崔新國，郭曉芳，2，周紅寧,2

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西尼羅病毒血清學檢測技術(shù)研究進展

崔新國1，郭曉芳1，2，周紅寧1,2

西尼羅熱(West Nile Fever, WNF)是由西尼羅病毒(West Nile Virus, WNV)感染引起經(jīng)蚊蟲叮咬傳播的一種人獸共患性疾病。WNV在世界上廣泛分布，主要分布在歐洲、中東和北美等地。人對WNV普遍易感，WNF臨床癥狀主要包括高熱、全身乏力、頭痛、肌肉酸痛等，并發(fā)神經(jīng)性疾病致死、致殘率高，早期實驗室診斷WNV 感染對于患者治療和防止疫情暴發(fā)或擴散具有重要價值。實驗室檢測WNV技術(shù)主要包括血清學試驗、病毒分離技術(shù)和分子生物學檢測技術(shù)；其中，血清學檢測仍是目前使用最廣泛的方法，包括中和試驗、酶免疫法、免疫熒光試驗、血細胞凝集抑制試驗和補體結(jié)合試驗等。本文就上述常用的WNV 血清學檢測技術(shù)進行綜述。

西尼羅熱；血清學；檢測

西尼羅熱(West Nile Fever, WNF)是由西尼羅病毒(West Nile Virus, WNV)感染引起經(jīng)蚊子叮咬傳播的一種人獸共患性疾病，主要分布在歐洲、中東和北美等地,逐漸成為了目前世界上流行范圍最廣的蟲媒病毒性傳染病之一[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)WNV主要有Ⅰ譜系和Ⅱ譜系2個基因型，其中Ⅰ譜系是目前WNF的主要基因型，廣泛分布于歐洲、中東和北美等地；Ⅱ譜系僅在非洲小范圍內(nèi)傳播[3-5]。在我國，1988年在云南省洱源縣鳥類體內(nèi)首先檢測到WNV血清學陽性[6]。2004年，中國新疆維吾爾自治區(qū)發(fā)現(xiàn)了94例發(fā)熱合并神經(jīng)性疾病，由于患者標本與日本腦炎病毒存在抗體交叉反應而未能得到確診[7]。2014年楊顯超等[8]對上海地區(qū)幾種動物血清中西尼羅病毒抗體的調(diào)查顯示，馬、珍禽、鴨中WNV抗體陽性率較高分別為67.5%、17.9%和23.3%。WNF起病急，臨床癥狀主要包括發(fā)燒(>38 ℃)、全身乏力、頭痛、肌肉酸痛等，有證據(jù)顯示20%～25%的WNF患者為輕型癥狀，0.67%的患者會出現(xiàn)WNV神經(jīng)性疾病[9-11]。為此，早期診斷WNV感染對于患者預后和防控疫情暴發(fā)或擴散具有重要的意義。目前實驗室檢測WNV技術(shù)主要包括血清學檢測技術(shù)、病毒分離術(shù)和分子生物學檢測技術(shù)。其中，后兩者檢測技術(shù)所需條件、人員、設備要求較高，耗時長，不適合現(xiàn)場檢測WNV疑似病例，而血清學檢測方法是現(xiàn)今使用最廣泛的實驗室檢測WNV方法,如中和試驗(Neutralization Test, NT)、酶免疫法(Enzyme Immunoassay，EIA)、免疫熒光試驗(Immuno-fluorescence Assay，IFA)、血細胞凝集抑制試驗(Hemagglutination Inhibition Assay，HIA)和補體結(jié)合試驗(Complement Fixation test，CFT)等。本文對上述常用的WNV血清學檢測技術(shù)進展做一綜述。

