鄭樹安

（福建農(nóng)林大學植物保護學院，福州350002）

蜜蜂的細胞及體液免疫

鄭樹安

（福建農(nóng)林大學植物保護學院，福州350002）

在長期的進化過程中，蜜蜂形成了一套有效避免和減輕各種病原體及異物對其自身造成影響的防衛(wèi)體系，主要包括體壁、消化道等機械屏障，各種清理行為，蜂產(chǎn)品的抗菌性能，以及蜜蜂的細胞和體液免疫作用等。本文簡要介紹蜜蜂的細胞和體液免疫。

蜜蜂是一個古老的生物類群，不但生產(chǎn)各種營養(yǎng)豐富的蜂產(chǎn)品，也是眾多開花植物的傳粉者，在生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位。盡管蜜蜂無T和B淋色細胞，無免疫球蛋白及完整的補體系統(tǒng)，缺乏特異的抗原-抗體反應，但其也具有一套獨特的免疫系統(tǒng)，主要由細胞免疫（cellular immunity）和體液免疫（humoral immunity）組成。蜜蜂細胞免疫主要依賴漿細胞或粒細胞對外來病原物或異物的吞噬（phagocytosis）和包被作用（encapsulation）；而體液免疫系統(tǒng)是以抗菌肽、凝集素、溶菌酶、酚氧化酶等，配合多種血細胞建立的一個開放完整的防御體系。一般認為誘導蜜蜂免疫系統(tǒng)啟動的誘導物并不是針對某一特定的誘導源，也沒有相應的特異性結(jié)合，即蜜蜂的免疫為“非專一性”免疫，不同的誘導源均可誘導蜜蜂產(chǎn)生類似的抗菌物質(zhì)，且經(jīng)誘導產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)具有廣譜性，而非針對特定的誘導物質(zhì)。

一、蜜蜂的細胞免疫

跟其他昆蟲一樣，蜜蜂的循環(huán)系統(tǒng)屬于開放式血液循環(huán)，不具備哺乳動物那樣與體腔完全分離的管網(wǎng)系統(tǒng)，它的整個體腔就是血腔，血液和組織液不能區(qū)分，血淋巴遍布于蜜蜂所有組織和器官。當外來病原體和異物進入后，蜜蜂依靠血細胞的吞噬、成瘤、包囊等作用殺滅病原菌，并通過凝集作用和傷口修復以防止外來物進一步侵入蜜蜂體腔。

1.吞噬作用

吞噬作用是指單個血細胞對入侵病原體完成識別、吞噬和消化清除的過程，僅能處理少量外來物，主要分為五個階段：（1）化學接觸吸引；（2）識別：（3）附著；（4）攝入；（5）消化或排除。

在外來物被蜜蜂漿血細胞或粒血細胞識別、附著和攝入后，將被溶酶體和吞噬體形成的吞噬溶酶體消化。溶酶體向吞噬溶酶體釋放各種水解酶以殺滅外來物。但有時，被捕獲的細菌可能在吞噬細胞中繁殖，使細胞死亡，釋放出更多的細菌，進一步在昆蟲血液中繁殖，導致致命的敗血癥的發(fā)生。

2.成瘤作用

當病原物大量進入血腔，漿血細胞的吞噬作用已經(jīng)無法完全對其清除時，蜜蜂將啟動更有效的防御機制，即成瘤作用（nodule formation）。成瘤作用是指多個血細胞聚集起來，對大量的小型病原物進行包圍并殺死的過程。與病原物接觸后，血細胞發(fā)生破裂，誘導病原物周圍血液固定在凝血塊中。血細胞和細菌的聚集體被厚層的扁平血細胞包圍，形成的瘤脫離血液循環(huán)，黏附在內(nèi)部器官的表面，逐漸死亡。

3.包囊作用

包囊實質(zhì)上是和成瘤相同的過程，只是包囊的對象體積更大，直徑超過10 μm較大的外來物體，包括在線蟲等寄生性外來物入侵時，蜜蜂血細胞啟動包囊作用。在細胞包囊中，數(shù)層血細胞在寄生蟲、它們的卵、真菌菌絲體和孢子、細菌菌株或原生動物周圍組成的囊袋。

在包囊中由于窒息或有毒廢物的積累可使寄生蟲的胚胎、幼蟲死亡。被包裹的寄生蟲可能由于黑變反應產(chǎn)生的醌中毒而死亡。孵化的幼蟲可能發(fā)育不全、生長受到阻礙。當然，在長期的進化中，有些被包囊的寄生蟲也可能生存下來，逃出包囊。

