。選擇上述3個(gè)因素作為主要研究因子進(jìn)行中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)，其余因子則根據(jù)其在Plackett-Burman試驗(yàn)中相應(yīng)的T值正負(fù)效應(yīng)選取高水平或低水平，分別為：磷酸二氫鉀、初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量和接種齡為高水平，蠶蛹水解物為低水平，即以后優(yōu)化培養(yǎng)基為磷酸二氫鉀(2.0 g/L)、初始pH(7)、培養(yǎng)溫度(28 ℃)、接種量(10%)、接種齡(26 h)、蠶蛹水解物(10.0 g/L)。

2.2響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)

2.2.1最陡爬坡篩選試驗(yàn)。從Plackett-Burman試驗(yàn)分析的結(jié)果可知，對(duì)巴西蟲草分泌多糖影響最顯著的因子為米粉、葡萄糖和硫酸鎂，因此主要對(duì)這3個(gè)因子進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，其余因子選擇Plackett-Burman試驗(yàn)中的中心點(diǎn)值，并確定出這3個(gè)因子的步長(zhǎng)。分析Plackett-Burman試驗(yàn)中的結(jié)果，計(jì)算得出米粉、葡萄糖和硫酸鎂的步長(zhǎng)，并設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)參數(shù)見表5，以分泌多糖的含量作為響應(yīng)值進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

由表5可知，6組試驗(yàn)中，第4組中巴西蟲草分泌多糖含量達(dá)6.5 mg/ml,在試驗(yàn)組橫向比較中含量最高。因此，選擇第4組數(shù)據(jù)的參數(shù)作為中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表5　最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。分別設(shè)定因素A、B、C代表最陡爬坡試驗(yàn)中3個(gè)主要顯著因素米粉、葡萄糖、硫酸鎂，設(shè)每組試驗(yàn)分泌的多糖含量為響應(yīng)值Y，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素水平，運(yùn)行軟件設(shè)計(jì)得出中心組合試驗(yàn)，根據(jù)20組試驗(yàn)條件進(jìn)行試驗(yàn)并測(cè)定各試驗(yàn)組多糖含量，表6為試驗(yàn)設(shè)計(jì)及運(yùn)行結(jié)果。

表6　中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert軟件的分析功能對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到的編碼回歸方程為：

Y=6.53+0.33×A+0.32×B-0.27×C-0.30×A×B+0.19×A×C+0.24×B×C-0.61×A2-0.37×B2-0.50×C2

該模型總P值等于0.000 1，說明模型回歸顯著，R2越大，表明該模型預(yù)測(cè)值越精準(zhǔn)，試驗(yàn)中R2為0.928 3，表明該模型擬合良好，模型中Adj-R2為0.863 8，只有13.62%的變異超出該模型解釋范圍，證明該模型基本可靠。試驗(yàn)中一次項(xiàng)和二次項(xiàng)的P值都是顯著的，而交互項(xiàng)則不顯著，說明三因素間交互作用不明顯。試驗(yàn)中的變異系數(shù)(CV%)為5.18，變異系數(shù)越低表明試驗(yàn)可靠性越高。試驗(yàn)信噪比為11.126，大于4的信噪比說明試驗(yàn)中的因子都具有較強(qiáng)的信號(hào)。

使用Design Expert軟件根據(jù)試驗(yàn)參數(shù)繪制分析結(jié)果響應(yīng)面圖，如圖1～3所示，可以看出該模型等高線圖為橢圓形，具有中心點(diǎn)，因此能得出最優(yōu)解，利用軟件進(jìn)行分析求得若要分泌多糖含量最高則該3個(gè)因素為米粉(29.5 g/L)、葡萄糖(7.3 g/L)、硫酸鎂(1.1 g/L)。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)為證實(shí)預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間的擬合程度是否符合預(yù)期，使用優(yōu)化后培養(yǎng)條件對(duì)相同的生產(chǎn)菌株進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)：米粉(29.5 g/L)、葡萄糖(7.3 g/L)、硫酸鎂(1.1 g/L)、磷酸二氫鉀(2.0 g/L)、初始pH(7)、培養(yǎng)溫度(28 ℃)、接種量(10%)、接種齡(26 h)、蠶蛹水解物(10.0 g/L)，試驗(yàn)共進(jìn)行3組，試驗(yàn)結(jié)果分別為6.4、6.7、6.7 mg/ml，平均多糖含量為6.65 mg/ml，表明預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間有很好的擬合性，且比優(yōu)化前的多糖產(chǎn)量提高58.4%。

2.4發(fā)酵中試試驗(yàn)為驗(yàn)證優(yōu)化的條件是否適合放大生產(chǎn)并確定該模型可靠性，使用優(yōu)化后條件在500 L規(guī)模的發(fā)酵罐上進(jìn)行放大驗(yàn)證性發(fā)酵試驗(yàn)。除上述條件外，其余條件發(fā)酵培養(yǎng)分別為攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，通風(fēng)量15 m3/h，罐壓保持在0.6 MPa。發(fā)酵罐培養(yǎng)運(yùn)作7 d后放罐處理，根據(jù)相同的檢測(cè)方法測(cè)得多糖含量達(dá)7.2 mg/ml，明顯高于搖瓶中的結(jié)果，推測(cè)其可能原因在于發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中規(guī)模大的發(fā)酵罐提供溶氧水平高，而大型真菌類多數(shù)需要高溶氧提供生長(zhǎng)所需要的耗氧，因此更利于菌體生長(zhǎng)，同時(shí)代謝出的多糖產(chǎn)物更多。

