陳 珊(CHEN Shan)，劉厚明(LIU Hou-ming)，單萬水(SHAN Wan-shui)

(1 廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524000； 2 深圳市第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518000)

?

·綜述·

結(jié)核分枝桿菌耐藥表型與耐藥基因型相關(guān)性研究進(jìn)展

陳 珊(CHEN Shan)1，劉厚明(LIU Hou-ming)2，單萬水(SHAN Wan-shui)2

(1 廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524000； 2 深圳市第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518000)

結(jié)核分枝桿菌； 分子機制； 表型耐藥； 耐藥基因

20世紀(jì)80年代以來，結(jié)核病(tuberculosis，TB)疫情呈全球性回升趨勢，我國作為全球最大的發(fā)展中國家，同時也是全球TB疫情最嚴(yán)重的國家之一[1]。隨著全球耐藥結(jié)核病(drug-resistant tuberculosis，DR-TB)的出現(xiàn)和傳播，特別是耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant TB，MDR-TB)、廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant TB，XDR-TB),以及全耐藥結(jié)核病(totally drug-resistant TB，TDR-TB)發(fā)生率的增高，全球TB的有效治療和控制受到嚴(yán)重威脅。深入研究結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的耐藥分子機制，發(fā)現(xiàn)基因突變是MTB產(chǎn)生耐藥的重要原因?，F(xiàn)就各抗結(jié)核藥物的耐藥表型與耐藥基因型的相關(guān)性研究進(jìn)行綜述。

1 MTB耐利福平(rifampin，RFP)

RFP為半合成廣譜殺菌劑，是最有效的抗結(jié)核藥物之一，在短期化學(xué)治療中起重要作用。RFP通過與細(xì)菌RNA聚合酶的β亞單位牢固結(jié)合，抑制細(xì)菌mRNA的合成，防止該酶與DNA連接，從而干擾、阻斷RNA轉(zhuǎn)錄過程。MTB RNA聚合酶β亞單位由rpoB基因編碼，當(dāng)rpoB基因個別密碼子發(fā)生突變時，DNA依賴性RNA聚合酶β亞單位的空間構(gòu)象發(fā)生改變，無法與RFP結(jié)合，從而表現(xiàn)為耐藥。

現(xiàn)已知95%～99%的MTB耐RFP主要是因rpoB基因在507-533位密碼子共81 bp的核心區(qū)域內(nèi)(rifampicin resistance determining region，RRDR)[2-3]堿基發(fā)生突變、缺失、顛換等導(dǎo)致。最常見的突變位點為531位點TCG(Ser)-TTG(Leu)，526位點CAC(His)-TAC(Tyr)、GAC(Asp)、CTC(Leu)，516位點GAC(Asp)-GTC(Val)[4]。已發(fā)現(xiàn)的突變位點還有450、511、512、513、514、515、517、518、522、524、530、533位點等。近年來，RFP耐藥基因rpoB的突變特征成為各國研究熱點，不同國家報道的rpoB基因突變位點及每個位點的突變率并不完全相同。孟加拉的研究[5]表明，207株耐RFP菌株中，最常見的突變位點為531(57.4%)，其次526(22.9%)、516(7.3%)，個別菌株在513、530、533位點突變，另有5%耐藥菌株未發(fā)現(xiàn)基因突變。在531位點有相似突變率的國家不在少數(shù)，如尼泊爾為57.8%[6]，摩洛哥為59.6%[7]，新加坡為54.9%[8]，泰國為58.5%[9]，巴西為56.1%[10]等；較高突變率的國家有西班牙(72.3%)[11]、緬甸(63.6%)[12]。由此可見，rpoB基因有明顯的地域性突變差異。針對耐RFP臨床分離株的研究中發(fā)現(xiàn)(MIC法測定結(jié)果)，RRDR區(qū)域內(nèi)不同堿基突變耐RFP水平不同，531、526和516位點突變常導(dǎo)致高水平耐藥(MIC>32 μg/mL)，511、513、514、533位點突變一般引起低水平耐藥。此外，研究[13]表明，約90%的耐RFP菌株往往也耐其他一線抗結(jié)核藥物。耐RFP是判斷MDR-TB菌株的風(fēng)向標(biāo)，而rpoB基因突變?yōu)镽FP耐藥的主要原因，由此可見，快速、準(zhǔn)確檢測rpoB基因突變不僅有助于指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥，提高療效，而且可有效防控MDR-TB的傳播。