4.傷口修復和凝集作用

受傷后形成的傷口往往是病原菌侵入蜜蜂體腔的主要入口，在長期進化中，蜜蜂通過血凝塊和傷口的迅速愈合，消除了微生物進入的潛在通道。加上吞噬作用、成瘤和包囊作用，使血細胞脫粒和釋放凝塊物質(zhì)，截留或捕獲外來物質(zhì)。

在傷口修復中，血細胞大量聚集在創(chuàng)傷處，封閉傷口。同時誘集大量漿血細胞在凝血塊底部形成包被，殺死傷口內(nèi)的病原物，阻止它們侵入。從而達到防御目的。

二、蜜蜂的體液免疫

蜜蜂沒有淋巴免疫器官，當病原菌或其他異物侵入時，不會產(chǎn)生抗體，但能誘導血淋巴內(nèi)相應肽類和蛋白質(zhì)含量的增加。盡管這些有防衛(wèi)能力的肽類和蛋白質(zhì)與誘導源沒有特異關系，但也可以起到抑制和殺滅病原微生物的作用。因此，適當?shù)囊圆糠植粫鹈鄯浠疾〉恼T導物刺激蜜蜂，也能增強其抵抗力。

蜜蜂的體液免疫依賴血淋巴中的先天性免疫和獲得性免疫。先天性免疫因子包括溶菌酶、酚氧化酶、凝集素等。獲得性免疫需要人工或自然的誘導，典型的有蜜蜂抗菌肽。

1.溶菌酶

溶菌酶（lysozyme）又稱胞壁質(zhì)酶（muramidase）或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，但主要攻擊革蘭氏陽性細菌。

蜜蜂正常的血淋巴（無免疫性的）含有低水平的溶菌酶，以達到避免擦傷和受傷害的目的。蜜蜂幼蟲和成蟲的血淋巴中，溶菌酶濃度約為5～25 μg/ml，蛹含有5～10 μg/ml，飛翔蜂血淋巴中約40 μg/ml。受侵染時，蜜蜂幼蟲比成蜂對溶菌酶的合成反應更強烈。如：用大腸桿菌活細胞感染以后，幼蟲溶菌酶的濃度可高達330 μg/ ml，前蛹期達1300 μg/ml；而成蜂感染細菌后，血淋巴中溶菌酶濃度升高不明顯。

2.酚氧化酶

酚氧化酶（Phenoloxidse，PO）是一類含銅氧化酶，在蜜蜂的正常生長發(fā)育過程中具有重要的生理功能。PO通常以其非活化狀態(tài)的前體酚氧化酶酶原的形式存在于蜜蜂的血淋巴中，PO及其因子構(gòu)成了酚氧化酶原激活系統(tǒng)。該系統(tǒng)由PO、蛋白酶、模式識別蛋白和蛋白酶抑制劑構(gòu)成，與昆蟲機體受到外源物刺激產(chǎn)生免疫防御因子有著密切的關系，是參與并同時聯(lián)系體液免疫與細胞防御反應的少數(shù)通路之一。

在細胞免疫過程中，蜜蜂血細胞激發(fā)酚氧化酶的級聯(lián)反應，PPO活化后形成PO的一個重要的生物學功能是在外侵物周圍合成黑色素。激活的PO將酪氨酸羥基化為多巴，多巴再被氧化為多巴色素、二羥吲哚，最后形成黑色素。因此，酚氧化酶是黑色素生物合成有關的關鍵酶，并參與血細胞對外來物質(zhì)的吞噬、成瘤、包囊及黑化過程。

酚氧化酶也是昆蟲的體液免疫依賴的先天性免疫因子。病原微生物進入昆蟲血腔時，病原體自身的某些成分與宿主血細胞的特殊識別蛋白識別并結(jié)合，激活絲氨酸蛋白酶原級聯(lián)，接著引起酚氧化酶原級聯(lián)的活化，使酚氧化酶原裂解成酚氧化酶，參與機體的免疫防御反應。

