趙振剛 呂 莉（吉林市人民醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132001）

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簡(jiǎn)析病理學(xué)的常用技術(shù)原理及實(shí)施要點(diǎn)

趙振剛 呂 莉
（吉林市人民醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132001）

【摘要】病理學(xué)為一門活躍，但又古老的學(xué)科，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、生物學(xué)領(lǐng)域，占據(jù)著重要的作用。其中在醫(yī)學(xué)教育中，病理學(xué)這是臨床檢驗(yàn)以及疾病診斷的重要手段，在醫(yī)學(xué)中起著不可替代的作用。分析研究病理學(xué)常用技術(shù)原理，并分析其應(yīng)用實(shí)施情況。

【關(guān)鍵詞】病理學(xué)；技術(shù)原理；實(shí)施要點(diǎn)

病理學(xué)為一門基礎(chǔ)性醫(yī)學(xué)課程，其主要涉及的內(nèi)容為研究人體疾病發(fā)生原因、發(fā)病機(jī)制、發(fā)展規(guī)律、疾病機(jī)體中形態(tài)、功能代謝以及病變轉(zhuǎn)歸。一直以來，病理學(xué)被看作臨床醫(yī)學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)之間的橋梁學(xué)科。客觀分析病理學(xué)常用技術(shù)以及實(shí)施情況，對(duì)于之后臨床醫(yī)學(xué)診療水平的提高有重要作用。

1　人體以及組織與細(xì)胞病理學(xué)技術(shù)

1.1 基本觀察：主要借助放大鏡或單純靠肉眼、磅秤以及量尺等工具，細(xì)致剖檢人體標(biāo)本病變的大小、顏色、質(zhì)地、表面以及周圍組織器官，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)測(cè)量、取材，若有必要可攝影留作檢查資料。觀察人體大體，是病理醫(yī)師的基本工作內(nèi)容，也是正確診斷的第一步，為醫(yī)學(xué)生學(xué)習(xí)病理的主要方法。

1.2 觀察組織病理學(xué)：經(jīng)肉眼已經(jīng)確定的病變組織取材后，采用石蠟包埋或福爾馬林溶液固定制成切片后，在不同方法染色后經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察，分析、綜合其病變特點(diǎn)，診斷病理。組織切片最常用的染色方法是蘇木素-伊紅染色。這一方法為研究以及診斷疾病最常用、最簡(jiǎn)單的方法，若不能做出明確診斷，可輔助采用免疫組化、特殊染色以及其他觀察方法。

1.3 觀察細(xì)胞病理學(xué)：取樣病變處細(xì)胞，經(jīng)涂片染色后進(jìn)行診斷、觀察。一般來說，細(xì)胞的來源主要為女性生殖道、食管、口腔、鼻咽喉等病變部位處直接取脫落細(xì)胞，也可是自然的排泄物、體液、分泌物中的細(xì)胞。細(xì)胞學(xué)檢查不僅可用于患者，同時(shí)還可用于普查腫瘤。檢查設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，對(duì)患者造成的疼痛輕微，容易被患者所接受。但若需確診是否為惡性病變，需實(shí)施活檢確診。

2　免疫組織化學(xué)技術(shù)以及組織化學(xué)

2.1 免疫組化以及免疫細(xì)胞化學(xué)：免疫組化以及免疫細(xì)胞化學(xué)是是由傳統(tǒng)的組織化學(xué)以及免疫學(xué)結(jié)合而形成，是利用抗原體特殊性結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)。免疫組化技術(shù)具有較高的特異性以及敏感性，同時(shí)還能改變形態(tài)學(xué)，與功能、代謝變化相結(jié)合，直接可在細(xì)胞涂片、組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上，確定某些多肽類物質(zhì)存在，并具有較高的精確性，可定量分析被檢測(cè)物質(zhì)。

2.2 組織化學(xué)：一般可稱為特殊染色，通過應(yīng)用某些可于細(xì)胞或組織的化學(xué)成分發(fā)生特異性結(jié)合的顯色試劑，定位顯示病變，且能保存原有組織形態(tài)，實(shí)現(xiàn)代謝與形態(tài)的結(jié)合。