2 MTB耐異煙肼(isoniazid，INH)

INH是一種前體藥，性質(zhì)穩(wěn)定，通過被動擴散方式進(jìn)入增長期的MTB中，由菌體內(nèi)過氧化氫-過氧化物酶(katG酶)激活，產(chǎn)生活化的游離自由基，如活性氧化物、活性有機物等，能抑制細(xì)胞壁分枝菌酸的合成，破壞細(xì)胞壁的完整性，引起細(xì)菌增殖力、抗酸性等生理功能喪失，達(dá)到殺菌目的。研究[14]發(fā)現(xiàn)，使用INH一段時間后，INH本身會誘導(dǎo)MTB基因突變，產(chǎn)生基因型耐INH菌株。INH耐藥機制復(fù)雜，涉及菌體中的KatG酶、烯酰脂酰載體蛋白還原酶(inhA)、β-酮?；\載蛋白合成酶(kasA)、烷基過氧化氫酶還原酶(ahpC)和還原型輔酶Ⅰ脫氫酶(ndh)等多基因突變。

2.1KatG基因KatG基因編碼KatG酶，在菌體內(nèi)將INH氧化成異煙酸，參與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶I(NAD)的合成，抑制細(xì)胞壁分枝菌酸的合成。當(dāng)KatG基因發(fā)生完全缺失或突變時，導(dǎo)致細(xì)胞中過氧化氫酶不被表達(dá)或活性降低，從而引起結(jié)核分枝桿菌對INH耐藥。絕大部分耐INH菌株中均有KatG基因表達(dá)，僅24%的耐INH結(jié)核菌株中KatG基因完全缺失，且均是MIC>50 μg/mL的高度耐藥株。KatG基因突變可能是MTB耐INH更重要、更普遍的原因。30%～95%的耐INH菌株存在KatG突變。有記載的KatG突變位點約300種，最常見的是密碼子S315(AGC)突變成蘇氨酸(ACC)、天冬氨酸(AAC)、精氨酸(CGC)、異亮氨酸(ATC)、甘氨酸(GGC)等，94%以上是S315T突變。另有104、108、 138、 141、148、 270、 275、314、328、341、378、381、394、420、 463、494、553、595、658等位點突變，大部分可導(dǎo)致INH耐藥。據(jù)報道[15]，不同堿基突變的菌株其過氧化氫酶活性及INH耐受程度不同。如S315T、W341G、G494D和R595S等與高濃度INH耐藥有關(guān)，而S315N、L141F、 E553K和 F658V等與低濃度INH耐藥有關(guān)。但是，并非所有密碼子突變均與INH耐藥有關(guān)，如R463L位點突變較常見，且在INH敏感株中的突變率高于耐藥株，但其突變并不影響KatG酶活性，提示該突變位點的存在為基因多態(tài)性[16]。簡言之，KatG基因S315T是結(jié)核菌株耐INH的主要分子機制，但也有因基因多態(tài)性而存在的突變位點和無KatG基因突變卻耐INH的菌株，提示MTB中存在其他耐INH的途徑。

2.2inhA基因inhA基因編碼烯?；阴］d體蛋白還原酶，分子量約為32 kd的蛋白質(zhì)，參與分枝菌酸的生物合成，是INH的作用靶點。inhA突變多見于調(diào)節(jié)序列的啟動子區(qū)，包括點突變和堿基缺失，突變頻率較高的位點包括C-15T、T-8C，目前發(fā)現(xiàn)的突變位點還有16、72、90、94、98、105等。Tekwu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，低水平耐INH菌株中，inhA(C-15T)突變率達(dá)50%(10/20)，因此認(rèn)為inhA編碼基因的突變常見于低耐藥菌(MIC=0.2 μg/mL)。各地區(qū)耐INH菌株中inhA基因突變率并不相同，陳楊等[18]研究結(jié)果為30%，韋紅玉等[19]研究結(jié)果為20%。inhA除單一位點突變外，少部分聯(lián)合KatG出現(xiàn)雙基因突變，占耐藥菌株的8.5%，當(dāng)inhA與KatG基因聯(lián)合突變時，INH的耐藥性明顯增強。

2.3oxyR-ahpC基因區(qū)oxyR基因編碼的蛋白既是基因轉(zhuǎn)錄的活化劑，又是感受氧壓的感受器。oxyR基因本身無生物活性，是一假性基因，與MTB對INH的敏感性無關(guān)，但因oxyR蛋白參與KatG和ahpC基因的表達(dá)，因而與MTB的耐藥性有關(guān)。ahpC基因啟動子位于oxyR-ahpC基因區(qū)，耐INH菌株常在此區(qū)域發(fā)生突變。據(jù)研究[20]報道，在MTB耐INH臨床分離株中，oxyR-ahpC突變率可達(dá)39.6%(19/48)，其中G-46A突變位點占31.2%。當(dāng)oxyR-ahpC突變，能代償性增加ahpC表達(dá)，填補KatG酶的缺乏，為MTB抗氧化應(yīng)激反應(yīng)提供保護(hù)。有學(xué)者視ahpC突變?yōu)镵atG損傷的一種標(biāo)志，然而兩者并無直接因果關(guān)系，大部分耐INH菌株發(fā)生KatG突變時并不伴有ahpC突變。

