孫 雨，王曉英，董 浩，曲 萍，胡冬梅，趙柏林，石 慧，宋曉暉

（中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京102600）

產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素基因與相關(guān)疫苗的研究進展

孫 雨，王曉英，董 浩，曲 萍，胡冬梅，趙柏林，石 慧，宋曉暉

（中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京102600）

產(chǎn)氣莢膜梭菌也稱魏氏梭菌，是引起氣性壞疽、腸毒血癥、出血性腸炎等反芻動物疾病的主要病原。該菌能夠分泌α、β、ε、ι、γ、η、θ、κ、λ、μ、ν等多種外毒素，其中a、β、ε、ι毒素是主要的致病因子。產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疾病通常發(fā)病急、死亡快，因此，疫苗免疫是預(yù)防該病的主要方法。近年來，隨著對a、β、ε等毒素功能研究的深入，研究毒素相關(guān)的基因工程亞單位疫苗成為研究熱點，并且有望彌補傳統(tǒng)類毒素疫苗的安全性不高、穩(wěn)定性差等缺點。文章從產(chǎn)氣莢膜梭菌的病原學(xué)特點、主要外毒素的致病機制以及毒素相關(guān)疫苗的研究進展進行綜述，以期為產(chǎn)氣莢膜梭菌的綜合防控和基因工程亞單位疫苗與核酸疫苗的研發(fā)提供一定的參考。

產(chǎn)氣莢膜梭菌；外毒素；致病機制；疫苗

產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringens）是臨床上氣性壞疽病原菌中最多見的一種梭菌，因能分解肌肉和結(jié)締組織中的糖，產(chǎn)生大量氣體，導(dǎo)致組織嚴(yán)重氣腫，繼而影響血液供應(yīng)，造成動物機體組織大面積壞死，加之此菌在體內(nèi)能形成莢膜，故名產(chǎn)氣莢膜梭菌［1］。該菌是由英國科學(xué)家Welchii和Nuttad首先從一位死亡8 h后的病人體內(nèi)分離得到，并以發(fā)現(xiàn)者Welchii的名字來命名［2］。產(chǎn)氣莢膜梭菌主要的致病因是其分泌的外毒素，目前已經(jīng)分離到的外毒素有13種，其中α、β、ε和ι是最主要的毒素因子，根據(jù)這幾種外毒素的不同，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D和E等5個血清型。反芻動物的氣性壞疽、腸毒血癥、出血性腸炎、牛羊猝死癥、羔羊痢疾均是由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起［3］。產(chǎn)氣莢膜梭菌作為腸道正常菌群的一種，普遍存在于動物和人的腸道內(nèi)，在正常情況下并不致病，但在動物感染大量病原菌，并且應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致機體抵抗力降低時等，腸道內(nèi)的產(chǎn)氣莢膜梭菌會大量繁殖，同時會產(chǎn)生大量外毒素，外毒素進入血液循環(huán)引發(fā)的毒血癥對機體器官組織造成損傷，并且引起動物死亡。由該菌導(dǎo)致的疫病具有發(fā)病急、病程短、死亡率高等特點，藥物治療很難達到效果，因此疫苗預(yù)防是控制該病的主要手段。80年代初，我國成功研制出產(chǎn)氣莢膜梭菌病的單價苗和多聯(lián)滅活疫苗，在預(yù)防由于產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疫病方面發(fā)揮了重要作用。但在疫苗生產(chǎn)過程中，毒素的產(chǎn)生量對培養(yǎng)時間、溫度、接種量以及培養(yǎng)基質(zhì)量有著較高的要求，而且傳統(tǒng)疫苗還存在安全性不高、穩(wěn)定性差等缺點，因此，開發(fā)一種能夠預(yù)防多種產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的基因工程多價亞單位疫苗或者核酸疫苗成為產(chǎn)氣莢膜梭菌病防控技術(shù)中迫切需要解決的問題。

1 病原特征

1.1 病原的基本特征

產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌體較大，為革蘭氏陽性粗短大桿菌，無鞭毛，有芽孢，有莢膜。該菌厭氧不嚴(yán)格，芽孢呈橢圓形，位于次級端。菌落直徑2～5 mm，血瓊脂平板上有溶血圈，糖發(fā)酵能力強，能產(chǎn)酸產(chǎn)氣。在牛乳培養(yǎng)基中呈暴烈發(fā)酵現(xiàn)象是本菌的特征之一。產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠產(chǎn)生α、β、ε、ι、γ、η、θ、κ、λ、μ、ν等12種外毒素，產(chǎn)生的外毒素能夠損傷細胞膜、血管內(nèi)皮細胞并使糖類分解，發(fā)生細胞壞死、組織水腫、充氣等病變［4］。菌株可產(chǎn)生腸毒素，能引起食物中毒，細菌DNA中的G+C分子含量為24%～27%。該菌廣泛存在于土壤、人和動物的腸道以及動物和人類的糞便中，會散發(fā)臭味，動物機體常因深部創(chuàng)傷而感染。此外，產(chǎn)氣莢膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犢、仔豬、家兔、雛雞等的壞死性腸炎等［5］。

