嚴(yán)一杰，　黎承楊△，　鄧耀良，　曾國(guó)華，　陶芝偉，　劉云龍，　孫　春，　王　揚(yáng)

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 南寧 530021； 2廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510120)

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體外誘導(dǎo)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞成骨分化*

嚴(yán)一杰1，黎承楊1△，鄧耀良1，曾國(guó)華2，陶芝偉1，劉云龍1，孫春1，王揚(yáng)1

(1廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 南寧 530021；2廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510120)

[摘要]目的： 觀察在體外培養(yǎng)條件下，使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液或不同濃度鈣離子誘導(dǎo)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞發(fā)生成骨分化的效果，初步探討腎臟Randall斑形成可能的細(xì)胞機(jī)制。方法: 體外培養(yǎng)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為5組：成骨誘導(dǎo)組(加成骨誘導(dǎo)液)、CaⅠ組(加0.5 mmol/L Ca2+液)、CaⅡ組(加1.5 mmol/L Ca2+液)、Ca Ⅲ 組(加2.5 mmol/L Ca2+液)和對(duì)照組(加PBS)。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)至第1、3、6、9天時(shí)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；誘導(dǎo)至第9天時(shí)，用細(xì)胞鈣茜素紅染色液和鈣鈷法磷酸酶染色液對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察鈣結(jié)節(jié)形成和堿性磷酸酶的表達(dá)情況。另外，分別采用real-time PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的 mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果: 在1.5 mmol/L 和2.5 mmol/L Ca2+濃度條件下細(xì)胞的活力明顯受抑制。細(xì)胞染色結(jié)果證實(shí)成骨誘導(dǎo)液組和鈣離子組均可以見(jiàn)到典型的紅色鈣結(jié)節(jié)和黑色塊狀的硫化鈷沉淀物。成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞Runx2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量(0～9 d)逐漸升高(P<0.05)；誘導(dǎo)至第9天時(shí)，3個(gè)鈣離子組細(xì)胞Runx2的mRNA和蛋白表達(dá)呈濃度依賴性升高(P<0.05)。結(jié)論: 在體外培養(yǎng)環(huán)境下，人腎成纖維細(xì)胞可以在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液的刺激作用下發(fā)生成骨分化；另外，在高鈣離子環(huán)境，人腎成纖維細(xì)胞也發(fā)生了類似的成骨分化。腎乳頭組織中的成纖維細(xì)胞在高鈣離子等因素的作用下發(fā)生成骨分化，這可能是腎臟Randall斑形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]人腎成纖維細(xì)胞； 成骨分化； 腎乳頭鈣化斑； 高鈣尿癥； 腎結(jié)石

腎結(jié)石的起源問(wèn)題是當(dāng)前結(jié)石研究的重要問(wèn)題。根據(jù)臨床病例觀察和腎臟標(biāo)本病理分析的研究結(jié)果，腎乳頭鈣化斑塊Randall斑的形成被認(rèn)為是結(jié)石形成最可能的起點(diǎn)，在誘導(dǎo)結(jié)石晶體異質(zhì)成核并最終形成結(jié)石的過(guò)程中起重要的作用[1-3]。Randall斑形成的機(jī)制目前尚未明確，高鈣尿、尿液的酸化和水的濃縮都被推斷在Randall斑的形成中發(fā)揮作用，其中，高鈣尿的作用特別值得關(guān)注[4-5]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，腎間質(zhì)組織鈣化形成可能與腎組織細(xì)胞成分發(fā)生成骨分化有關(guān)[1, 6-8]。我們推測(cè)，作為腎間質(zhì)主要細(xì)胞成分之一的成纖維細(xì)胞可能存在成骨分化的潛能，并在高鈣離子等病理因素的作用下發(fā)生成骨分化，這可能是腎間質(zhì)組織Randall斑形成的細(xì)胞基礎(chǔ)。本研究建立體外細(xì)胞培養(yǎng)體系，使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基或不同濃度的鈣離子誘導(dǎo)人腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，觀察成骨分化的效果。