3結(jié)論

國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者通過使用響應(yīng)面的方法優(yōu)化培養(yǎng)條件，并取得成功，該試驗(yàn)通過使用Plackett-Burman設(shè)計(jì)方法篩選出對(duì)巴西蟲草分泌多糖影響的顯著因子，根據(jù)分析使用中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)顯著因子進(jìn)行優(yōu)化，采用多元二次回歸方程，通過軟件求偏導(dǎo)解出最優(yōu)解。優(yōu)化后培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基為：米粉(29.5 g/L)、葡萄糖(7.3 g/L)、硫酸鎂(1.1 g/L)、磷酸二氫鉀(2.0 g/L)、初始pH(7)、培養(yǎng)溫度(28 ℃)、接種量(10%)、接種齡(26 h)、蠶蛹水解物(10.0 g/L)。使用優(yōu)化后培養(yǎng)條件進(jìn)行試驗(yàn)搖瓶多糖含量達(dá)到6.65 mg/ml，比優(yōu)化前含量提高了58.4%，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件有利于GC-88-4的生長(zhǎng)以及多糖含量的合成與分泌。為驗(yàn)證預(yù)期模擬值與真實(shí)值的擬合程度以及放大生產(chǎn)是否可行，進(jìn)行500 L規(guī)模發(fā)酵罐放大中試試驗(yàn)，使其接種量達(dá)到10%，最終發(fā)酵液中多糖含量檢測(cè)能達(dá)到7.2 mg/ml。通過試驗(yàn)驗(yàn)證，經(jīng)過響應(yīng)面中心組合方法優(yōu)化后的培養(yǎng)基實(shí)際值與軟件理論值擬合良好，表明該方法在培養(yǎng)基優(yōu)化中能起到指導(dǎo)作用，具有重大意義。

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摘要[目的]利用響應(yīng)面分析方法的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)巴西蟲草生產(chǎn)菌株分泌多糖的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以得到提高產(chǎn)量的最優(yōu)條件。 [方法]使用Plackett-Burman分析和響應(yīng)面中心組合分析法對(duì)巴西蟲草生產(chǎn)菌株GC-88-4進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化。[結(jié)果]9個(gè)有可能影響巴西蟲草分泌多糖產(chǎn)量的因素經(jīng)過響應(yīng)面中心組合方法分析后得出3個(gè)最顯著的影響因子，分別為米粉、葡萄糖和硫酸鎂，優(yōu)化后米粉含量為29.5 g/L，葡萄糖為7.3 g/L,硫酸鎂為1.1 g/L，巴西蟲草生產(chǎn)菌株在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件中分泌多糖平均含量達(dá)到6.65 mg/ml，優(yōu)化后培養(yǎng)條件在500 L發(fā)酵罐所分泌的巴西蟲草多糖含量達(dá)到7.2 mg/ml。 [結(jié)論]經(jīng)優(yōu)化后巴西蟲草多糖含量提高58.4%，而且優(yōu)化結(jié)果穩(wěn)定，為放大生產(chǎn)提供了指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞巴西蟲草多糖；培養(yǎng)基條件優(yōu)化；響應(yīng)面分析法；中心組合分析

Optimization of Culture Procedure for Polysaccharides inCordycepsbrasiliensisby Response Surface Analysis

ZHANG Wei-liang, QIN Peng, LV Shan-jin et al(Guangzhou Institute of Microbiology, Guangzhou, Guangdong 510663)

Abstract[Objective] Using response surface analysis (RSA) method to optimize the culture procedure for purpose of improving the production of polysaccharides in Cordyceps brasiliensis.[Method] Plackett-Burman factorial design was used to assess the significance of nine different culture procedure factors on the production of polysaccharides-produntion strain GC-88-4, the response surface analysis was applied to optimize the culture procedure. [Result] After analyzed factors, rice powders, glucose, and magnesium sulfate were proved to be the most significant variables. As the experiment results implied, using the optimal conditions the average content of polysaccharides was improved to 6.65 mg/ml, and the optimal condition was as follow: rice powders is 29.5 g/L, the glucose is 7.3 g/L and the magnesium sulfate is 1.1 g/L. The optimal culture procedure was being tested in a 500 L scale fermentation experiment and the content of polysaccharides can reached 7.2 mg/ml. [Conclusion] As the experiment results indicated, comparing with the unoptimized culture conditions the culture production of polysaccharides was increased by 58.4%, and its procedure can be used in large scale fermentation.

Key wordsCordyceps brasiliensis polysaccharides; Culture conditions optimization; Response surface analysis; Central composite design experiment

收稿日期2015-05-05

作者簡(jiǎn)介張瑋亮(1988- )，男，廣東廣州人，工程師，從事微生物發(fā)酵研究。

中圖分類號(hào)S 188；TS 202.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)18-052-04