3.凝集素

凝集素（lectin）是一類促使細胞凝集的蛋白或糖蛋白，具有專一的糖基識別能力，能與特異的受體進行結(jié)合，且只在與特異性受體結(jié)合后，結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象發(fā)生變化，才能發(fā)揮其生物學效應。凝集素可作為血細胞的表面受體，起識別外源入侵物并與之結(jié)合或介導血細胞對異源分子的吞噬作用，增強血細胞中酚氧化酶的功能，促進細胞對入侵物的包囊和黑化反應。它不僅在防御體系中有清除異物的作用，而且在變態(tài)發(fā)生時，對清除不必要的組織和細胞也起到了重要的作用。

4.抗菌肽

抗菌肽原指昆蟲體內(nèi)經(jīng)誘導而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，分子量在2000～7000左右，由20～60個氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數(shù)具有強堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點。目前已知的蜜蜂抗菌肽主要有防衛(wèi)素、蜜蜂抗菌肽、蜂蛾抗菌肽和膜翅抗菌肽。

（1）蜜蜂防衛(wèi)素：蜜蜂防衛(wèi)素含51個氨基酸，其序列組成與蜂王漿中的抗菌肽royalisin幾乎相同，僅有一個氨基酸不同，都對革蘭氏陽性菌有作用。通過編碼蜜蜂防衛(wèi)素的cDNA克隆的分析，發(fā)現(xiàn)其C-末端是酰胺化的，這種酰胺化的修飾作用對于穩(wěn)定分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)進而保障分子的溶菌活性是非常重要的。蜜蜂防衛(wèi)素前體結(jié)構(gòu)是由19個氨基酸組成的信號肽序列、22個氨基酸組成的前序列以及51個氨基酸組成的成熟序列組成。蜜蜂防衛(wèi)素對高溫穩(wěn)定，100℃加熱15 min仍可保持活性。

（2）蜜蜂抗菌肽：目前發(fā)現(xiàn)的蜜蜂抗菌肽多達19種，是含有18個氨基酸殘基的小肽，富含脯氨酸，感染微生物的蜜蜂體內(nèi)的apidaecin是由許多異構(gòu)物組成，主要對革蘭氏陰性菌起作用。不同的蜜蜂抗菌肽具有相同的保守序列，比較典型的是在C-端有8個氨基酸的保守序列，即PRPPHPRL。保守序列與其抗菌活性直接相關，保守序列的取代會造成蜜蜂抗菌肽抗菌作用的減弱和喪失。

編碼蜜蜂抗菌肽的基因轉(zhuǎn)錄成的前體mRNA是由編碼16個氨基酸的信號肽序列、編碼16個氨基酸的前序列、數(shù)量不等地由幾乎相同的84個核苷酸組成的重復單元（一般為1～12個）以及此C-末端序列而成，每個單元由一個編碼成熟的抗菌肽序列和編碼6～8個氨基酸以及一個二肽序列RR（N-末端的第一個單元的二肽是兩個精氨酸AA）組成。

（3）膜翅抗菌肽：膜翅抗菌肽由93個氨基酸殘基組成，是一種典型的陽離子型多肽，N-末端有一個2-吡咯酮-5-羧酸。其抗菌原理是通過改變細菌膜通透性達到抑制革蘭氏陽性菌和少數(shù)革蘭氏陰性菌的生長，最低抑菌濃度較其他抗菌肽要低。不同于其他抑菌肽在離子濃度增加時抑菌效果降低的特性，膜翅抗菌肽的抑菌效果并不隨溶液中離子強度的增加而減少。其前體結(jié)構(gòu)是由17個氨基酸組成的信號肽序列、17個氨基酸組成的前序列及93個氨基酸組成的成熟肽組成。

（4）蜂蛾抗菌肽：蜂蛾抗菌肽含有34個氨基酸殘基，包括10個脯氨酸殘基。其氨基末端序列與蜜蜂抗菌肽相似，具有廣譜的抗革蘭氏陰性菌的作用，對植物來源的革蘭氏陰性菌的抑菌活性更低。蜂蛾抗菌肽除了19個氨基酸組成的信號肽外，無其他前導序列，因此它的加工成熟過程非常簡單，只要進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過翻譯加工將信號肽除去，即成為有生物活性的蜂蛾抗菌肽。

蜜蜂自身的細胞和體液免疫對其抵御外界病原物的入侵和保障蜜蜂及蜂群的健康具有重要作用，如何充分提高和利用蜜蜂自身的免疫力是值得進一步研究的課題。值得注意的是，能量和營養(yǎng)是影響蜜蜂免疫力的重要因素，充分保證蜂群的食物和營養(yǎng)，是提高蜜蜂免疫力和蜂群健康水平的重要措施之一。

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