1 中和試驗

最早的中和試驗是采用接種方式將含病毒的樣品接種到試驗動物或雞胚/細胞培養(yǎng)，以觀察病變情況，但早期中和試驗只能初步鑒定出該樣品是否具有病毒感染以及較難確定出病毒種類。Simithburn等[12]采用中和試驗在烏干達、蘇丹、剛果和肯尼亞等國家對當?shù)厝巳洪_展WNV抗體滴度調(diào)查，發(fā)現(xiàn)當?shù)厝巳篧NV抗體水平較高(部分地區(qū)超過50%)。Andayi等[13]在東非吉布提市區(qū)采用該方法對來自324個家庭的1 045成員進行WNV抗體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WNV抗體陽性率為0.6%。由于早期NT交叉反應高、特異性差等特點，目前已被空斑減少中和試驗(Plaque Reduction Neutralization Test，PRNT)替代。Melissa等[14]采用單克隆抗體對傳染W(wǎng)NV-NY2000株的BHK-21-15細胞開展PRNT50檢測，發(fā)現(xiàn)單克隆抗體能夠與WNV表面抗原特異性結(jié)合，且與其它黃病毒無交叉反應，較適合于檢測健康人群先前是否感染過WNV的血清學調(diào)查。近年來，Hofmeister[15]采用PRNT觀察7周齡北美林鴛鴦感染W(wǎng)NV研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染W(wǎng)NV后的第3 d就能檢測到WNV IgM，第5 d檢測到WNV IgG，提示W(wǎng)NV病毒血癥期短但病毒含量高的特點。此外，Gennaro等[16]采用早期血清中和試驗(Serum Neutalization Assay, SN)和PNRT-90兩種方法對38份來自克羅地亞的WNV神經(jīng)性病變病人標本進行 WNV抗體定量比較檢測發(fā)現(xiàn)，兩者方法無顯著差異(P>0.05)，但SN省時省力，不需細胞培養(yǎng)，且使用方便，更適合WNV感染的早期診斷。

2 酶聯(lián)免疫吸附測定法

該方法是以免疫酶技術(shù)為基礎檢測人或動物體液中微量物質(zhì)的一種新型固相免疫測定技術(shù)，是現(xiàn)今測定病毒感染人或動物抗體(IgM/G)應用最廣泛的一種檢測方法。Escribano-Romero等[17]在塞爾維亞采用ELISA和NT兩種方法對279頭圈養(yǎng)豬、318頭野豬和91只狍感染W(wǎng)NV檢測，發(fā)現(xiàn)ELISA WNV陽性分別為43(15.4%)、56(17.6%)和17(18.7%)；同時采用NT對ELISA陽性標本驗證發(fā)現(xiàn)陽性只有6(15.4%)、33(59%)和4(23.5%)，說明ELISA檢測WNV特異性低。Kolawole等[18]采用ELISA方法對Ogbomoso地區(qū)的城市和農(nóng)村居民93份血清標本檢測WNV的IgM和IgG，結(jié)果顯示IgG陽性為19.4%，IgM陽性為12.9%；與其它黃病毒的交叉試驗陽性率為8.6%，說明ELISA檢測WNV抗體敏感性較高，但特異性不強。Medic等[19]采用ELISA和PRNT-90比較檢測塞爾維亞北部的7個不同地區(qū)馬科動物血清中WNV感染情況，共檢測252份標本，結(jié)果ELISA IgG陽性為72份(28.6%)，但采用WNV-2型病毒株P(guān)RNT-90進行驗證陽性僅為48份(19.1%)。此外，Vilibic-Cavlek等[20]在克羅地亞西北地區(qū)搜集了95份臨床疑似感染W(wǎng)NV病人標本，采用ELISA檢測其IgM和IgG抗體，并采用NT進一步驗證，結(jié)果顯示26份標本為陽性(27.4%)，但采用NT對ELISA檢測陽性標本進行驗證僅有20份為陽性，檢測吻合率為76.9%。由于WNV的宿主廣泛，ELISA檢測WNV抗體具有敏感性高，特異性低的特點，與黃病毒具有較高的交叉反應，常需要PRNT進一步驗證。近幾年來，針對上述ELISA特異性較低的特點，不斷研發(fā)出了適用WNV檢測的ELISA技術(shù)，如捕獲法ELISA、表位阻斷ELISA、競爭法ELISA和生物素微球免疫測定法(b-MIA)等。