材料和方法

1主要材料

人腎成纖維細(xì)胞(上海齊陰生物科技有限公司)；細(xì)胞茜素紅鈣染色試劑盒和堿性磷酸酶染色液試劑盒(Jason)； I 抗Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2, Runx2) 抗體( Sigma)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR 相關(guān)試劑、人Runx2、β-actin引物(TaKaRa)。

2成骨誘導(dǎo)液和含鈣離子培養(yǎng)液的配制

傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液[9]包含DMEM/F12、10% 胎牛血清、1%雙抗、1% β甘油酸磷酸鈉、0.1%地塞米松、0.5%維生素 C。

高鈣離子培養(yǎng)液：取二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)粉劑用生理鹽水分別稀釋為5、15、25 mmol/L，高壓滅菌后于-20 ℃保存。使用時(shí)，用DMEM/F12稀釋10倍。

3實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)組：① 成骨誘導(dǎo)組(加成骨誘導(dǎo)液)； ② CaⅠ組(加0.5 mmol/L Ca2+液)；③ CaⅡ組(加1.5 mmol/L Ca2+液)；④ Ca Ⅲ 組(加2.5 mmol/L Ca2+液)；⑤ 對(duì)照組(加PBS)。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)至第1、3、6、9天時(shí)，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。誘導(dǎo)至第9天時(shí)，用細(xì)胞鈣茜素紅染色液和鈣鈷法磷酸酶染色液對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察鈣結(jié)節(jié)形成和堿性磷酸酶的表達(dá)情況。另外，成骨誘導(dǎo)組在成骨誘導(dǎo)的第0、3、6和9天，3個(gè)鈣離子組在成骨誘導(dǎo)的第9天時(shí)，分別采用real-time PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Runx2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。

4實(shí)驗(yàn)方法

4.1MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組的細(xì)胞活力取生長(zhǎng)良好的第 4 代的人腎成纖維細(xì)胞，以 2×107/L 的密度接種于 96 孔板，細(xì)胞融合后，按分組情況更換含 10% 胎牛血清 的不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每組設(shè) 10 個(gè)孔，每 2 d換液，在第1、3、6、9、10天分別取出各組相應(yīng)孔板，每孔加入 20 μL 的 MTT 溶液，37 ℃孵育 4 h 后，棄上清液，每孔加入 150 μL DMSO，混勻。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于 490 nm 波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度(A)值。以時(shí)間為橫軸，以A值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

4.2細(xì)胞鈣茜素紅染色對(duì)誘導(dǎo)至第9天的成骨誘導(dǎo)組、CaⅠ～Ⅲ組和對(duì)照組行細(xì)胞茜素紅鈣染色，染色過(guò)程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。茜素紅和鈣離子以鰲和方式形成復(fù)合物，用以識(shí)別組織細(xì)胞的鈣鹽成分。鈣鹽變化是骨細(xì)胞增殖分化和骨組織成骨潛能的標(biāo)志之一。通過(guò)茜紅素染色，有鈣鹽成份則產(chǎn)生桔紅色沉積。

4.3堿性磷酸酶Gomori改良鈣鈷法染色CaⅠ～Ⅲ誘導(dǎo)組和對(duì)照組培養(yǎng)至第9天時(shí)，行堿性磷酸酶Gomori改良鈣鈷法染色：取出細(xì)胞爬片，PBS緩沖液沖洗2次后冰乙醇固定10 min，雙蒸水沖洗3次。于孵育底液中37 °C孵育5 h后，蒸餾水沖洗1 min。2%硝酸鈷中浸5 min后，蒸餾水沖洗3次。1%的硫化銨浸洗1 min ，自來(lái)水沖洗，自然干燥，封固。倒置顯微鏡下觀察拍照，酶所在陽(yáng)性部位為黑色硫化鈷沉淀。