1.2 病原的發(fā)病機制

產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病條件與肉毒梭菌和破傷風(fēng)梭菌相似。雖然產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的毒素的毒性不如肉毒梭菌和破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生的毒素強，但是由于產(chǎn)生毒素的種類多，以及具有卵磷脂酶、纖維蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、膠原酶和DNA酶等多種對細胞有毒性作用的酶，使產(chǎn)氣莢膜梭菌具有很強的侵襲力［6］。根據(jù)細菌產(chǎn)生α、β、ε和ι等外毒素的種類差別，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分成A、B、C、D、E五個型。A型菌主要產(chǎn)生α外毒素，能引起動物的壞死性腸炎、腸毒血癥，B型菌產(chǎn)生的毒素主要為α、β、ε三種外毒素，可引起羔羊痢疾、山羊、綿羊及馬屬動物的腸毒血癥，C型菌主要產(chǎn)生α、β兩種外毒素，能引起人和家畜壞死性腸炎、反芻類動物的腸毒血癥、羊猝狙等，D型菌主要產(chǎn)生α、ε兩種外毒素，可以引起反芻動物的腸毒血癥，E型菌主要引發(fā)動物的腸炎。

2 產(chǎn)氣莢膜梭菌主要毒素基因的研究進展

2.1 α毒素基因（plc）

α毒素是產(chǎn)氣莢膜梭菌所有毒素基因中最重要的一種外毒素，A、B、C、D、E等5個型的細菌均可產(chǎn)生該毒素。編碼α毒素的基因plc位于染色體上，大小為1194bp，可以編碼398個氨基酸，分子量為42.5 Ku，其中成熟肽和信號肽分別由370個氨基酸和28個氨基酸組成。目前國內(nèi)外學(xué)者對α毒素基因的功能及其致病機理研究較多。Kalender等［7］研究發(fā)現(xiàn)，卵磷脂酶C是該毒素的主要致病因子，它是一種依賴于鋅離子的多功能性金屬酶，具有鞘磷脂酶和磷脂酶C兩種因子的活性，因此，α毒素能同時水解磷脂酰膽堿和鞘磷脂這兩種組成細胞膜的固有成分。α毒素的致病機理就是依靠這兩種酶活性，將細胞膜的膜磷脂進行水解，從而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞快速裂解死亡。α毒素具有“熱-冷”溶解現(xiàn)象，當(dāng)把α毒素加熱至70℃左右時，可以使毒素的溶血活性喪失，100℃時，其部分活性又可恢復(fù)。α毒素的活性可以被EDTA和乙醚偶聯(lián)的磷脂酰膽堿抑制。此外，α毒素對胰酶敏感，接觸后容易喪失活性。α毒素基因相對保守，雖然不同菌株之間有1.3%的核苷酸以及1.2%的氨基酸序列不同，但這些核苷酸與編碼氨基酸的不同并不影響α毒素本身的活性。此外，各梭菌產(chǎn)生的α毒素均有一定的同源性，具有相同的特異性。α毒素基因的啟動子能被大腸桿菌的RNA聚合酶所識別，因而α毒素在自身啟動子下不僅可在產(chǎn)氣莢膜梭菌本身中高效表達，也可在大腸桿菌中得到高效表達。近幾年來，對α毒素基因組中同毒素相關(guān)的氨基酸的研究取得了一定的進展，研究發(fā)現(xiàn)，α毒素中第68位上的組氨酸殘基對毒素活性至關(guān)重要，若其殘基被其它氨基酸殘基取代，即可喪失其全部的活性與毒性。

