楊鈺欣　江吉富

(遵義市婦幼保健院，遵義563000)

口服滅活幽門(mén)螺桿菌對(duì)新生BALB/c小鼠胃黏膜的免疫保護(hù)作用研究

楊鈺欣江吉富

(遵義市婦幼保健院，遵義563000)

[摘要]目的：探索BALB/c小鼠新生期口服滅活幽門(mén)螺桿菌(H.pylori)后對(duì)胃黏膜是否具有免疫保護(hù)作用。方法：將32只BALB/c小鼠分為四組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第Ⅰ組為PBS對(duì)照組，第II組為滅活H.pylori組，第Ⅲ組為滅活H.pylori加大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)組，第IV組為正常對(duì)照組。用相應(yīng)抗原成分對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組出生24 h以?xún)?nèi)的新生BALB/c小鼠進(jìn)行灌胃免疫，末次免疫兩周后，將小鼠用108CFU的幽門(mén)螺桿菌SS1株進(jìn)行活菌灌胃攻擊，連續(xù)攻擊兩天，每天兩次。在攻擊后的第28天，將各組小鼠處死，取胃組織進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)及組織病理學(xué)炎性評(píng)分。結(jié)果：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組慢性炎癥評(píng)分分別為2.25±0.46、2.12±0.35、1.5±0.53、0.25±0.46，炎癥活動(dòng)度評(píng)分為2.12±0.35、2.12±0.35、1.37±0.52、0.25±0.46；除Ⅰ、Ⅱ組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組細(xì)菌定植量分別為1.33±0.21、1.18±0.27、1.05±0.37×105CFU/1個(gè)胃，Ⅳ組細(xì)菌定植量<4×102CFU/1個(gè)胃，低于檢測(cè)值，Ⅲ組的細(xì)菌計(jì)數(shù)低于Ⅰ、Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：BLAB/c小鼠新生期給予滅活幽門(mén)螺桿菌加LTB灌胃免疫與活菌攻擊后炎癥的減輕和細(xì)菌定植量的減少可能相關(guān)，具有一定的免疫保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]滅活幽門(mén)螺桿菌；LTB；新生BALB/c小鼠；免疫保護(hù)

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)在1979年被澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall發(fā)現(xiàn)，于1982年成功地從人胃黏膜中分離培養(yǎng)出來(lái)，并證實(shí)了該細(xì)菌的感染與胃炎相關(guān)。1983年，他們的這一成果發(fā)表在Lancet雜志上[1]。幽門(mén)螺桿菌感染在全世界廣泛流行，日本的一項(xiàng)研究顯示，H.pylori的暫時(shí)定植可能在新生兒期就有出現(xiàn)[2]。雖然兒童患消化性潰瘍并不多見(jiàn)，但與兒童慢性胃炎、消化不良、慢性腹瀉和復(fù)發(fā)性腹痛等的發(fā)病密切相關(guān)[3]。實(shí)驗(yàn)證明有效的疫苗接種能夠防止H.pylori的感染[4]。一種用福爾馬林滅活的H.pylori全菌體凍干疫苗輔以LT的雙突變佐劑給予BALB/c小鼠灌胃免疫，結(jié)果證明具有良好的免疫保護(hù)反應(yīng)[5]。本課題的前期研究表明，對(duì)出生 24 h內(nèi)新生BALB/c小鼠用滅活幽門(mén)螺桿菌加大腸桿菌不耐熱腸毒素——LTB進(jìn)行灌胃免疫后，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)[6]。而這種免疫反應(yīng)是否具有保護(hù)作用尚不明確，所以本實(shí)驗(yàn)的主要目的在于探索口服滅活幽門(mén)螺桿菌疫苗對(duì)新生期小鼠胃粘膜炎癥變化的影響，希望能為人類(lèi)新生期接種H.pylori疫苗的可行性作一鋪墊。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與儀器哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、H.pylori培養(yǎng)選擇性添加劑購(gòu)自英國(guó)OXIOD公司；布氏肉湯購(gòu)自杭州天和有限責(zé)任公司；三元混合氣體(O2、CO2、N2)購(gòu)自貴陽(yáng)申建氣體有限責(zé)任公司；LTB購(gòu)自Sigma公司；恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9272)購(gòu)自上海一恒有限責(zé)任公司。

