趙孔祥，婁婷婷，何　佳，陳其勇，葛寶坤，鄭文杰

(天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津　300461)

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同位素稀釋/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中脂溶性維生素

趙孔祥*，婁婷婷，何佳，陳其勇，葛寶坤，鄭文杰

(天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461)

嬰幼兒配方奶粉在嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)中占有很重要的地位，由于嬰幼兒食物來源單一，嬰幼兒配方奶粉必須含有滿足嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育需要的各種營(yíng)養(yǎng)素，且搭配合理，其中很重要的一類是脂溶性維生素。脂溶性維生素主要有維生素A(視黃醇)、維生素D(D2和D3)、維生素E(主要為α-生育酚)和維生素K(維生素K1)。脂溶性維生素能夠調(diào)節(jié)人體的各種生理機(jī)能，增強(qiáng)免疫力，促進(jìn)骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，調(diào)節(jié)體內(nèi)各方面的代謝等。

測(cè)定脂溶性維生素的液相色譜方法已有很多[1-5]，但由于配方奶粉的蛋白質(zhì)及脂肪含量高，前處理復(fù)雜，維生素含量差別大且測(cè)定靈敏度較低等原因，多種脂溶性維生素同時(shí)測(cè)定的方法較少[4-6]。液相色譜-質(zhì)譜法具有高靈敏度、高通量及高選擇性等特點(diǎn)，在脂溶性維生素檢測(cè)中的應(yīng)用越來越多[9-14]。同位素稀釋技術(shù)中每種目標(biāo)物均使用自身的同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，可校正前處理過程的損失，降低基質(zhì)效應(yīng)，提高定量的準(zhǔn)確性[12-15]。本文采用同位素稀釋/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)了多種脂溶性維生素的同時(shí)檢測(cè)，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作步驟，節(jié)省了人力、物力。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

TSQ Quantumn Ultra液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，Xcalibur操作軟件(美國Thermo公司)。恒溫振蕩器(常州普天儀器公司),GR22GⅢ高速離心機(jī)(日本日立公司)，R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)，Milli-Q 純水器(美國Millipore公司)，渦旋混勻器(美國Votex公司)。

脂肪酶，活力≥20 000/g(美國Sigma-Aldrich公司)；淀粉酶，活力≥1.5 U/mg(美國Sigma-Aldrich公司)，甲醇、甲酸、石油醚(色譜純，美國迪馬公司)；抗壞血酸(分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；無醛乙醇(優(yōu)級(jí)純，天津市化學(xué)試劑研究所有限公司)；維生素E(α-生育酚)、維生素D2、維生素D3、維生素K1(含量均>99%，美國Supelco公司)。維生素A(視黃醇，含量>99%)、維生素D2-3d(美國Sigma-Aldrich公司)。維生素A-3C13(新西蘭Buchem公司)，維生素D3-3d(美國Isosciences公司)，維生素E-6d和維生素K1-7d(加拿大Toronto Research Chemical公司)。配方奶粉標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)(SRM 1849a,美國Nist公司)。

1.2色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A相為0.02%甲酸-甲醇溶液，B相為0.1%甲酸-水溶液。梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%～95%A；1.0～6.0 min，95% A；6.0～7.0 min，95%～100%A；7.0～11.0 min，100%A；11.0～12.0 min，100%～90%A；12.0～15.0 min，90%A。流速0.4 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量10 μL；同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3質(zhì)譜條件

離子源電離模式：正離子大氣壓化學(xué)電離(APCI+)，電暈電流 6 μA，霧化條件：蒸發(fā)器溫度400 ℃，鞘氣壓力 275.7 kPa，輔助氣壓力 68.9 kPa。數(shù)據(jù)采集選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，詳細(xì)參數(shù)見表1。

表1　脂溶性維生素的MRM參數(shù)

* quantitative ion

1.4樣品制備方法

精密稱取1.0 g樣品，加入100 μL同位素內(nèi)標(biāo)溶液(D2-3d、D3-3d為1 μg/mL，A-3C13為10 μg/mL，E-6d為50 μg/mL，K1-7d為5 μg/mL)，并加入0.2 g抗壞血酸，用10 mL 50～60 ℃溫水溶解，混勻后，加入脂肪酶0.5 g(含淀粉樣品應(yīng)同時(shí)加入0.5 g淀粉酶)，(37±2) ℃振搖過夜。取出酶解樣品，加入15 mL乙醇與1.0 mL 10 mol/L的氫氧化鉀溶液，振搖混勻，(50±2) ℃下水解1 h。取出，迅速冷卻至室溫，加20 mL石油醚溶液振搖2 min，5 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相，下層液體再加入20 mL石油醚溶液振搖2 min，5 000 r/min離心5 min，合并上層有機(jī)相。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，用石油醚轉(zhuǎn)入試管中，氮?dú)獯蹈?，加?2 mL乙醇充分溶解，經(jīng)微孔濾膜過濾，待上機(jī)測(cè)定。