2.2 β毒素基因（cpb）

β毒素可分為β1和β2毒素兩種類型，兩者同源性并不高。編碼β1毒素的cpb 1基因位于質(zhì)粒上，與葡萄球菌的γ毒素有30%核苷酸同源，分子量為34.5 Ku。β1毒素是一種穿孔毒素，可以損傷多種宿主細胞的細胞膜（如腸上皮細胞、內(nèi)皮細胞等）。此外，通過影響鈣離子在神經(jīng)細胞膜內(nèi)的分布，β1毒素可以影響神經(jīng)組織的功能，破壞正常的神經(jīng)傳導(dǎo)。該毒素對于胰酶的蛋白水解活性高度敏感，接觸后容易失活。β2毒素是一種新近報道的毒素。目前發(fā)現(xiàn)從患有壞死性腸炎、小腸結(jié)腸炎的牛羊及腹瀉犬的腸內(nèi)容物分離到的產(chǎn)氣莢膜梭菌均可以產(chǎn)生β2毒素。編碼該毒素的基因cpb 2位于質(zhì)粒，分子量為28.5 Ku［8］。研究發(fā)現(xiàn)該毒素具有細胞毒性。

2.3 ε毒素基因（etx）

ε毒素僅見于B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌中，是牛羊產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病的主要致病因子。編碼ε毒素的基因etx位于質(zhì)粒上，大小為987 bp，分子量為32.7 Ku。ε毒素基因所翻譯的蛋白前體在分泌初期并不表現(xiàn)毒性，蛋白合成后通過蛋白酶去除毒素前體N端的13個氨基酸和C端22個氨基酸后成為有毒性的成熟肽。ε毒素能夠作用于真核細胞膜上的膽固醇和鞘脂，具有明顯的細胞毒素作用［9］。ε毒素對不同細胞的敏感性不同，研究發(fā)現(xiàn)，ε毒素MDCK和G402細胞特別敏感。ε毒素是一種通透酶，能夠造成動物上皮細胞和內(nèi)皮細胞的通透性增加，導(dǎo)致毒素滲入機體器官，同時該毒素還能通過影響細胞骨架的功能而發(fā)揮毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)，C末端氨基酸殘基是毒素蛋白活性的關(guān)鍵，不同酶切產(chǎn)生的N、C末端氨基酸殘基，產(chǎn)生的毒素蛋白的毒性也不相同。其中蛋白經(jīng)過胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶切后毒素的毒力最強。近幾年來，國內(nèi)外學(xué)者對ε毒素研究較多，研究發(fā)現(xiàn)，ε毒素能夠與大鼠突觸小體上的受體結(jié)合形成七聚體復(fù)合物，該復(fù)合物能夠?qū)е录毎ねㄍ感愿淖?，使得大量的鉀離子外溢，從而細胞內(nèi)的鈉離子和氯離子濃度快速升高，有害物質(zhì)快速進入機體細胞，導(dǎo)致細胞毒性甚至發(fā)生細胞死亡或者凋亡［10］。此外，對ε毒素基因組中關(guān)鍵性毒素基因研究發(fā)現(xiàn)，將毒素蛋白序列中的唯一組氨酸定向突變?yōu)樯彼釟埢?，可?dǎo)致毒素對小鼠失去毒性［11］。

2.4 ι毒素基因（itx）

ι毒素主要由E型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生。ι毒素是一種二元毒素，編碼基因Iap和Ibp全部位于質(zhì)粒上，分子量為47.5 Ku。ι毒素由一個靶細胞結(jié)合部分（Ib）和一個酶激活部分（Ia）兩個亞單位組成，其中Ia是毒性基因，Ib是結(jié)合基因。Ia毒素蛋白與肉毒梭菌的C2毒素作用類似，是一個ADP-核糖基化毒素，可以造成宿主細胞內(nèi)肌動蛋白的核糖基化，從而造成細胞骨架的破壞和感染細胞的死亡［12］。目前對ι毒素蛋白的研究較少，毒素作用機制還不清楚。有研究認為，毒素與細胞表面的特異性受體結(jié)合后，Ib基因編碼的蛋白在細胞膜表面形成一個孔道后，Ia基因編碼的蛋白進入細胞，進而發(fā)揮毒性作用。