4.4Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Runx2 mRNA的表達(dá)水平單層培養(yǎng)細(xì)胞，直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，按總RNA提取試劑盒操作說(shuō)明步驟提取總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA的濃度。反轉(zhuǎn)錄cDNA合成采用20 μL體系(含待測(cè)RNA 1.0 μg，oligo dT Primer 1 μL，Random 6 Primers 1 μL，PrimeScriptTMRT enzyme Mix I 1 μL，5×PrimeScriptTMbuffer 4 μL)，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。SYBR Green 染料法進(jìn)行PCR定量檢測(cè)。采用20 μL體系[含待測(cè)cDNA 1 μL，上、下游引物各0.6 μL(10 μmol/L)，2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，dH2O 7.8 μL]，95 ℃ 10 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s 共40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。引物由TaKaRa合成：Runx2的上游引物為5’-ATGTGTGTTTGTGTAGCAGCA-3’， 下游引物為5’-TCCCTAAAGTCTCTCGGTATGTGTA-3’，產(chǎn)物大小為199 bp； β-actin的上游引物為5’-CATGTACGTAGCTATCCAGGC-3’，下游引物為5’-CTCCTTAATGTGACGCACGAT-3’，產(chǎn)物大小為250 bp。采用2-ΔΔCt法求得目的基因的相對(duì)表達(dá)量，2-ΔΔCt代表實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組(目的基因Ct值-管家基因Ct值)-對(duì)照組(目的基因Ct值-管家基因Ct值)。

4.5Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞Runx2蛋白的表達(dá)水平向培養(yǎng)皿中加入裂解液，用勺子刮下細(xì)胞，加RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，每孔取50 μg上樣，在12%的SDS凝膠中進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉60 min，加入Runx2 I抗或GAPDH抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，1×TBST充分漂洗(10 min 3次)，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG，室溫60 min，1×TTBS充分漂洗(10 min 3次)，ECL法顯色，陽(yáng)性條帶以Gelpro4 凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，測(cè)其光密度(IA)值，結(jié)果以目的蛋白IA/GAPDHIA作相對(duì)定量值進(jìn)行比較。

5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 11.0軟件包完成統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。正態(tài)資料均數(shù)比較用方差分析，組間差異做組間兩兩比較時(shí)，方差齊用SNK法，方差不齊用Games-Howell法。非正態(tài)性資料用秩和檢驗(yàn)Kruskal-Wallis分析。當(dāng)存在組間差異時(shí)，行變量轉(zhuǎn)換后，再用SNK法行兩兩比較。相關(guān)性用Spearman秩相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1MTT結(jié)果

與對(duì)照組相比較，CaⅡ和Ca Ⅲ誘導(dǎo)組在第1、3、6、9天細(xì)胞活力均受抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞活力在第1、3、6、9天分別與對(duì)照組相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CaⅠ組僅在第9天時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)較對(duì)照組受到抑制(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The cell viability was measured by MTT assay. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol.

圖1MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞存活率

2細(xì)胞鈣茜素紅染色結(jié)果

成骨誘導(dǎo)第9天實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞鈣茜素紅染色出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)陽(yáng)性，而對(duì)照組為鈣結(jié)節(jié)染色陰性，見(jiàn)圖2。3個(gè)鈣離子組誘導(dǎo)至第9天時(shí)細(xì)胞鈣茜素紅染色結(jié)果顯示鈣離子誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞組隨著鈣離子濃度增加，細(xì)胞鈣茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量、密度逐漸增加，且染色逐漸變深，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The cell Alizarin red S staining of human renal fibroblasts in the osteogenic induction group (×200).

圖2成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞鈣茜素紅染色結(jié)果

Figure 3.The cell Alizarin red S staining of human renal fibroblasts in the three calcium groups (×200).

圖33個(gè)鈣離子組細(xì)胞鈣茜素紅染色結(jié)果

3堿性磷酸酶染色結(jié)果

3個(gè)鈣離子組誘導(dǎo)至第9天時(shí)對(duì)成纖維細(xì)胞行堿性磷酸酶染色，鈣離子誘導(dǎo)各組均出現(xiàn)黑色沉淀，且黑色沉淀的數(shù)量、密度隨著鈣離子濃度的增加而增加。對(duì)照組未見(jiàn)黑色沉定，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The cell alkaline phosphatase staining of human renal fibroblasts in the three calcium groups (×200).