2結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用大氣壓化學(xué)電離[9,13]和電噴霧電離[10-12]對(duì)脂溶性維生素進(jìn)行檢測(cè)的研究已有報(bào)道。通過直接進(jìn)樣，分別試驗(yàn)大氣壓化學(xué)電離與電噴霧電離方式下各脂溶性維生素的電離情況，結(jié)果顯示，采用APCI+模式時(shí)，準(zhǔn)分子離子峰信號(hào)最強(qiáng)，這是由于脂溶性維生素的極性小，APCI模式更易使其電離。各維生素均可獲得豐度較高的[M+H]+母離子，優(yōu)化APCI其他電離參數(shù)，根據(jù)歐盟(2002/657/EC)指令，每個(gè)母離子選擇兩個(gè)子離子，優(yōu)化碰撞能量和選擇子離子，確定多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下信號(hào)采集的特征離子對(duì)(見表1)。

由于樣品中維生素E的含量較高，通常為mg/100 g水平，當(dāng)選擇響應(yīng)最強(qiáng)的離子對(duì)m/z431>167時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍(1～100 μg/mL)內(nèi)，其最高濃度的峰高超過108，響應(yīng)超過了儀器的最佳線性范圍，線性回歸實(shí)驗(yàn)也證明此點(diǎn)嚴(yán)重偏離，因此選擇次強(qiáng)離子對(duì)m/z431>137作為定量離子對(duì),維生素E在1～100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)(r2)達(dá)到0.99。如部分樣品含量仍超出線性范圍，需將樣液適當(dāng)稀釋，再進(jìn)行定量。

2.2色譜條件的優(yōu)化

甲醇在APCI模式下容易電離，通常是最佳的強(qiáng)洗脫溶劑。實(shí)驗(yàn)采用水+甲醇溶液作為流動(dòng)相，并在甲醇中添加甲酸以促進(jìn)電離，增強(qiáng)信號(hào)響應(yīng)。在0.01%～0.05%范圍內(nèi)對(duì)甲酸含量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，隨著甲酸含量的增加，維生素的響應(yīng)增加，添加0.02%甲酸時(shí)各維生素的響應(yīng)比不添加甲酸時(shí)增加20%～50%，繼續(xù)增加甲酸含量，響應(yīng)增加不顯著，且維生素E的基線明顯抬高，因此最終選擇向甲醇中添加0.02%的甲酸。

APCI模式下增加流動(dòng)相流速可以提高響應(yīng)，實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，在0.2～0.4 mL/min流速范圍內(nèi)，流速越大，各維生素的響應(yīng)越高，0.4 mL/min流速比0.2 mL/min的響應(yīng)提高50%～120%，但繼續(xù)增加流速，響應(yīng)提高不明顯，而液相色譜系統(tǒng)的反壓增加顯著，因此最終選擇流速為0.4 mL/min。

由于各脂溶性維生素的極性差別較大，維生素A的極性相對(duì)較強(qiáng)，容易洗脫，維生素E和K1的極性較弱，較難洗脫，因此采用梯度洗脫，可縮短分析時(shí)間同時(shí)獲得較好的分離效果。在“1.2”所述梯度洗脫程序下，各維生素達(dá)到了良好的分離。某嬰兒配方奶粉樣品的定量離子選擇離子流圖見圖1。

2.3樣品提取條件的優(yōu)化

參考GB 5413.9-2010中維生素A、D、E的測(cè)定條件[1]進(jìn)行提取時(shí)，維生素K1的損失較大，回收率不到10%。參考GB 5413.10-2010中維生素K1的測(cè)定條件[2]，K1的提取效率可提高至80%，但維生素A、D和E的提取率均降低，僅為50%～60%。結(jié)合兩個(gè)方法，先酶解，再加KOH溶液，加溫皂化一段時(shí)間后，A、D和E的提取效率為70%～80%，K1的提取效率為50%左右；減少KOH溶液用量可以提高K1的提取效率，但會(huì)導(dǎo)致皂化不完全，使維生素E測(cè)定值偏低。由于采用同位素內(nèi)標(biāo)法校正，50%的提取效率不影響樣品的準(zhǔn)確定量。

2.4線性范圍與定量下限

用水-乙醇(2∶8)配制系列濃度的各維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中維生素的質(zhì)量濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，某維生素峰面積與相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)作圖。各維生素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、線性范圍見表2。取空白脫脂奶粉樣品，按“1.4”方法處理后添加維生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以10倍信噪比(S/N=10)確定各維生素的定量下限，結(jié)果見表2。各脂溶性維生素在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，定量下限為0.5～10 μg/100 g。本方法靈敏度較高，滿足配方奶粉中脂溶性維生素的測(cè)定要求。

VitaminLinearrange(μg/mL)r2RegressionequationLOQ(μg/100g)A0.1～100.9927Y=9.9397X+0.580261.0D20.005～0.50.9981Y=17.626X+0.0132160.5D30.005～0.50.9987Y=10.508X+0.00576320.5E1～1000.9994Y=0.26666X+0.04558610K10.025～2.50.9987Y=75.085X+0.0440441.0

