林　濤，樊建麟，楊東順，劉興勇，邵金良，李彥剛,劉宏程*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院　質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，云南　昆明　650223；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全

風險評估實驗室(昆明)，云南　昆明　650223)

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低溫液液萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定鮮棗中氟蟲腈及代謝物

林濤1,2，樊建麟1，楊東順1，劉興勇1，邵金良1，李彥剛1,劉宏程1,2*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，云南昆明650223；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全

風險評估實驗室(昆明)，云南昆明650223)

摘要：采用低溫液液萃取技術(shù)，對鮮棗中的氟蟲腈及其代謝物殘留進行提取和凈化，并利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)進行定性和定量分析。鮮棗樣品以乙腈作為提取溶劑，-25 ℃低溫液液萃取后，直接進樣分析，采用負離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，外標法定量。結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，氟蟲腈及其代謝物在0.02～10 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.999，檢出限為0.005～0.02 μg/kg，在不同加標濃度下的平均回收率為78.5%～95.8%，相對標準偏差(RSD)為3.4%～6.9%。該方法快速、簡便、靈敏，適用于鮮棗中氟蟲腈及其代謝物的快速測定。

關(guān)鍵詞：低溫液液萃取；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)；鮮棗；氟蟲腈及其代謝物

氟蟲腈(Fipronil)是一種廣譜的苯基吡唑類殺蟲劑，由拜耳作物科學公司于1987年研制開發(fā)[1]。氟蟲腈在環(huán)境中的穩(wěn)定性較差，使用后經(jīng)過一系列的物理化學變化會生成氟甲腈(Fipronilde sulfinyl)、氟蟲腈砜(Fipronil sulfone)、氟蟲腈亞砜(Fipronil sulfide) 3種代謝物(結(jié)構(gòu)式見圖1)，從而具有較高的毒性[2]。根據(jù)我國食品中農(nóng)藥殘留限量標準(GB2763-2014)的規(guī)定，氟蟲腈的殘留量是指氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的總量，以氟蟲腈表示。

圖1　氟蟲腈及其代謝物的化學結(jié)構(gòu)

氟蟲腈及其代謝物對水生生物的毒性較大，對環(huán)境具有一定的污染[3-4]，且半衰期較長[5]，我國早在2009年10月1日起已禁止使用氟蟲腈[6]，但目前仍有違法使用的情況發(fā)生。我國GB 2763-2014中只規(guī)定了氟蟲腈及其代謝物在谷物和蔬菜中的最大殘留限量，而國際上很少對氟蟲腈的最大殘留限量進行規(guī)定。目前氟蟲腈在水果中，特別是鮮棗中的檢出率較高，因此建立鮮棗中氟蟲腈及其代謝物的快速測定方法意義重大。

目前，氟蟲腈及其代謝物的測定方法較多，包括液相色譜[7]、氣相色譜[2]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]等，這些方法的前處理較復雜，且基質(zhì)干擾較強，不適于氟蟲腈及其代謝物的測定。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因分析速度快、靈敏度高、抗干擾能力強而廣泛應(yīng)用于氟蟲腈及其代謝物的測定[9-10]。

樣品中氟蟲腈及其代謝物的前處理一般采用傳統(tǒng)的固相萃取小柱[11]、固相微萃取[2]等方法進行富集純化，但這些前處理方法步驟較為復雜，且耗費較大；另一方面，低溫液液萃取因無需昂貴的前處理材料、簡便高效而不斷應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)殘分析[12-14]。低溫液液萃取是利用低溫條件下溶于水相的有機物分子會不斷擴散到水相而進入有機相中，從而實現(xiàn)液液萃取的目的，常用的有機溶劑為乙腈[15]。本研究將低溫液液萃取與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合，首次應(yīng)用于鮮棗中氟蟲腈及其代謝物的測定，并對其前處理步驟進行優(yōu)化，建立了快速測定鮮棗中氟蟲腈及其代謝物殘留的方法，為鮮棗的質(zhì)量安全評估提供更為快速靈敏的分析方法。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

API4000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB公司)；1290超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；ZORBAXRRHD色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美國Agilent公司)；AE100電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；渦旋振蕩器(美國 Thermo Scientific公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；純凈水(杭州娃哈哈公司)；氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標準品(100 μg/mL，百靈威科技)。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液配制將液體標準物質(zhì)用甲醇稀釋成10 μg/mL的標準儲備液。準確吸取一定體積的各標準儲備液，用甲醇定容，得到氟蟲腈及其代謝物的混合標準溶液，-20 ℃下避光保存。

1.2.2樣品處理鮮棗樣品經(jīng)食品加工機充分粉碎混勻后，稱取10 g樣品于離心管中，加入20 mL乙腈、1 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min，于-25 ℃下冷凍3 h后，吸取上層提取液1.0 mL過0.22 μm濾膜，待分析。

1.2.3色譜條件流動相：A為水溶液，B為甲醇。梯度洗脫條件：0～5.0 min，55%～10%A；5.0～6.0 min，10%A；6.0～6.1 min，10%～55%A；6.1～7.0 min，55%A。柱溫：35 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量：1 μL。