圖43個(gè)鈣離子組細(xì)胞堿性磷酸酶染色結(jié)果

4各誘導(dǎo)組細(xì)胞Runx2 mRNA的表達(dá)水平

成骨誘導(dǎo)組不同誘導(dǎo)時(shí)點(diǎn)與正常對(duì)照組比較，Runx2 mRNA的表達(dá)水平均增高(P<0.05)。成骨誘導(dǎo)組培養(yǎng)第3、6、9天組Runx2 mRNA的表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.52倍、2.23倍和3.07倍，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The mRNA expression of Runx2 in the human renal fibroblast cells in osteogenic induction groups. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 d.

圖5成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞Runx2 mRNA的表達(dá)情況

CaⅠ、CaⅡ、CaⅢ誘導(dǎo)第9天組細(xì)胞Runx2 mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組比較均升高(P<0.05)。CaⅠ組、CaⅡ組、CaⅢ組分別是對(duì)照組的1.68倍、2.87倍和3.92倍。正常培養(yǎng)液組各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞Runx2 mRNA的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖6。

Figure 6.The mRNA expression of Runx2 in the human renal fibroblasts in control and CaⅠ～Ⅲ groups (all induced for 9 days). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol.

圖63個(gè)鈣離子組細(xì)胞Runx2 mRNA的表達(dá)情況

5各誘導(dǎo)組細(xì)胞Runx2蛋白的表達(dá)水平

Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組(0 d)比較，成骨誘導(dǎo)組不同誘導(dǎo)時(shí)點(diǎn)(3、6、9 d)細(xì)胞Runx2的蛋白相對(duì)表達(dá)水平均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖7。

Figure 7.The protein expression of Runx2 in the human renal fibroblasts in osteogenic induction groups. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 d.

圖7成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞Runx2蛋白的表達(dá)情況

誘導(dǎo)至第9天時(shí)， CaⅠ、CaⅡ、CaⅢ 各組細(xì)胞Runx2 蛋白表達(dá)量較對(duì)照組均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖8。

Figure 8.The protein expression of Runx2 in human renal fibroblasts in control and CaⅠ～Ⅲ groups (all induced for 9 days ). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol.

圖83個(gè)鈣離子組細(xì)胞Runx2 蛋白的表達(dá)情況

討論

Randall斑是腎乳頭部位的鈣化斑塊，為腎乳頭表面與上皮下斑塊相關(guān)的損傷部位，出現(xiàn)在74%的結(jié)石患者和43%的結(jié)石無(wú)關(guān)疾病的患者中，其中，含鈣結(jié)石出現(xiàn)的比率最高(草酸鈣88%，磷酸鈣100%)[10]。Evan等[11]認(rèn)為Randall斑是草酸鈣結(jié)石形成的起始點(diǎn)，草酸鈣成核并附著于Randall斑上，進(jìn)一步發(fā)展形成結(jié)石。臨床研究發(fā)現(xiàn)，Randall斑覆蓋的面積與高鈣尿和結(jié)石的數(shù)量呈正相關(guān)[12-13]。因此，Randall斑與高鈣尿和結(jié)石形成關(guān)系密切，值得深入研究。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高鈣尿可導(dǎo)致細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)[14-15]，但有學(xué)者對(duì)腎臟內(nèi)Randall斑進(jìn)行組織活檢研究，發(fā)現(xiàn)Randall斑組織及其周圍組織無(wú)明顯的細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)[5]。這提示我們Randall斑的形成與細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)無(wú)關(guān)，可能另有其它不同的機(jī)制。根據(jù)最近的研究發(fā)現(xiàn)[6]，在特發(fā)性高鈣尿模型大鼠腎組織中，與組織鈣化相關(guān)的蛋白如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)、Runx2、鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(osterix，OSX)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)較正常組表達(dá)顯著升高。隨后又有臨床研究證實(shí)，特發(fā)性高鈣尿癥患者腎乳頭組織異常表達(dá)Runx2、Osterix、BMP2、MSX2，研究結(jié)果提示高鈣尿癥患者腎間質(zhì)的鈣化可能和正常骨形成的生理機(jī)制相似[7-8]。這些研究發(fā)現(xiàn)提示高鈣尿可能通過(guò)刺激腎組織發(fā)生成骨分化而誘導(dǎo)了Randall斑的形成。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)異位組織成骨作用似乎普遍存在。例如，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，血管的鈣化是一種類似于骨質(zhì)礦化主動(dòng)且可以調(diào)控的過(guò)程，該過(guò)程表達(dá)骨形成相關(guān)蛋白如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、OPN、骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)等[16]。Mohler等[17]發(fā)現(xiàn)，提取鈣化的主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)組織細(xì)胞于體外培養(yǎng)的條件下可以向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，該特征與血管平滑肌細(xì)胞一致，均可形成鈣結(jié)節(jié)。這提示主動(dòng)脈瓣鈣化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)可能為瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。腎乳頭部位鈣化斑塊的形成也可能是腎組織發(fā)生成骨分化的過(guò)程。眾所周知，腎乳頭間質(zhì)鈣鹽沉積成分羥基磷灰石本質(zhì)上類似正常骨組織的鈣鹽成分。目前有關(guān)腎乳頭成骨分化的研究仍缺乏，腎組織中哪些細(xì)胞參與了成骨分化仍需要深入研究。