1.1.2 菌株滅活幽門(mén)螺桿菌NCTC 11637(活菌購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病防治研究所。培養(yǎng)后經(jīng)本室滅活制成終濃度為2×109ml-1的H.pylori滅活菌液，4℃保存?zhèn)溆?[6]。幽門(mén)螺桿菌SS1株(由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng))。

1.1.3動(dòng)物模型BALB/c小鼠(購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所)，清潔級(jí)，雌雄兼用，自由飲水，分籠飼養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1免疫方案根椐不同的免疫劑型將小鼠分為四組(如表1所示)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組為實(shí)驗(yàn)組(8只/組)，Ⅳ組為正常對(duì)照組(8只/組)。用H.pylori滅活全菌體與已經(jīng)溶解的LTB對(duì)各組BALB/c小鼠進(jìn)行灌胃免疫，免疫時(shí)間為出生后第0(24 h內(nèi))、7、21天。第0天免疫時(shí)，將24 h以?xún)?nèi)出生的BALB/c小鼠與母鼠分離3 h后，進(jìn)行灌胃，灌胃完畢，繼續(xù)放入籠中(與母鼠隔離)，4 h后，再次按照上述方法給予第二次灌胃，免疫結(jié)束2 h后，將母鼠放回籠中。第7、21天各免疫1次，第7天免疫前，與母鼠隔離6 h，免疫方法同前，免疫2 h后放回母鼠籠中。

表1實(shí)驗(yàn)分組

Tab.1Group of experiment

第21天免疫前斷食24 h，斷水4 h后進(jìn)行灌胃免疫，2 h后恢復(fù)食水。正常對(duì)照組正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理。

1.2.2攻擊前準(zhǔn)備將哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)第三天的H.pylori SS1株刮取一環(huán)，接種到含30 ml氏肉湯的三角燒瓶里，灌入混合氣體，置37℃水平振蕩培養(yǎng)150次/min，培養(yǎng) 48 h后，取菌懸液涂片革蘭染色鏡檢，觀察是否有雜菌生長(zhǎng)，菌體形態(tài)是否改變；通過(guò)動(dòng)力實(shí)驗(yàn)觀察動(dòng)力是否良好。如觀察結(jié)果正常，收集菌懸液，5 000 r/min離心10 min，收集沉淀，加入PBS使其再次懸浮，放入37℃孵箱10 min，使其恢復(fù)動(dòng)力后，用比濁儀測(cè)定并用PBS調(diào)整至攻擊所需濃度；攻擊菌液為每次攻擊前用新鮮培養(yǎng)物配制。

1.2.3攻擊方法末次免疫兩周后，將Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組小鼠用H.pylori SS1株進(jìn)行活菌攻擊，108CFU/0.2 ml/次，每天灌胃2次，兩次攻擊中間隔6 h，連續(xù)2 d。攻擊前斷食12 h，斷水4 h，用50 μl 3%NaHCO3中和胃酸，20 min以后進(jìn)行活菌攻擊，每日末次攻擊2 h后恢復(fù)飲食。正常對(duì)照組正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行任何處理。

1.2.4胃組織炎性檢測(cè)將活菌攻擊后28 d的各組小鼠及與其年齡相同的正常對(duì)照組小鼠同時(shí)進(jìn)行脫椎脊處死，用碘酒、酒精徹底消毒整個(gè)腹部，然后用無(wú)菌剪刀將其剪開(kāi)，從賁門(mén)到幽門(mén)處剪取胃，置無(wú)菌平皿內(nèi)，沿胃大彎剖開(kāi)，平均分成兩半，一半用于組織病理學(xué)檢測(cè)，用無(wú)菌棉拭子輕輕去除胃內(nèi)容物，在蒸餾水中輕輕漂洗后，放入盛有10%福爾馬林的小瓶?jī)?nèi)固定，送病理科進(jìn)行石蠟切片并行HE染色、瑞氏吉姆薩染色觀察小鼠在活菌攻擊后胃部的炎癥改變，另一半用于H.pylori培養(yǎng)，了解細(xì)菌定植量；高倍鏡下觀察10個(gè)視野固有層淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，判斷炎癥程度。評(píng)分方法如下：慢性炎癥評(píng)分：0分：固有層偶見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；1分：固有層散在淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；2分：固有層有中等量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；3分：固有層大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別在胃粘膜下有淋巴濾泡形成[7]。炎癥活動(dòng)度評(píng)分：0分：固有層偶見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；1分：固有層散在中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；2分：固有層有中等量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；3分：固有層有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