2.4kasA基因kasA基因編碼β-酮?；\載蛋白合成酶，屬Ⅱ型脂肪酸合酶系統(tǒng)，參與分枝菌酸的合成。kasA基因突變不常見，占異煙肼INH耐藥菌株的10%，已發(fā)現(xiàn)的突變位點有66、121、269、312 和387等，其中G312S最常見，但在部分INH敏感株中亦存在312位點突變，因此考慮該突變位點可能為基因多態(tài)性。除312位點外，KasA基因中還存在部分INH耐菌株和敏感株中均有的突變位點，所以KasA基因在MTB產(chǎn)生INH耐藥過程中的作用仍需進(jìn)一步研究。

2.5 其他基因 除KatG、inhA、oxyR-ahpC、KasA等基因外，近年還發(fā)現(xiàn)許多可能與MTB耐INH有關(guān)的基因，如ndh、iniA、iniB、iniC、accD6、efpA、furA、nal、msbA等。如ndh基因編碼NADH脫氫酶，突變可引起酶活性缺失，NADH含量增加，NAD+減少，NADH/NAD+比例改變，使INH過氧化被抑制造成耐藥，常見突變位點V18A。上述大多基因與INH耐藥的關(guān)系并未十分明確，還有待進(jìn)一步研究證實。

3 MTB耐鏈霉素(streptomycin，SM)

SM是氨基環(huán)醇糖苷類抗生素，通過誘導(dǎo)遺傳密碼錯讀，抑制翻譯啟動及干擾校正過程，影響蛋白質(zhì)的合成而發(fā)揮抗菌作用。研究[21]表明，編碼小亞基核糖體蛋白S12的rpsL和編碼16SrRNA的rrs基因突變是MTB耐SM的主要分子機制。約80%耐SM菌株存在rpsL或rrs突變，其中rpsL突變率高于rrs。rpsL最常見突變位點是第43和88位密碼子，第43位密碼子不僅突變率最高，且與高濃度SM耐藥有關(guān)。該位點有限制性內(nèi)切酶MboⅡ的識別序列(GAAGGA)，易使Lys突變?yōu)锳rg，部分菌株Lys-Thr。在耐SM菌株中，rrs突變主要集中于530莖-環(huán)區(qū)和915核苷區(qū)，已發(fā)現(xiàn)426(G-C)、491(C-T)、512(C-T)、513(A-C)、513(A-T)、514(A-C)、516(C-T)、903(C-G)、903(C-A)、904(A-C)、905(A-G)等突變位點。部分菌株有雙突變位點，如rrs513(A-C)合并rpsL43(A-G)，rrs905(A-G)合并rpsL88(A-G)，但類似聯(lián)合突變不常見。近年有學(xué)者認(rèn)為，7-甲基鳥苷-甲基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因gidB與低水平SM耐藥有關(guān)，gidB基因突變使保守的M7G甲基化轉(zhuǎn)移酶修飾丟失，從而產(chǎn)生低水平SM耐藥[22-23]。但在RFP、INH耐藥而SM敏感的菌株中亦有g(shù)idB突變，因此需加強gidB與SM表型耐藥相關(guān)性的研究。除上述耐藥基因外，約1/3的臨床SM耐藥株無rpsL或rrs突變，提示可能有其他SM耐藥機制存在。

4 MTB耐乙胺丁醇(ethambutol，EMB)

EMB是一種合成的阿拉伯糖類藥物，發(fā)揮抗菌效力最關(guān)鍵的作用靶點是阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶。EMB能抑制其聚合阿拉伯半乳聚糖，從而影響分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖復(fù)合物(細(xì)胞壁的重要成分)的形成，同時使RFP等藥物更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因而EMB與RFP具有協(xié)同抗結(jié)核的作用。編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的embABC操縱子突變或emb蛋白過度表達(dá)與EMB耐藥密切相關(guān)，過度表達(dá)引起EMB低耐藥，基因突變導(dǎo)致EMB高耐藥。embABC操縱子由embC、embA、embB 3個基因組成，其中embB基因突變是MTB耐EMB的主要原因。embB基因約3 246 bp，編碼1個糖基轉(zhuǎn)移酶，其突變可導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)改變，影響EMB與糖基轉(zhuǎn)移酶的相互作用產(chǎn)生耐藥。embB基因最常見第306位突變，占embB基因突變的90%，包括M306V、M306I、M306L。此外，第285、306、313、319、328、330、406、497及630位等密碼子突變可引起EMB耐藥。但是，學(xué)術(shù)界對embB306突變與EMB耐藥關(guān)系存在爭議。普遍認(rèn)為embB306突變可作為快速診斷MDR的標(biāo)準(zhǔn)[24]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，embB306突變不僅存在于EMB耐藥株中，部分敏感株中亦有。