成纖維細(xì)胞同成骨細(xì)胞一樣來(lái)源于中胚葉的間充質(zhì)細(xì)胞，從細(xì)胞的來(lái)源來(lái)說(shuō)，兩者有著相同的來(lái)源，并與成骨細(xì)胞一樣具備新骨形成所必需的所有條件，成纖維細(xì)胞能夠提供基質(zhì)鈣化所必需的 Ca2+，合成、分泌可鈣化的膠原纖絲Ⅰ、Ⅱ型，分泌形成可鈣化的基質(zhì)小泡[18]。研究發(fā)現(xiàn)，某些組織源成纖維細(xì)胞(如嚙齒動(dòng)物和人皮膚成纖維細(xì)胞和支氣管壁成纖維細(xì)胞)具有間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原免疫表型，展現(xiàn)出成脂、成骨、成軟骨等多向分化潛能[19-20]。國(guó)內(nèi)有人總結(jié)表明人體多種組織源成纖維細(xì)胞在體內(nèi)外特殊環(huán)境下均能向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[21]。但是，腎組織源成纖維細(xì)胞是否存在成骨分化的潛能，目前國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。根據(jù)以上研究結(jié)果，我們推測(cè)：腎乳頭組織內(nèi)的成纖維細(xì)胞可能具有成骨分化的潛能，在特定條件下(如高鈣尿環(huán)境)，其可向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致Randall斑的形成，這可能是Randall斑形成重要機(jī)制，對(duì)此，國(guó)內(nèi)外尚缺乏相關(guān)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞在含有地塞米松等成分的傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的刺激作用下，展現(xiàn)出成骨分化潛能。成骨誘導(dǎo)至第9天時(shí)樣本細(xì)胞染色呈現(xiàn)典型陽(yáng)性，而對(duì)照組染色陰性，這提示人腎成纖維細(xì)胞存在成骨分化能力。此外，根據(jù)real-time PCR和Western blot結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)隨著成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Runx2的表達(dá)水平逐漸升高。Runx2是細(xì)胞發(fā)生成骨分化的早期最具特異性的標(biāo)志物，它可以調(diào)控成骨前體細(xì)胞分化為成熟成骨細(xì)胞，并啟動(dòng)下游成骨標(biāo)志性蛋白諸如OCN、OPN、Ⅰ型膠原等的表達(dá)，被認(rèn)為是成骨發(fā)生的關(guān)鍵因子，為成骨分化和成熟所必需[22-23]。因此，本研究結(jié)果提示腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞在成骨培養(yǎng)液的誘導(dǎo)下發(fā)生了成骨分化，人腎成纖維細(xì)胞具備成骨分化的潛能。

