許文景　黃冬云　陳　平　徐興祥

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，長(zhǎng)沙410011)

microRNA-Let-7a在肺癌患者中的表達(dá)及其抑癌機(jī)制的探討①

許文景黃冬云陳平徐興祥①

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，長(zhǎng)沙410011)

[摘要]目的：探討非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)患者血清和肺癌組織中microRNA-Let-7a表達(dá)水平以及對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲和增殖影響。 方法：選取我院50例NSCLC患者為研究組，50例同期體檢健康者為對(duì)照組，采用Real-time RCR檢測(cè)肺癌患者腫瘤組織和血清中microRNA-Let-7a表達(dá)水平；對(duì)肺癌細(xì)胞株A549轉(zhuǎn)染microRNA let-7a mimics后，transwell法觀察microRNA-Let-7a對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲的影響，CCK-8法檢測(cè)肺癌細(xì)胞增殖的變化； Real-time RCR及Western blot檢測(cè)了A549中k-Ras mRNA及蛋白水平。 結(jié)果：microRNA-Let-7a在肺癌患者血清中的表達(dá)水平顯著低于正常健康人群，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在腫瘤組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染microRNA let-7a mimics后，A549的侵襲和增殖能力顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A549中k-Ras mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； 結(jié)論：microRNA let-7a在肺癌患者腫瘤組織和血清中低表達(dá)，并可減弱肺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力，且可能通過(guò)Ras信號(hào)途徑發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞]microRNA-Let-7a；NSCLC；增殖；侵襲；k-Ras

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是目前世界范圍內(nèi)致死率最高的腫瘤，預(yù)后較差[1]。其中80%是非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)[2]，研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者的5年生存率僅為15%，并且復(fù)發(fā)率很高[3]。目前肺癌的治療仍以手術(shù)切除為主，輔以放療和化療。肺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸是個(gè)極其復(fù)雜、多基因參與的過(guò)程，但發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注肺癌細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)對(duì)肺癌的影響。microRNA是真核生物中小分子非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)約22~24個(gè)核苷酸，通過(guò)和miRNA3′-UTR 非翻譯區(qū)的堿基配對(duì)來(lái)調(diào)控mRNA的翻譯與降解[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)多種microRNA在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中表現(xiàn)為促癌或者抑癌作用。microRNA-Let-7a是最早發(fā)現(xiàn)的microRNA之一，已證實(shí)microRNA-Let-7a參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡、個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝以及病毒感染等過(guò)程[6]，并且在卵巢癌[7]、乳腺癌[8]等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)。microRNA-Let-7a對(duì)肺癌細(xì)胞影響的報(bào)道尚少，本文旨在研究microRNA-Let-7a在肺癌患者組織和血清中的表達(dá)，對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲及增殖能力的影響，從而對(duì)于肺癌的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料研究組： 選取2013年9月~2015年6月期間，本科室肺癌手術(shù)患者50例為研究組，男38例，女12例，年齡29～75歲，平均年齡(46.7±8.7)歲。所有患者術(shù)前均未經(jīng)介入或放化療等治療，均接受了肺癌根治性切除術(shù)，所有患者術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌，且未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，排除合并其他慢性病如高血壓、糖尿病或其他腫瘤等的患者。

對(duì)照組： 為同期健康體檢人群50例，其中男32例，女18例，年齡31～73歲，平均年齡(51.8±6.1)歲。留取肺癌患者和正常健康組外周血2 ml，靜置6 h后，離心取上清；于腫瘤組織術(shù)中離體30 min內(nèi)留取肺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織，待測(cè)。

1.1.2主要試劑肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；microRNA let-7a mimics、穩(wěn)定陰性對(duì)照l(shuí)et-7a -NC和引物U6、GAPDH、K-ras購(gòu)自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒Trizol購(gòu)于Gibco公司；Real-time PCR試劑盒購(gòu)自ROCHE公司；抗K-ras抗體購(gòu)自Abcam公司；抗β-actin抗體購(gòu)自SantaCruz公司；羊抗兔二抗購(gòu)自SantaCruz公司；CCK-8購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞在含10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以1×105個(gè)細(xì)胞/平皿接種于25 ml培養(yǎng)瓶平皿，置于37℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱，孵育細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體2000(美國(guó)Invitrogen公司)對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549中microRNA let-7a的轉(zhuǎn)染，并以PBS、let-7a -NC作為對(duì)照，于48 h后檢測(cè)其干擾效率。

1.2.3檢測(cè)指標(biāo)

Real-time PCR檢測(cè)microRNA let-7a表達(dá)水平：將留取的肺癌患者及對(duì)照血清、腫瘤組織和轉(zhuǎn)染后A549，依照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，以U6作為內(nèi)參，Real-time PCR檢測(cè)microRNA let-7a的表達(dá)水平。

Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后A549中k-Ras mRNA表達(dá)水平：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞，用Trizol提取各組總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，依照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，測(cè)定k-Ras mRNA的變化。k-Ras引物正向：5′-TTGATTTGTCAGCAGGACCA-3′；反向：5′-GAGAGTTTCACAGCATGGACTG-3′。PCR使用ABI公司的7900型號(hào)Real-Time PCR儀器，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后A549中k-Ras蛋白表達(dá)水平：轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按照蛋白抽提步驟，提取總蛋白；采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，TBST 洗滌后，分別加入1∶1 000抗k-Ras抗體、1∶500抗β-actin抗體，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后加入1∶5 000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h ，再用TBST 洗滌，化學(xué)發(fā)光并曝光成像。Weastern blot檢測(cè)以β-actin條帶作為內(nèi)參，k-Ras條帶與其比較，觀察k-Ras蛋白表達(dá)變化。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染后肺癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4×105個(gè)/ml，按0.1 ml/孔加入到24孔板懸掛式transwell(millipore公司)小室的上層，小室下層加入1 ml的含有10%血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，對(duì)己遷移至小室下層的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(隨機(jī)選取5個(gè)視野)。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以50%的匯合率接種至96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置不含細(xì)胞的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，37℃，5%CO2，95%濕度下培養(yǎng)24 h后，分別在培養(yǎng)孔加入10 μl CCK-8溶液；孵育2 h，美國(guó)biotek(Elx800)酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm的吸光值，每孔實(shí)測(cè)OD值需減去空白對(duì)照OD值，取三復(fù)孔平均值，記錄OD值。

2結(jié)果

2.1肺癌患者血清中microRNA let-7a的表達(dá)水平microRNA let-7a在肺癌患者血清中表達(dá)顯著低于正常健康人群(表1)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.678，P<0.001)，提示了肺癌患者血清中microRNA let-7a的低表達(dá)水平，可能與肺癌的發(fā)病密切相關(guān)。

表1肺癌患者血清中microRNA let-7a的表達(dá)水平

Tab.1Expression level of let-7a microRNA in serum of patients with lung cancer

Note：Compared with normal group,1)t=17.678，P<0.001

2.2肺癌患者組織中microRNA let-7a的mRNA表達(dá)水平microRNA let-7a在肺癌患者腫瘤組織中 表達(dá)顯著低于對(duì)應(yīng)的癌旁組織(表2)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.845，P<0.001)，提示了肺癌患者腫瘤組織中microRNA let-7a的低水平表達(dá)，可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。

表2肺癌患者組織中microRNA let-7a的表達(dá)水平

Tab.2Expression level of let-7a microRNA in tissue of patients with lung cancer

Note：Comparison with adjacent tissues,1)t=22.845，P<0.001

2.3肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后microRNA let-7a mRNA表達(dá)水平變化肺癌細(xì)胞株A549轉(zhuǎn)染microRNA let-7a mimics后，同對(duì)照相比，microRNA let-7a mRNA的表達(dá)水平顯著升高(圖1)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示高表達(dá)microRNA let-7a肺癌細(xì)胞構(gòu)建成功。

2.4肺癌細(xì)胞中microRNA let-7a對(duì)細(xì)胞增殖的影響肺癌細(xì)胞A549轉(zhuǎn)染microRNA let-7a mimics后，同對(duì)照相比，肺癌細(xì)胞增殖顯著減少(圖2)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示了microRNA let-7a具有增強(qiáng)肺癌細(xì)胞增殖的能力。

2.5肺癌細(xì)胞中microRNA let-7a對(duì)細(xì)胞侵襲功能的影響肺癌細(xì)胞A549轉(zhuǎn)染microRNA let-7a mimics后，同對(duì)照相比，transwell小室下層細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖3)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示了microRNA let-7a具有增強(qiáng)肺癌細(xì)胞侵襲的能力。

2.6肺癌細(xì)胞A549轉(zhuǎn)染microRNA let-7a mimics后k-Ras mRNA和蛋白表達(dá)影響為了探討microRNA let-7a對(duì)于肺癌細(xì)胞A549侵襲能力的影響機(jī)制，我們檢測(cè)轉(zhuǎn)染microRNA let-7a mimics基因后肺癌細(xì)胞的k-Ras mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，k-Ras mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(圖4)，提示microRNA let-7a可能是通過(guò)促進(jìn)肺癌細(xì)胞k-Ras的表達(dá)影響癌細(xì)胞的侵襲能力。

3討論

肺癌是目前為止世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。全世界每年新發(fā)肺癌病例數(shù)為180多萬(wàn)，占所有惡性腫瘤新發(fā)病例的13%，每年肺癌導(dǎo)致的死亡患者約160萬(wàn)，占所有惡性腫瘤死亡人數(shù)的19.4%[9]。在我國(guó)，肺癌的發(fā)病率和死亡率一直居于所有腫瘤的首位，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年我國(guó)肺癌發(fā)病率占所有惡性腫瘤的19.59%，死亡率占所有惡性腫瘤的24.89%[10]，而且多數(shù)肺癌患者就診時(shí)已經(jīng)是晚期。因此，特異性的基因調(diào)控靶點(diǎn)對(duì)于肺癌的診斷和治療至關(guān)重要。