1.2.4質(zhì)譜條件離子源：ESI源；監(jiān)測模式：MRM；掃描方式：負離子模式，氣簾氣流量20 L/min；輔助氣流量55 L/min；霧化氣流量55 L/min；輔助加熱氣溫度550 ℃，噴霧電壓-5 500 V，相關(guān)參數(shù)見表1。

表1　氟蟲腈及其代謝物的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative ion

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件的優(yōu)化

本實驗選用Agilent ZORBAX RRHD色譜柱，根據(jù)氟蟲腈及其代謝物的化學結(jié)構(gòu)可知其pH值適中，故采用常見的甲醇-水流動相體系可得到較好的分析效果，且峰形對稱，無拖尾；另一方面，由于采用負離子掃描模式，故無需在流動相中加入乙酸銨或甲酸銨鹽。氟蟲腈及其代謝物的色譜圖如圖2A～D所示，空白基質(zhì)加標的總離子流圖如圖2E所示。結(jié)果表明氟蟲腈及其代謝物在甲醇-水流動相體系中的峰形較好，且在出峰處無干擾。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化選擇

2.2.1離子對的優(yōu)化參照文獻[16]確定氟蟲腈的離子對條件，并根據(jù)本實驗所用的儀器對其他相關(guān)參數(shù)進行優(yōu)化。由于氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的化學結(jié)構(gòu)與氟蟲腈類似，因此，實驗采用負離子模式，分別將氟蟲腈代謝物的標準溶液稀釋至0.1 mg/L，利用流動注射泵進樣，進行一級質(zhì)譜掃描，并確定其準分子離子峰，同時優(yōu)化其解簇電壓(DP)和入口電壓(EP)，再以準分子離子進行二級質(zhì)譜掃描，選擇豐度較高的2個碎片離子分別作為定量與定性離子，并優(yōu)化其碰撞能量(CE)和碰撞室出口電壓(CXP)等。氟蟲腈及其代謝物的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

圖3　氟蟲腈及其代謝物的子離子可能斷裂方式

2.3低溫液液萃取條件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑體積的優(yōu)化乙腈是一種特殊的提取溶劑，在常溫下能與水互溶，而在低溫下會與水相分層。本實驗稱取鮮棗樣品10 g，以1 μg/g作為加標濃度，-25 ℃低溫提取2 h，比較了乙腈體積分別為5，10，15，20，30 mL時的提取效果。結(jié)果表明，當提取溶劑為20 mL時，氟蟲腈及其代謝物的回收率均接近100%，符合日常檢測的要求；當提取溶劑為5，10，15 mL時，在冷凍提取后存在一定的基質(zhì)增強效應(yīng)；而當提取溶劑體積為30 mL時，4種目標化合物的回收率小于20 mL時，故選擇提取溶劑的體積為20 mL。

2.3.2氯化鈉加入量的優(yōu)化稱取鮮棗樣品10 g，加入20 mL乙腈，以1 μg/g作為加標濃度，比較了氯化鈉的加入量分別為0，1，2，3，4，5 g時的提取效果。結(jié)果表明，不加氯化鈉時，氟蟲腈及其代謝物的回收率范圍較寬，為80%～122%；而加入氯化鈉后，4種目標化合物的回收率為91%～102%，范圍縮小，且接近100%。表明氯化鈉的加入可增強體系中的離子強度，從而增大水分子對鹽離子的溶解，同時提高目標化合物在有機相中的溶解度。氯化鈉加入量為1，2，3，4，5 g時，目標化合物的回收率相差不大，因此，為節(jié)約實驗成本，選取氯化鈉的加入量為1 g。

2.3.3冷凍提取時間的優(yōu)化以1 μg/g作為加標濃度，-25 ℃為冷凍提取溫度，加入1 g氯化鈉，考察了冷凍提取時間分別為1，2，3，5，7 h的提取效果。結(jié)果顯示，在低溫條件下，水相中有機化合物的溶解度不斷降低而逐步溶于有機相中，這一過程與冷凍的時間及其實驗基質(zhì)有關(guān)。當冷凍提取時間小于3 h時，整個提取體系未達到液液分配平衡，如氟蟲腈和氟甲腈的回收率隨冷凍時間的延長而增大，而當冷凍提取的時間達到3 h后，4種目標化合物的回收率趨于平衡。因此實驗選擇3 h作為冷凍提取時間。

2.4方法學考察

2.4.1基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)是指質(zhì)譜分析中基質(zhì)中的干擾物會影響目標化合物的離子化，從而對目標化合物的離子化產(chǎn)生增強或抑制作用[17]。目前，對于基質(zhì)效應(yīng)的評價方法較多，本研究參照文獻方法[18]，即提取后分別定量測定空白基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┲邢嗤瑵舛确治鑫锏捻憫?yīng)強度，基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)標準響應(yīng)值/純?nèi)軇藴薯憫?yīng)值×100%。當基質(zhì)效應(yīng)>1時，為基質(zhì)增強效應(yīng)；當基質(zhì)效應(yīng)<1時，為基質(zhì)抑制效應(yīng)；當基質(zhì)效應(yīng)=1時，無基質(zhì)抑制效應(yīng)。一般情況下，基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%內(nèi)為正常的范圍。因此采用上述方法對氟蟲腈及其代謝物在鮮棗中的基質(zhì)效應(yīng)進行評價，結(jié)果表明，氟蟲腈及其代謝物在鮮棗中的基質(zhì)效應(yīng)為83%～95%，存在一定的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此采用空白鮮棗基質(zhì)添加標準溶液的方法提高定量分析的準確性。