高鈣尿是否具有誘導(dǎo)人腎成纖維細(xì)胞發(fā)生成骨分化作用是本研究主要關(guān)注的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，在高鈣離子環(huán)境下，樣本細(xì)胞出現(xiàn)典型的鈣結(jié)節(jié), 類似于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的刺激作用結(jié)果。誘導(dǎo)至第9天時(shí)，3個(gè)鈣離子組與對(duì)照組相比其細(xì)胞表達(dá)Runx2的mRNA和蛋白呈濃度依賴性升高，細(xì)胞Runx2蛋白的表達(dá)水平與mRNA表達(dá)的趨勢(shì)基本一致。另外本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)至第9天時(shí)3個(gè)鈣離子組樣本明顯表達(dá)堿性磷酸酶，而對(duì)照組則為陰性。因此可以認(rèn)為，高鈣離子誘導(dǎo)人腎成纖維細(xì)胞發(fā)生了成骨分化。由于Runx2只是細(xì)胞成骨分化的早期標(biāo)記物，為了確定成骨分化的最終形成，需要進(jìn)一步的研究，包括分析有關(guān)成骨分化過(guò)程中的各種信號(hào)通路以及檢測(cè)成骨分化晚期的特異標(biāo)志性蛋白如OCN和OPN等。

歸納起來(lái)，本研究結(jié)果提示，在體外培養(yǎng)環(huán)境下，人腎成纖維細(xì)胞可以在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液的刺激作用下發(fā)生成骨分化；另外，在高鈣離子環(huán)境，人腎成纖維細(xì)胞也發(fā)生了類似的成骨分化。腎乳頭組織中的成纖維細(xì)胞在高鈣離子等因素的作用下發(fā)生成骨分化，這可能是腎臟Randall斑形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

*[基金項(xiàng)目]浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. LY13H060003)；浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計(jì)劃(No. 2012ZB161)

Induction of osteogenic differentiation of human renal fibroblastsinvitroYAN Yi-jie1, LI Cheng-yang1, DENG Yao-liang1, ZENG Guo-hua2, TAO Zhi-wei1, LIU Yun-long1, SUN Chun1, WANG Yang1

(1DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:assheep@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of osteogenic induction media and the medias containing different concentration of calcium on the induction of osteogenic differentiation of human renal fibroblasts in vitro. METHODS: Cultured human renal fibroblasts were divided into 5 groups in this experiment: osteogenic induction group (osteogenic induction media), CaⅠgroup (0.5 mmol/L Ca2+media), CaⅡgroup (1.5 mmol/L Ca2+media), Ca Ⅲ group (2.5 mmol/L Ca2+media) and control group (PBS). The cell activity in each groups was measured by MTT assay. At 9th day, the cell calcium Alizarin red S staining and alkaline phosphatase (ALP) Gomori calcium cobalt staining were performed respectively to observe the formation of calcium nidus and the expression of ALP. In addition, the expression of Runt-related transcription factor 2 (Runx2) at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot， respectively. RESULTS: The remarkable positive signs which represented the formation of calcium nidus and the deposit of calcium objects in all experiment groups were observed. The mRNA and protein expression of Runx2 in osteogenic induction group increased in accordance with the induction time. Compared with control group, the mRNA and protein expression of Runx2 in the CaⅠ～Ⅲ groups increased gradually in a calcium concentration dependent manner at the 9th induction day. CONCLUSION: Human renal interstitial fibroblasts show the potential activity in osteogenic differentiation induced by osteogenic induction media or high level calcium in vitro, which may be account for the cytological formation of the Randall’s plaque in the kidney.

[KEY WORDS]Human renal interstitial fibroblasts; Osteogenic differentiation; Randall’s plaque; Hypercalciuria; Renal calculi

通訊作者△Tel: 0575-88345836; E-mail: zhangyunbme@126.com

[收稿日期]2015- 05- 19[修回日期] 2015- 08- 31

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2265- 06

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.025

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A