1.2.5H.pylori定植量檢測(cè)按照上述操作，將余下的另一半胃組織放入無(wú)菌EP管內(nèi)，加入100 μl布氏肉湯，用剪刀剪碎組織，再加入1 900 μl布氏肉湯，混勻后，倒入事先準(zhǔn)備好的無(wú)菌玻璃勻漿器內(nèi)進(jìn)行充分勻漿，然后將組織勻漿液分別做1∶10，1∶100，1∶1 000稀釋?zhuān)謩e接種100 μl到含H.pylori選擇性添加劑的哥倫比亞血瓊脂內(nèi)，用傾注法培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，最后將平皿置培養(yǎng)罐內(nèi)，充入混合氣體，37℃培養(yǎng)5~7 d，觀察菌落，進(jìn)行涂片染色鏡檢、觸酶、氧化酶及快速脲酶試驗(yàn)并計(jì)數(shù)。

2結(jié)果

2.1活菌攻擊后胃組織炎癥評(píng)分將各組BALB/c小鼠采集的胃組織標(biāo)本進(jìn)行炎癥評(píng)分，從圖1中可以看出Ⅲ組的炎癥評(píng)分明顯低于Ⅰ、Ⅱ組，說(shuō)明使用滅活H.pylori與LTB共同免疫小鼠后，能降低H.pylori攻擊后對(duì)胃組織的病理?yè)p傷作用，結(jié)果顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05.( 如圖1 所示) 。Ⅰ、Ⅱ組病理切片中固有層可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)( 如圖2) 。Ⅲ組的病理切片中亦有不同程度的炎性反應(yīng)，但評(píng)分低于Ⅰ、Ⅱ組。

2.2活菌攻擊后H.pylori定植量檢測(cè)(表2)從表2中可以看出Ⅲ組的活菌定植量低于Ⅰ、Ⅱ組，說(shuō)明使用滅活H.pylori與LTB共同免疫小鼠后，能減少活菌攻擊后的H.pylori體內(nèi)定植量，結(jié)果具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Note：Compared with groupsⅠandⅡ,1)P<0.05.

3討論

早在90年代初期，有關(guān)H.pylori疫苗的研究就已經(jīng)開(kāi)始。近年來(lái)，有著較多關(guān)于H.pylori疫苗的研究。根據(jù)疫苗的構(gòu)成不同，可將其分為全菌疫苗、亞單位疫苗、表位疫苗、載體疫苗等。亞單位疫苗的結(jié)構(gòu)與組成較為明確，是可引起免疫保護(hù)的一類(lèi)蛋白質(zhì)、脂多糖等微生物組分。與亞單位疫苗相比，全菌疫苗的優(yōu)點(diǎn)是能誘發(fā)針對(duì)細(xì)菌各種抗原的免疫應(yīng)答[8]。但是這些蛋白介導(dǎo)的免疫應(yīng)答機(jī)制仍然不十分清楚，另一方面，現(xiàn)在仍然不能確定對(duì)H.pylori整個(gè)菌體有效的理想疫苗，與其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的效應(yīng)因子是什么(例如抗體、CD4+亞群、細(xì)胞因子等)。雖然目前的研究成果沒(méi)能達(dá)到人們的期望值，但致力于H.pylori疫苗各個(gè)方向的研究人員都在不斷的努力。該疫苗的研究成果在中國(guó)較為領(lǐng)先，Zeng等[9]用重組H.pylori疫苗對(duì)6~15歲兒童進(jìn)行口服免疫，結(jié)果顯示服疫苗組能降低H.pylori的感染率。在國(guó)外，Nedrud等[10]用重組的CTA1-UreB3T-DD疫苗對(duì)BALB/c小鼠給予鼻黏膜免疫后，亦產(chǎn)生了良好的免疫反應(yīng)并減少了H.pylori的定植。但他們的實(shí)驗(yàn)對(duì)象多為成年鼠、成人或兒童。