5 MTB耐吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)

PZA為煙酰胺類似物，最大特點是需要在酸性環(huán)境中才表現(xiàn)出抗菌活性，殺死半休眠期MTB，且MIC與pH呈正相關(guān)性。PZA在細(xì)胞外酸性環(huán)境下滲透進(jìn)入MTB內(nèi)，菌體內(nèi)的吡嗪酰胺酶(PZase)將其轉(zhuǎn)化為對MTB有毒性作用的吡嗪酸(POA)而發(fā)揮殺菌作用。PZase高活性是PZA發(fā)揮抗MTB作用的關(guān)鍵，而PZase編碼基因pncA突變造成的PZase活性缺失或降低被認(rèn)為是MTB耐PZA的主要原因。pncA基因約561 bp，其突變類型包括點突變、上游調(diào)控序列變異、核苷酸插入或缺失、小片段插入等。目前，已發(fā)現(xiàn)的pncA突變位點約175種，呈彌散分布無規(guī)律可循，最常見突變位點為A-11G，還有第47位(Thr-Ala)，第85位(Leu-Pro)。研究[25]發(fā)現(xiàn)，部分PZA耐藥株中并未出現(xiàn)pncA基因突變，且少數(shù)EMB耐藥株發(fā)生了pncA突變但未對PZase活性產(chǎn)生明顯影響，表明pncA突變并非唯一的PZA耐藥機制。

6 結(jié)語

綜上所述，MTB菌體內(nèi)與抗結(jié)核藥物作用靶點有關(guān)的編碼基因突變是結(jié)核菌耐藥的主要作用機制，但大部分藥物仍存在其他耐藥機制，有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，耐藥表型與基因型之間的相關(guān)性仍需進(jìn)一步深入研究。因此，加強對抗結(jié)核藥物作用機制及MDR耐藥機制的研究，尋找與耐藥基因突變有關(guān)的誘導(dǎo)因素，并建立新的高效、靈敏、特異、價廉的結(jié)核菌耐藥性檢測方法十分必要。總之，人類在抗TB的道路上任重而道遠(yuǎn)，但筆者堅信，隨著分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的發(fā)展，新型檢測技術(shù)的成熟，在不久的將來包括TB及MDR-TB在內(nèi)的很多傳染病都會從根本上得到遏制。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis control.2011[R]. Geneva, Switzerland: WHO, 2011.

[2] Khosravi AD, Goodarzi H, Alavi SM. Detection of genomic mutations inKatG,inhA andrpoB genes ofMycobacteriumtuberculosisisolates using polymerase chain reaction and multiplex allele-specific polymerase chain reation[J]. Braz J Infect Dis, 2012, 16(1):57-62.

[3] Heysell SK, Houpt ER. The future of molecular diagnostics for drug-resistant tuberculosis[J].Expert Rev Mol Diagn, 2012, 12(4):395-405.

[4] Goncalves MG, Fukasawa LO, Oliveira RS, et al. Fast test for assessing the susceptibility ofMycobacteriumtuberculosisto isoniazid and rifampin by real-time PCR[J].Mem Inst Oswaldo Cruz, 2012, 107(7):903-908.

[5] Rahim Z, Nakajima C, Raqib R, et al. Molecular mechanism of rifampicin and isoniazid resistance inMycobacteriumtuberculosisfrom Bangladesh [J]. Tuberculosis, 2012, 92(6):529-534.

[6] Poudel A, Nakajima C, Fukushima Y, et al. Molecular characterization of multidrug resistantMycobacteriumtuberculosisisolated in Nepal[J].Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(6):2831-2836.

[7] Kourout M, Chaoui I, Sabouni R, et al. Molecular characterisation of rifampicin resistantMycobacteriumtuberculosisstrains from Morocco[J].Int J Tuberc Lung Dis, 2009, 13(11):1440-1442.

[8] Lee AS, Lim IH, Tang LL, et al. High frequency of mutations in therpoB gene in rifampin-resistant clinical isolates ofMycobacteriumtuberculosisfrom Singapore[J].J Clin Microbiol, 2005, 43(4):2026-2027.