microRNA作為一種在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的約22~24個(gè)核苷酸大小的小分子RNA，廣泛的存在于組織、血漿或血清以及其他體液中，且在體內(nèi)表達(dá)比較穩(wěn)定。microRNA let-7家族是最早發(fā)現(xiàn)的microRNA 之一，具有組織特異性、高度保守性和時(shí)序性[11]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，microRNA let-7a的表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在腫瘤中起到“抑癌基因”的作用，可作為腫瘤診斷和判斷預(yù)后的檢測(cè)指標(biāo)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清中microRNA let-7a的表達(dá)顯著低于同期健康人群；此外，肺癌患者腫瘤組織中的microRNA let-7a的表達(dá)顯著低于相對(duì)應(yīng)的癌旁組織，結(jié)果均提示microRNA let-7a在肺癌患者血清和腫瘤組織中的表達(dá)水平的變化可能是調(diào)控肺癌細(xì)胞中的信號(hào)途徑，參與肺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。Sakurai等[13]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者體內(nèi)microRNA let-7a表達(dá)水平下降，且LIN28通過(guò)抑制microRNA let-7a的成熟，參與乳腺癌的發(fā)病，這些結(jié)果從側(cè)面支持了本研究。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和增殖能力與腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)速度密切相關(guān)，影響著腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[14,15]。本研究通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，在A549細(xì)胞株內(nèi)高表達(dá)microRNA let-7a，同低表達(dá)microRNA let-7a的A549細(xì)胞株相比，通過(guò)transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)microRNA let-7a的肺癌細(xì)胞的侵襲能力顯著弱于低表達(dá)microRNA let-7a的肺癌細(xì)胞，說(shuō)明microRNA let-7a表達(dá)水平的高低影響著肺癌細(xì)胞的侵襲能力。此外，本研究運(yùn)用CCK-8實(shí)驗(yàn)研究肺癌細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)microRNA let-7a肺癌細(xì)胞的增殖能力顯著弱于低表達(dá)microRNA let-7a的肺癌細(xì)胞，說(shuō)明microRNA let-7a表達(dá)水平越高，肺癌細(xì)胞的增殖能力越弱。microRNA let-7a的表達(dá)水平影響肺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力。這與Wang等[16]在結(jié)腸直腸癌中的研究結(jié)果是一致的。

Ras癌基因在人類(lèi)腫瘤中常發(fā)生突變激活，尤其是在胰腺癌、結(jié)腸癌和肺癌等腫瘤中[17]。在肺癌的Ras基因家族點(diǎn)突變中90%為k-Ras基因突變，約25%的非小細(xì)胞肺腺癌中發(fā)現(xiàn)k-Ras基因突變。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)microRNA let-7a的A549中，k-Ras mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示microRNA let-7a可能通過(guò)影響k-Ras的表達(dá)，從而影響肺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力。這與Wang等[18]的研究結(jié)果是一致的。

綜上所述，在肺癌患者血清和腫瘤組織中microRNA let-7a的表達(dá)水平顯著降低，而且高表達(dá)microRNA let-7a可能減弱肺癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力，從而使肺癌生長(zhǎng)速度減慢，侵襲能力下降，這為肺癌診斷和治療的新靶點(diǎn)提供了理論參考依據(jù)。

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[收稿2015-07-25修回2015-08-17]

(編輯倪鵬)

Expression of microRNA-Let-7a in patients of Non-small cell lung cancer and anti-tumor mechanism

XUWen-Jing，HUANGDong-Yun，CHENPing，XUXing-Xiang.DepartmentofRespiratoryMedicine,XiangyaNo.2HospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410011,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of microRNA-Let-7a in the serum and tumor tissue of non-small cell lung cancer(NSCLC) patients and the effects of cancer cell migration and proliferation.Methods: 50 cases of NSCLC patients in our hospital as the study group,50 healthy volunteers were used as control group,we used Real-time RCR to detect the expression of microRNA-Let-7a in the serum and tumor tissue of NSCLC patients.Using microRNA let-7a mimics transfected into A549,the level of cancer cell migration was observed by transwell,the level of cell proliferation was observed by CCK-8,the level of k-Ras was observed by Real-time RCR and Western blot.Results: The expression of microRNA-Let-7a in the serum and tumor tissue of NSCLC patients was significantly higher than the control group,the difference was statistically significant (P<0.05).After microRNA let-7a transfected into A549,the levels of cancer cell migration and proliferation were significantly decreased,the difference was statistically significant(P<0.05),the mRNA and protein levels of k-Ras were reduced inA549 cells,the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion: The expression of microRNA let-7a is low in the serum and tumor tissue of NSCLC patients,and may weaken the levels of cancer cell migration and proliferation through the Ras signaling pathway.

[Key words]microRNA-Let-7a;NSCLC;Migration;Proliferation;k-Ras

作者簡(jiǎn)介：許文景(1976年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肺癌與惡性胸腔積液方面的研究。

中圖分類(lèi)號(hào)R734.2
①蘇北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，揚(yáng)州225001。

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)02-0234-05