2.1 捕獲法ELISA 根據(jù)檢測目標不同分為IgM抗體捕獲ELISA(MAC-ELISA)和抗原捕獲ELISAs(ACE)。其中IgM應答通常在WNV感染的第1周內(nèi)才可能檢測到，而且IgM在血漿/血清中一般可持續(xù)47 d，在CSF中可持續(xù)長達100～199 d，甚至在含有病毒血癥獻血者的血漿或血清中可持續(xù)1年[21-22]。Tardei等[23]在羅馬尼亞WNV流行期間采用IgG和IgM捕獲法ELISA檢測290份急性期病人血清/腦脊液中IgG和IgM抗體，結(jié)果在發(fā)病第1周有37%IgG陰性的血清和25%的IgG陰性的腦脊液中檢測到IgM，并且發(fā)現(xiàn)WNV IgM抗體在急性期標本中與其它黃病毒之間未出現(xiàn)交叉反應。對于抗原捕獲ELISAs(ACE)法用于WNV的檢測，Macdonald等[24]研發(fā)出兩種ACE實驗性地用于WNV感染倉鼠的NS1的檢測，其中第一種ACE以一種多克隆抗體血清作為檢測抗體，第二種ACE使用同種單克隆抗體來捕獲和檢測NS1抗原，研究發(fā)現(xiàn)第一種以重組NS1的ACE較第二種方法的特異性和敏感性均較高。Chung等[25]使用兩種不同的單克隆抗體研發(fā)出ACE，該方法可檢測到 0.5 ng/mL 的NS1，通過交叉反應分析顯示該法與DEV和St. Louis EV 之間未有交叉反應,且能有效檢測出WNV感染后3 d血漿中的NS1。Divyasha等[26]利用WNV NS-1抗原制備鼠單克隆抗體，采用ELISA對105份兔血清進行檢測，并通過RT-PCR進行驗證，結(jié)果顯示該方法的靈敏性為97%，特異性為98%。上述研究提示，捕獲法 ELISA檢測WNV具有較高的特異性和敏感性，操作簡便，較適合現(xiàn)場應用，但MAC-ELISA對急性期樣本(感染后3 d)的檢測效果較差，這與WNV IgM出現(xiàn)較晚有關(guān)。

2.2 表位阻斷ELISA 該技術(shù)是采用WNV特異性結(jié)合的血清和WNV單克隆抗體(MAbs)之間存在競爭為原理而制成，常應用在動物感染W(wǎng)NV的診斷[27]。Sotelo等[28]采用表位阻斷ELISA法、病毒中和試驗和血凝抑制試驗，對來自不同地區(qū)的91匹馬科動物、87頭反芻動物和146只野生鳥類檢測，發(fā)現(xiàn)表位阻斷ELISA法WNV陽性率30.8%，特異性為79.5%～96.5%、敏感性100%；又分別用西班牙/2007-WNV株和摩洛哥/2003-WNV株接種鷓鴣后取不同時間血標本檢測，同時進行VNT和表位阻斷ELISA比較研究，發(fā)現(xiàn)阻斷ELISA可以在感染后3 d檢測到WNV抗體，而NT則需要在感染后10 d才能檢測到；對來自西班牙多尼亞拉國家公園的91匹放養(yǎng)馬標本進行表位阻斷ELISA和NT檢測，示表位阻斷ELISA特異性為96.5%，敏感性為100%；對來自南非的236份哺乳動物標本采用表位阻斷ELISA和HAI進行比較檢測發(fā)現(xiàn)，表位阻斷ELISA特異性為79%，敏感性為100%，進一步證實了表位阻斷ELISA可較好地用于動物感染W(wǎng)NV的診斷。

2.3 競爭法ELISA 其原理類似放射免疫測定。Niczyporuk等[29]采用該方法對2010-2014年波蘭42例患腦膜炎或淋巴細胞性腦膜炎病人的血清標本進行WNV抗體檢測，結(jié)果顯示14例病人為陽性(33.33%)，隨后采用病毒微量中和試驗重復檢測后證實，上述陽性標本與JEV群抗原之間存在交叉反應。目前競爭ELISA抑制法有固定的試劑盒，條件要求不高，適合現(xiàn)場操作，但對標本量需求較大。