3　電子顯微鏡技術(shù)

電子顯微鏡技術(shù)神經(jīng)電子透鏡以及電子術(shù)合成的電子光學(xué)系統(tǒng)多極放大后，微小物體被放大成像，提高分辨率。其中透射電子顯微鏡為應(yīng)用最早、最廣泛的一種電鏡。光學(xué)顯微鏡以及電子顯微鏡的基本原理相同，不同時(shí)電鏡的照明源為電子術(shù)，光鏡的照明源為可見光。因電鏡的分辨率較高，因此電鏡樣本的處理以及超薄切片涉及，要比光鏡技術(shù)更為復(fù)雜以及精細(xì)，但基本過程相同，包括組織取材、固定、浸透、包埋等。電鏡樣本制備不同于常規(guī)病理制備，它要求組織必須新鮮，選擇最具代表性的區(qū)域小塊取材；雙重組織固定；環(huán)氧樹脂包埋；重金屬鹽染色；半薄切片染色后組織定位實(shí)施切制超薄切片。

4　顯微切割技術(shù)

顯微切割技術(shù)為當(dāng)前臨床新興的一門技術(shù)，它可從細(xì)胞涂片任意區(qū)域、或組織切片切割下幾十個(gè)、幾百個(gè)同類細(xì)胞。用顯微切割組織切片是采用石蠟包埋組織切片、細(xì)胞切片、冷凍切。其厚度為4～10 μm，且冷凍切片需經(jīng)乙醇固定。另外，顯微切割的組織切片必須染色，便于進(jìn)行單一細(xì)胞或目標(biāo)細(xì)胞定位。染色方法不固定，也可采用免疫組化染色。常用的顯微切割方法為手術(shù)操作方法、激光捕獲顯微切割法。顯微切割術(shù)的特點(diǎn)是從構(gòu)成復(fù)雜的組織中，獲得某一特定的單個(gè)細(xì)胞或同類細(xì)胞群，比較適用于腫瘤分子生物學(xué)研究。但該技術(shù)的不足在于操作難度大。

5　核酸原位雜交技術(shù)

原位雜交是核酸分子雜交一部分，將分子生物技術(shù)與組織化學(xué)相結(jié)合用于檢測(cè)以及定位核酸的技術(shù)。它是將已經(jīng)標(biāo)記好的核苷酸片段作為探針，經(jīng)雜交直接在細(xì)胞涂片、培養(yǎng)細(xì)胞爬片或組織切片上定位以及檢測(cè)某一特定靶的RNA或DNA的存在。其生物化學(xué)基礎(chǔ)為堿基、復(fù)性、DNA變性互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，依據(jù)所選取的探針以及待檢測(cè)靶序列不同，有RNA-RNA雜交、DNA-RNA雜交、DNA-DNA雜交。

5.1 選擇并標(biāo)記探針：適用于原位雜交的探針有單鏈cRNA探針、單鏈cDNA探針、雙鏈cDNA探針以及合成的寡核苷酸探針。一般探針標(biāo)志物有非放射性、放射性之分，前者有生物素、地高辛、熒光素，盡管其敏感性不佳，但性能穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單方便、成本低，被越來越廣泛應(yīng)用于臨床治療中，后者敏感性較高，但有放射性污染以及半衰期，耗時(shí)長(zhǎng)所需費(fèi)用高，因此應(yīng)用受到限制。

5.2 原位雜交程序：所需的材料為冷凍組織切片、常規(guī)石蠟包埋組織切片、細(xì)胞涂片、培養(yǎng)細(xì)胞爬片等，主主要程度為雜交前準(zhǔn)備、預(yù)準(zhǔn)備、雜交、雜交后處理、雜交體檢測(cè)等。操作中應(yīng)該注意：對(duì)RNARNA雜交、DNA-RNA雜交，需先采取RNA酶滅活處理；雜交溫度不能低于雜交體解鏈溫度25 ℃。