我們將新生BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，因?yàn)檎{(diào)查結(jié)果再次證實(shí)部分H.pylori的感染在幼兒期就已存在[11]。我們希望通過(guò)對(duì)新生嬰兒進(jìn)行疫苗接種后，達(dá)到能在早期預(yù)防H.pylori感染的目的。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在活菌攻擊后，各組均有不同程度的炎癥反應(yīng)。PBS組的炎性反應(yīng)較明顯，多數(shù)胃黏膜固有層及黏膜下層可見(jiàn)較多淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。滅活H.pylori加佐劑組的炎癥評(píng)分結(jié)果低于Ⅰ、Ⅱ兩組，提示BALB/c小鼠在新生期口服滅活H.pylori與LTB后能一定程度地降低活菌攻擊后胃黏膜的炎性反應(yīng)，但與正常對(duì)照組比較還存在一定差異?；罹ㄖ擦繖z測(cè)所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，滅活H.pylori加佐劑組在活菌攻擊后的細(xì)菌定植量與前兩組比較，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示該組抗原成分能刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答來(lái)減少細(xì)菌的定植。雖然初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人興奮，但還存在著許多待解決的問(wèn)題。由于粘膜免疫的特殊性，我們需要一種對(duì)胃粘膜具有高免疫原性的疫苗來(lái)預(yù)防H.pylori 的感染，這包括對(duì)抗原與佐劑設(shè)計(jì)，免疫方法及途徑的進(jìn)一步探索；我們還需要在新生期機(jī)體免疫機(jī)制方面進(jìn)行更深層次地研究。

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[收稿2015-05-15修回2015-08-26]

(編輯許四平)

·啟事·

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《中國(guó)免疫學(xué)雜志》編輯部

Immunoprotection of gastric mucosa in newborn mice after oral immunization with inactived H.pylori

YANGYu-Xin,JIANGJi-Fu.WomenandChildren′sHospitalofZunyi,Zunyi563000，China

[Abstract]Objective:To explore the Immunoprotection of gastric mucosa in newborn mice after oral immunization with inactived H.pylori .Methods: Thirty-two BALB/c mice were randomly divided into four groups,including PBS control group(groupⅠ),the group of inactivated H.pylori(groupⅡ),the group of inactivated H.pylori and Escherichia cole heat-labile enterotoxin B subunit(LTB)(group Ⅲ),and normal group(group Ⅳ).Newborn BLAB/c mice within 24 hours were immunized through oral gavage with corresponding antigen,Two weeks after final immunization,the mice were challenged with 1×108CFU live H.pylori strain SS1,twice once day,for 2 days.The twenty-eighth day post-challenge,all of mice were sacrificed and stomachs were removed for grades of inflammation and The counting of H.pylori colonizing.Results: The mean scores of stomach tissue inflammation of groupⅠ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ were 2.25±0.46，2.12±0.35，1.5±0.53，0.25±0.46,respectively,and the score of inflammatory activity of the above four groups were 2.12±0.35，2.12±0.35，1.37±0.52，0.25±0.46.Among these four groups,the results were statistically significant between any two groups except the result between groupⅠand group Ⅱ.Finally,H.pylori colonization quantity in the stomachs of group Ⅲ was lower than groupⅠand group Ⅱ(P< 0.05),as expected,the H.pylori colonization was undetectable in group Ⅳ.Conclusion: The oral gavage with inactived H.pylori plus LTB to newborn mice may be associate with the lightening of inflammation and the decrease of H.pylori colonizing number.

[Key words]Inactivated H.pylori;LTB;Newborn BALB/c mice;Immunoprotection

通訊作者及指導(dǎo)教師：江吉富(1956年-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事感染與免疫研究，就職于遵義醫(yī)學(xué)院，E-mail: jifujiang@163.com。

作者簡(jiǎn)介：楊鈺欣(1983年-)，女，碩士，主要從事感染與免疫研究，就職于遵義醫(yī)學(xué)院，E-mail: yangxx_123@126.com。

中圖分類(lèi)號(hào)R392.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)02-0201-04