2.5 其他毒素基因研究進展

產(chǎn)氣莢膜梭菌除了以上5種主要的毒素之外，還可分泌一些其它的毒素，如θ毒素、腸毒素、κ毒素、μ毒素和唾液酸酶等。產(chǎn)氣莢膜梭菌形成芽孢時通常會形成并且釋放腸毒素。腸毒素是一條單鏈的多肽，分子量為35Ku。編碼腸毒素的基因cpe可同時位于質(zhì)粒上，也可位于染色體上。腸毒素的氨基端發(fā)揮細胞毒性作用，羧基端與細胞膜上的受體結(jié)合有關(guān)［13］。θ毒素是一種膽固醇結(jié)合溶細胞素，也叫做產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素，該毒素對氧較為敏感，各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均能產(chǎn)生θ毒素。編碼θ毒素為pfo A基因，該基因位于染色體上。pfo A基因編碼的蛋白質(zhì)共有527個氨基酸，其中信號肽為27個氨基酸組成，成熟肽為500個氨基酸組成［14］。θ毒素能夠結(jié)合在細胞膜上，并在膜表面形成一個小孔，造成細胞穿孔死亡。κ毒素是由產(chǎn)氣莢膜梭菌col A基因編碼的一種膠原酶前體，去除信號肽后成為膠原酶，除了信號肽序列外，在信號肽序列中還發(fā)現(xiàn)了一個膠原酶的底物序列，由此推測該蛋白前體的活化方式可能是自我催化激活。μ毒素是一種透明質(zhì)酸酶，它的作用是有助于菌體細胞在組織中的擴散。唾液酸酶主要作用于真核細胞壁上糖復(fù)合物的唾液酸殘基，可以造成細胞間基質(zhì)的破壞［15］。

3 產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗研究進展

3.1 傳統(tǒng)疫苗研究進展

傳統(tǒng)疫苗主要有單價疫苗、滅活疫苗和多聯(lián)疫苗。單價疫苗是利用同一致病微生物的單一血清型菌、毒株的增殖培養(yǎng)物制備的疫苗。目前我國已經(jīng)研制出腸毒血癥和羔羊痢疾等單價疫苗。不同微生物或其代謝產(chǎn)物組成的疫苗稱為聯(lián)合疫苗或聯(lián)苗。近些年來國外的疫苗生產(chǎn)廠商相繼研究出了產(chǎn)氣莢膜梭菌的四聯(lián)、五聯(lián)、七聯(lián)和八聯(lián)苗，這些聯(lián)苗不僅把各種亞型的梭菌苗聯(lián)合起來進行防疫，而且還把梭菌苗與沙門氏桿菌、巴氏桿菌、大腸桿菌等菌苗聯(lián)合起來，甚至可以與病毒苗聯(lián)合起來進行防疫。目前我國已經(jīng)有了羊黑疫、快疫二聯(lián)苗，羊猝狙、羊快疫二聯(lián)苗，快疫、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)苗。近幾年我國還研制出了羔羊痢疾、羊快疫、腸毒血癥、羊猝狙、羊黑疫五聯(lián)苗，并取得一定預(yù)防疾病的效果。傳統(tǒng)疫苗在治療和預(yù)防反芻動物因產(chǎn)氣莢膜梭菌感染而引起的疾病方面雖然取得了一定的成果，但是這些疫苗在臨床使用過程中仍然暴露了一些不足，例如單價苗難以抑制各種亞型細菌的混合感染，多聯(lián)苗免疫易引起動物的副反應(yīng)等。

3.2 基因工程亞單位疫苗研究進展

基因工程亞單位疫苗又稱生物合成亞單位疫苗或重組亞單位疫苗，是指將保護性抗原基因在原核或真核細胞中表達，并以基因產(chǎn)物、蛋白質(zhì)或多肽制成疫苗。這種類型疫苗的優(yōu)點是安全性高，穩(wěn)定性好，純度和產(chǎn)量高，同時還可將多種致病毒素通過基因工程手段連接在一起構(gòu)建新的毒素蛋白進行表達。基因工程亞單位疫苗可以通過調(diào)整基因組合使之表達成顆粒性結(jié)構(gòu)，在體外加以聚團化，包入脂質(zhì)體或膠囊微球，或加入有免疫增強作用的化合物（佐劑）來增強免疫效果。用于基因亞單位疫苗生產(chǎn)的表達系統(tǒng)主要有大腸埃希氏菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳類細胞、轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動物等。Pilehchian等［11］嘗試將產(chǎn)氣莢膜梭菌的ε和β基因進行了融合，并部分表達出與天然蛋白具有相似生物學(xué)活性的可溶蛋白，然后用脫毒的蛋白免疫的小鼠獲得了90%的免疫保護力。Zeng等［13］還將重組的各種毒素用甲醛滅活，再加入佐劑制成疫苗，然后將它與羊痘疫苗結(jié)合起來對羊進行免疫，結(jié)果顯示，被免疫的羊同時獲得了羊痘和腸毒血癥的保護性。Miyamoto等［5］將ε毒素基因克隆到相關(guān)質(zhì)粒中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中，重組的ε毒素經(jīng)過滅活后，加入相應(yīng)佐劑免疫反芻動物，二免后抗體滴度迅速上升，測定重組毒素具有針對產(chǎn)氣莢膜梭菌的免疫保護性［16］。