2.4.2線性范圍與檢出限分別將氟蟲腈及其代謝物的標準溶液稀釋成不同的濃度，以峰面積對4種農(nóng)藥的濃度(μg/L)進行線性回歸。利用鮮棗的空白基質(zhì)，通過氟蟲腈及其代謝物標準物的添加，分別以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)確定方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。4種農(nóng)藥的線性范圍如表2所示，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 0～0.999 5，LOD為0.005～0.02 μg/kg，LOQ為0.02～0.08 μg/kg。本方法的檢出限遠低于GB 2763-2014標準中所規(guī)定氟蟲腈在蔬菜中的最大殘留限量20 μg/kg。

表2　氟蟲腈及其代謝物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限、定量下限、回收率與相對標準偏差

圖4　氟蟲腈陽性大棗樣品的色譜圖Fig.4　Chromatogram of fipronil positive jujube sample

2.4.3回收率與精密度以鮮棗為實驗對象，分別以1倍、5倍和10倍定量下限作為低、中、高3個加標濃度進行回收實驗，每個加標濃度平行測定6次。氟蟲腈及其代謝物的平均回收率為78.5%～95.8%，相對標準偏差(RSD)為3.4%～6.9%(表2)。

2.4.4與QuECeERS法的比較參照文獻中QuEChERS的操作步驟[19]，以0.1 μg/kg為加標濃度，將本方法與QuEChERS法進行比較。實驗結(jié)果表明，利用QuEChERS法時，氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜的平均回收率分別為81.3%，87.2%，90.5%和89.8%，與本方法所得的回收率相當。但QuEChERS法所用凈化填料的價格相對較貴，而本方法只需使用氯化鈉等價格低廉的材料；另一方面，利用QuEChERS法需使用離心機等其他儀器，操作步驟相對復雜。因此，利用本方法對鮮棗中的氟蟲腈及其代謝物進行測定更簡單快捷。

2.5實際樣品的測定

利用本方法對產(chǎn)自云南省(10個)和山東省(10個)的鮮棗共計20個樣品進行氟蟲腈及其代謝物的測定，結(jié)果表明，云南省樣品中有3個測出氟蟲腈，含量分別為0.01，0.006，0.007 mg/kg，山東省樣品中有3個測出氟蟲腈，含量分別為0.003，0.007，0.005 mg/kg。所有樣品均未測出氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜，參照國家標準對于蔬菜中氟蟲腈最大殘留限量的規(guī)定，所得結(jié)果均小于國家規(guī)定的最大殘留限量。圖4為1個氟蟲腈陽性大棗樣品的色譜圖，氟蟲腈含量為0.003 mg/kg。

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Determination of Fipronil and Its Metabolites in Fresh Jujube by Low Temperature Liquid-Liquid Extraction/Ultra High Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryLIN Tao1,2,FAN Jian-lin1,YANG Dong-shun1,LIU Xing-yong1,SHAO Jin-liang1,LI Yan-gang1,LIU Hong-cheng1,2*

(1. Institute of Agriculture Quality Standards & Testing Technique，Yunnan Academy of Agricultural Science，

Kunming650223，China;2. Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products

(Kunming)，Ministry of Agriculture，Kunming650223，China)

Abstract：An analytical method for the qualitative and quantitative analyses of fipronil and its metabolites residues in fresh jujube was developed by using low temperature liquid-liquid extraction and ultra high liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). The fresh jujube sample was extracted with acetonitrile，followed by liquid-liquid extraction at -25 ℃. The analysis of fipronil and its metabolites was performed under negative ion mode and multiple reaction monitoring(MRM),quantified by the external standard method. Under the optimized conditions，the fipronil and its metabolites showed good linearities in the range of 0.02 - 10 μg/L，with correlation coefficients(r2) higher than 0.999. The limits of detection of the method were in the range of 0.005-0.02 μg/kg. The average recoveries of fipronil and its metabolites in fresh jujube matrices were in the range of 78.5%-95.8% with relative standard deviations of 3.4%-6.9%. The method is simple and highly sensitive，and is suitable for the rapid determination of fipronil and its metabolites in fresh jujube.

Key words：low temperature liquid-liquid extraction；ultra high liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)；fresh jujube；fipronil and its metabolites

中圖分類號：O657.63;S482.3

文獻標識碼：A

文章編號：1004-4957(2015)12-1360-06

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.005

通訊作者：*劉宏程，博士，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與風險評估，Tel:0871-65140403，E-mail:liuorg@163.com

基金項目：2015年國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估項目(GJFP2015001);云南省科技創(chuàng)新平臺建設(shè)計劃(2014DA001)

收稿日期：2015-06-16；修回日期：2015-07-09