2.5回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

脂溶性維生素在奶粉中天然存在，無絕對(duì)空白的樣品做標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗(yàn)，因此選擇各維生素含量較低的樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。比較了與配方奶粉接近的脫脂奶粉、全脂奶粉、甜乳清粉、脫鹽乳清粉等樣品基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)脫脂奶粉中各維生素的含量最低。根據(jù)空白樣品及配方奶粉樣品的維生素含量，設(shè)定維生素的添加水平為：維生素D2、D3為5，10，20 μg/100 g，維生素A為100，200，400 μg/100 g，維生素E為1 000，2 000，4 000 μg/100 g，維生素K1為25，50，100 μg/100 g，每個(gè)水平重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表3,其平均回收率為83.8%～113.7%，RSD為1.2%～10.1%。方法顯示了較好的回收率與精密度。

表3　6種脂溶性維生素的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

*no detected

表4　標(biāo)準(zhǔn)參考物1849a的測(cè)定結(jié)果

*not certified,**no detected

2.6標(biāo)準(zhǔn)參考物的測(cè)定

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性，采用本方法測(cè)定了NIST的奶粉標(biāo)準(zhǔn)參考物SRM 1849a，結(jié)果見表4，測(cè)定結(jié)果均在定值范圍內(nèi)，6次平行測(cè)定的RSD為2.0%～5.7%，重復(fù)性較好。

2.7實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)天津口岸120批進(jìn)口及9個(gè)國產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示樣品中各脂溶性維生素含量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

3結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中維生素A、維生素D2、維生素D3、維生素E和維生素K1的同位素稀釋/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。方法的定量下限為0.5～10 μg/100 g，回收率為83.8%～113.7%。本方法具有高通量、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能滿足國內(nèi)外相關(guān)嬰幼兒配方奶粉產(chǎn)品中維生素含量的檢測(cè)要求，便于進(jìn)行脂溶性維生素水平的監(jiān)控，有利于提高嬰幼兒配方奶粉的安全性。

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研究簡(jiǎn)報(bào)

摘要：采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS) 結(jié)合同位素稀釋定量方法，建立了嬰幼兒配方奶粉中維生素A、維生素D2、維生素D3、維生素E和維生素K15種脂溶性維生素同時(shí)測(cè)定的分析方法。樣品經(jīng)脂肪酶酶解，氫氧化鉀-乙醇皂化，石油醚提取，乙醇定容，經(jīng)BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)分離后，以甲醇(甲酸0.02%)-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，0.4 mL/min梯度洗脫，采用大氣壓化學(xué)電離，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定。5種脂溶性維生素在一定濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.99，加標(biāo)回收率為83.8%～113.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為1.2%～10.1%，定量下限(LOQ)為0.5～10 μg/100g。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，可滿足配方奶粉中脂溶性維生素的檢測(cè)要求。

關(guān)鍵詞：同位素稀釋；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)；脂溶性維生素；維生素A；維生素D；維生素E；維生素K1；測(cè)定

Determination of Fat Vitamins in Infant Formula Milk by Isotope Dilution/High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryZHAO Kong-xiang*,LOU Ting-ting,HE Jia,CHEN Qi-yong,GE Bao-kun，ZHENG Wen-jie

(Tianjin Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin300461,China)

Abstract：A liquid chromatography-tandem mass spectrometric method(LC-MS/MS) was developed for the determination of content of vitamin A,vitamin D2，vitamin D3，vitamin E and vitamin K1in infant formula milk.The fat vitamins were extracted with petroleum ether after enzymatic hydrolysis and saponification.The chromatographic separation was completed with the column of BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm) using methanol(0.02% formic acid)-0.1% formic acid solution as mobile phase.Ionization mode was positive atmospheric pressure chemical ionization(APCI).Mass spectrometry data was acquired by multiple reaction monitoring(MRM) mode.The quantification analysis was carried out by isotope dilution method(each vitamin had its isotope internal standard).The calibration curves of 5 fat vitamins were linear in the certain concentration ranges with correlation coefficients(r2) above 0.99.The recoveries at three spiked levels(low,middle and high) ranged from 83.8% to 113.7% with relative standard deviations(RSD,n=6) of 1.2%-10.1%.The quantitation limits were in the range of 0.5-10 μg/100 g.The method was rapid,easy,accurate and sensitive,and could be used to detect fat vitamins in infant formula milk.

Key words：isotope dilution;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) ;fat vitamin;vitamin A;vitamin D;vitamin E;vitamin K1;determination

中圖分類號(hào)：O657.63；O629.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-4957(2015)12-1372-05

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.007

通訊作者：*趙孔祥，高級(jí)工程師，研究方向：食品殘留分析，Tel：022-66703154，E-mail：wwwkongxiang@163.com

基金項(xiàng)目：天津出入境檢驗(yàn)檢疫局科研資助項(xiàng)目(TK081-2013)

收稿日期：2015-05-19；修回日期：2015-06-23