[9] Prammananan T, Cheunoy W, Taechamahapun D, et al. Distribution ofrpoB mutations among multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis(MDRTB)strains from Thailand and development of a rapid method for mutation detection[J]. Clin Microbiol Infect, 2008, 14(5):446-453.

[10] Valim AR, Rossetti ML, Ribeiro MO, et al. Mutations in therpoB gene of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from Brazil[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(8):3119-3122.

[11] Torres MJ, Criado A, Gónzalez N, et al. Rifampin and isoniazid resistance associated mutationed inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates in Seville, Spain[J].Int J Tuberc Lung Dis, 2002, 6(2):160-163.

[12] AungWW, Ei PW, Nyunt WW, et al. Phenotypic and genotypic analysis of anti-tuberculosis drug resistance inMycobacteriumtuberculosisisolates in Myanmar[J]. Ann Lab Med,2015, 35(5):494-499.

[13] Rahman A, Sahrin M, Afrin S, et al. Comparison of Xpert MTB/RIF assay and genotype MTBDR plus DNA probes for detection of mutations associated with rifampicin resistance inMycobacteriumtuberculosis[J]. PloS One, 2016,11(4): e0152694.

[14] Siddiqi S, Takhar P, Baldeviano C, et al. Isoniazid induces its own resistance in nonreplicatingMycobacteriumtuberculosis[J].Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(6):2100-2104.

[15] Vilchèze C, Jacobs WR. Resistance to isoniazid and ethionamide inMycobacteriumtuberculosis: genes, mutations, and causalities[J]. Microbiol Spectr, 2014, 2(4): MGM2-0014-2013.

[16] 蔡捷，劉小香，李召東,等.結(jié)核分枝桿菌臨床菌株katG、inhA和ahpC基因突變與異煙肼耐藥的相關(guān)性研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2013,23(6): 1430-1432.

[17] Tekwu EM, Sidze LK, Assam JP, et al. Sequence analysis for detection of drug resistance inMycobacteriumtuberculosiscomplex isolates from the Central Region of Cameroon[J]. BMC Microbiol, 2014, 14:113.

[18] 陳楊， 陳玲， 張泓，等.耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌及其katG與inhA基因突變的研究[J].中國抗生素雜志，2010,35(10):788-792.

[19] 韋紅玉，隆昕穎，凌俊，等.廣西百色地區(qū)結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥基因特征[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2015，31(5):731-734.

[20] Doustdar F, Khosravi AD, Farnia P, et al. Molecular analysis of isoniazid resistance in different genotypes ofMycobacteriumtuberculosisisolates from Iran[J]. Microb Drug Resist, 2008,14(4):273-279.

[21] Sun YJ, Luo JT, Wong SY, et al. Analysis ofrpsL andrrsmutations in Beijing and non-Beijing streptomycin-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from Singapore [J]. Clin Microbiol Infect, 2010, 16(3):287-289.

[22] Spies FS, Ribeiro AW, Ramos DF, et al. Streptomycin resistance and lineage-specific polymorphisms inMycobacteriumtuberculosisgidB gene[J].J Clin Microbiol, 2011, 49(7):2625-2630.

[23] Mikhei DM, Shippy DC, Eakley NM, et al. Deletion of gene encoding methyltransferase (g-idB) confers high-level antimicrobial resistance inSalmonella[J]. J Antibiot(Tokyo), 2012, 65(4):185-192.

[24] 劉厚明，肖顏玉，李天品，等.結(jié)核分枝桿菌 embB 基因 306 位點突變與乙胺丁醇藥敏表型及耐多藥關(guān)系的研究[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2015,15(6):731-734.

[25] 洪創(chuàng)躍，王峰，桂靜，等.耐多藥結(jié)核分枝桿菌pncA基因突變特征及與吡嗪酰胺耐藥相關(guān)性研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012,46(5):436-439.

(本文編輯：左雙燕)

Advances in correlation between drug resistance phenotype and genotype ofMycobacteriumtuberculosis

(1 Guangdong Medical University, Zhanjiang 524000, China; 2 The Third People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518000, China)

2016-05-24

深圳市科技計劃項目(JCYJ20140411113637598)；深圳市科技研發(fā)資金項目(JCYJ20130401164749996)；深圳市“三名工程”專項資金

陳珊(1990-)，女(漢族)，湖南省益陽市人，碩士研究生，主要從事結(jié)核分枝桿菌耐藥性分子機制及檢測方法的研究。

單萬水 E-mail：13923478156@qq.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.11.021

R378.91+1

A

1671-9638(2016)11-0883-04