5.3 熒光原位雜交：可直接或間接實(shí)施熒光原位雜交，直接發(fā)是講熒光素直接標(biāo)記到已知的DNA探針，檢測(cè)靶序列為DNA；間接法：非熒光標(biāo)志物為已知DNA探針，并與一個(gè)熒光標(biāo)記抗體橋連。

6　激光掃描共聚焦顯微技術(shù)

激光掃描聚焦顯微鏡（LSCM）為當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)圖像分析儀器研究中藥成果之一，是利用計(jì)算機(jī)圖像、激光掃描技術(shù)、光學(xué)顯微技術(shù)結(jié)合而形成的高技術(shù)設(shè)備，主要組成部位有計(jì)算機(jī)、顯微鏡、掃描頭以及激光器。共聚焦成像利用探測(cè)點(diǎn)以及照明點(diǎn)共軛特性，抑制同一聚焦平面上非測(cè)量點(diǎn)雜散熒光，其獲得的分辨率顯著高于顯微鏡。同時(shí)具有縱向分辨率以及深度識(shí)別能力，可清晰看到較厚生物樣本細(xì)節(jié)。

6.1 LSCM主要功能：細(xì)胞、組織光學(xué)切片，利用計(jì)算機(jī)以及圖像的處理系統(tǒng)對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組織進(jìn)行分層掃描，可稱為顯微CT或細(xì)胞CT；重建三維立體空間；長(zhǎng)時(shí)間觀察活細(xì)胞；定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的酸堿度、細(xì)胞離子；熒光漂白恢復(fù)技術(shù)，利用高強(qiáng)度的脈沖式激光照射某一區(qū)域處，會(huì)該區(qū)域的熒光分子進(jìn)行漂白；研究細(xì)胞間通訊。

6.2 LSCM樣本要求以及使用局限：LSCM中要求的樣本最好為培養(yǎng)細(xì)胞樣本，石蠟包埋切片則不適用于該技術(shù)。LSCM主要采用直接或間接的熒光原位雜交技術(shù)以及免疫熒光染色技術(shù)。其中的抗體的質(zhì)量或熒光標(biāo)記的探針會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果起到直接的影響作用。

7　原位多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

原位多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，是在體外經(jīng)酶促反應(yīng)高效、快速擴(kuò)張某一特定DNA序列，可將單一拷貝的待測(cè)核酸以指數(shù)形式增加，而達(dá)到常規(guī)檢測(cè)水平，不能實(shí)施組織定位。原位PCR技術(shù)是將原位雜交細(xì)胞與細(xì)胞學(xué)定位相結(jié)合，在細(xì)胞涂片、石蠟包埋組織切片或培養(yǎng)細(xì)胞上爬片上檢測(cè)，定位核酸［1-3］。

原位PCR技術(shù)可用于檢測(cè)以及定位低拷貝內(nèi)源性基因，在完整細(xì)胞樣本上，可檢出單一拷貝DNA序列，可用于研究觀察基因重排、基因突變，還用于檢測(cè)以及定位外源性基因［4-6］。隨著當(dāng)前現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷進(jìn)步發(fā)展。理論上講，PCR為一種完美的技術(shù)，其敏感性較高，具有基因細(xì)胞內(nèi)定位功能，但該技術(shù)應(yīng)用尚不完善。主要表現(xiàn)為特異性不高；技術(shù)操作復(fù)雜；需結(jié)合采用特殊設(shè)備，應(yīng)用器械價(jià)格昂貴。

隨著自然科學(xué)的不斷進(jìn)步發(fā)展，醫(yī)學(xué)逐漸形成多種分支，其共同目的在于從不同角度，采用不同方法研究患病機(jī)體的生命活動(dòng)，病理學(xué)從形態(tài)學(xué)、病因?qū)W等、生物化學(xué)等方面進(jìn)行研究分析，保證人們的生命健康。

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中圖分類號(hào)：R36

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C

文章編號(hào)：1671-8194（2016）08-0298-02