3.3 核酸疫苗研究進展

核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因直接導(dǎo)入動物體細胞內(nèi)，并通過宿主細胞的表達系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達到預(yù)防和治療疾病的目的。核酸疫苗是利用現(xiàn)代生物技術(shù)與免疫學(xué)方法研制成的，分為DNA疫苗和RNA疫苗兩種。但目前對核酸苗的研究以DNA疫苗為主。DNA疫苗又稱為裸疫苗，因其不需要任何化學(xué)載體而得此名。DNA疫苗導(dǎo)入宿主體內(nèi)后，被組織細胞、抗原遞呈細胞或其它炎性細胞攝取，并在細胞內(nèi)表達病原體的蛋白質(zhì)抗原，通過一系列的反應(yīng)刺激機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫。與傳統(tǒng)的滅活疫苗、亞單位疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗的優(yōu)點是免疫保護力增強，疫苗接種后蛋白質(zhì)在宿主細胞內(nèi)表達，直接與組織相容性復(fù)合物MHCI或II類分子結(jié)合，同時引起細胞和體液免疫，對慢性感染性疾病等依賴細胞免疫清除病原的疾病的預(yù)防更加有效。目前國內(nèi)外學(xué)者都非常重視牛羊產(chǎn)氣莢膜梭菌核酸疫苗的研究［19］。核酸疫苗雖然在一定程度上提高了免疫效應(yīng)，但疫苗本身的安全性，DNA免疫的作用機理以及如何提高進一步免疫水平仍然需要進一步研究。

4 研究展望

產(chǎn)氣莢膜梭菌的外毒素是病原菌生長繁殖過程中分泌到菌體外的一種代謝產(chǎn)物，為次級代謝產(chǎn)物，它是一類基因編碼翻譯而成的蛋白質(zhì)，能刺激宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)，不但可刺激機體產(chǎn)生抗毒素，而且可中和外毒素。這些毒素蛋白可以作為非常好的免疫原，抵抗異源毒素的攻擊，有效預(yù)防由多型產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的牛羊疾病?，F(xiàn)階段對產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的牛羊疾病的預(yù)防主要以單價苗和多聯(lián)苗為主，但各有利弊，都不能很好地對該菌引起的疾病起到預(yù)防和治療的效果。近幾年基因工程亞單位疫苗也相繼出現(xiàn)，但多數(shù)只針對單一毒素引起的疾病進行預(yù)防，雖具有一定的保護力，但對其他毒素引起的疾病或者多種毒素聯(lián)合感染引起的疾病的保護效果不明顯，因此研發(fā)有效多價基因工程亞單位疫苗或者核酸疫苗具有非常廣闊的科研與應(yīng)用前景。

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Progress in the Main Exotoxin Gene and the Related Vaccine ofClostridium Perfringens

Sun Yu，WangXiaoying，SongXiaohui，et al
（China Animal Disease Control Center，Beijing102600，China）

Clostridium perfringens is also called clostridium westergren，which mainly cause diseases in ruminants，such as gas gangrene，intestines toxemia，hemorrhagic enteritis of cattle and sheep.The bacteria are divided into five subtypes including A，B，C，D，E subtype，which can secrete more than 10 kinds ofexotoxin，such as α，β，ε，ι，γ，η，θ，κ，λ，μ，ν and soon.In these toxins，α，β，εandιplay a key pathogenic role.In the current situation，the disease are prevented mainly by the monovalent vaccine，combined vaccine and multivalent inactivated vaccine.However，the genetic engineering subunit vaccine and nucleic acid vaccine has wide development prospects.In order to provide some reference for the comprehensive prevention and deep research of Clostridium perfringens，the etiology characteristics of Clostridium perfringens，pathogenic mechanism of exotoxin and the research progress in related vaccine were reviewed，and the genetic engineering subunit vaccine and nucleic acid vaccine development prospects were alsodiscussed in this paper.

Clostridium perfringens；exotoxin；pathogenic mechanism；vaccine

S864.7

A

2095-3887（2016）02-0058-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.02.016

2015-11-17

農(nóng)業(yè)部動物疫病監(jiān)測與防治項目

孫雨，男，獸醫(yī)師，博士，主要從事人畜共患病預(yù)防控制研究。

宋曉暉，女，高級獸醫(yī)師，博士，主要從事草食動物疫病與人畜共患病的預(yù)防控制研究。