2.4 生物素微球免疫測定法(b-MIA) 該技術(shù)利用親和素與生物素有較強的非共價親和作用，結(jié)合應用到ELISA技術(shù)上，與酶結(jié)合的親和素分子和與特異性抗體結(jié)合的生物素分子產(chǎn)生反應，具有酶的放大作用，又有酶和底物的催化顯色作用，從而達到檢測未知抗原或抗體分子的目的。Balasuriya等[30]利用重組WNV E、NS1、NS3或NS5蛋白開發(fā)了4種MIA來測定91份疫苗接種或者天然感染的馬血清中的WNV IgG抗體，并通過PRNT進行驗證，結(jié)果顯示重組E蛋白 MIA敏感性為99.3%，特異性為97.4%。Johnson等[31]對美國科羅拉多州CDC搜集的320份MAC-ELISA陽性的WNF病人血清進行MIA對比驗證，發(fā)現(xiàn)90%檢測結(jié)果(288/320份)和MAC-ELISA一致，在交叉反應試驗中，18份的登革熱病人標本僅1例出現(xiàn)交叉反應，說明該方法敏感性高，特異性較強。Johnson等[32]再次于2007年在美國CDC蟲媒病毒病司對285份MAC-ELISA陽性的WNF病人血清進行MIA檢測，結(jié)果顯示MIA的吻合率為92%(262/285份)，經(jīng)過PRNT驗證MIA的一致性為100%。MIA價格低，樣本量只需MAC-ELISA的1/5，可以在4.5 h內(nèi)測定血清和腦脊液中的IgM和IgG抗體，且能區(qū)分黃病毒的人工免疫和自然感染，以及不同時期的感染，但需要實驗室、先進設備和特殊試劑等。

3 免疫熒光技術(shù)(IFA)

利用熒光色素不僅能與抗體球蛋白結(jié)合，也可以與病毒感染的細胞結(jié)合，并可通過顯微鏡進行觀察的原理研發(fā)，可用于檢測或定位各種抗原和抗體。Niedrig等[33]使用IFA和ELISA在南非人間WNF爆發(fā)期間收集的200份血清比較研究，并通過NT進行驗證，結(jié)果顯示，ELISA特異性為99.5%，IFA的特異性為100%。Malan等[34]采用IFA對82份WNV血清和16份腦脊液進行WNV IgG 和IgM檢測，并把檢測結(jié)果與WNV IgG ELISA和Ig M MAC-ELISA結(jié)果進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不僅IgG IFA與IgG ELISA吻合率為92%，敏感性為100%，特異性為90%；IgM IFA與IgM MAC-ELISA吻合率為98%，敏感性為96%，特異性100%，而且認為IFA法在WNV血清學診斷中較ELISA和MAC-ELISA更廉價和敏感。Sanchini等[35]在2011年的第2次WNV感染血清學診斷的外在質(zhì)量保證(External Quality Assurance, EQA)的研究中，對13份WNV陽性的血清標本采用IFA和ELISA比較檢測，ELISA的敏感性IgM為54%，IgG為87%；IFA的敏感性IgM為45%，IgG為86%。但對于WNV譜系Ⅱ，IFA比ELISA更敏感，IgM為91%，IgG為77%。特異性方面ELISA中IgM為94%，IgG為64%；而IFA中IgM為99%，IgG為85%，在IgG的檢測中IFA比ELISA更特異(P<0.05)。但該方法比NT特異性差， IgG IFA與其它蟲媒病毒有廣泛的交叉反應，但IgM IFA則無交叉反應，常用作臨床病例的調(diào)查[33]。

4 血凝抑制試驗(HIA)

該技術(shù)為利用抗表面蛋白(E)抑制禽類紅細胞聚集的原理研制而成，具有廉價，快速，無種屬特異性，不需BSL-3實驗室條件，只需抗原制備等優(yōu)點[36]。Thompson等[37]在特立尼達的動物種群中進行蟲媒病毒血清學陽性率調(diào)查，采用HIA和表面阻斷ELISA方法對58匹當?shù)匚唇臃NWNV疫苗的馬進行WNV抗體檢測，并通過PRNT復核，結(jié)果顯示HIA11例為WNV抗體陽性，10匹馬經(jīng)HIA檢測為陽性(17.2%)，表面阻斷ELISA 7例陽性(12.1%)，說明HIA的敏感性比表面阻斷ELISA高。Lorono-Pino等[38]在墨西哥尤卡坦州對于2002年7-9月搜集的252匹馬標本采用該方法進行WNV抗體篩選，根據(jù)標準方法和鵝紅細胞進行結(jié)合，證實有6匹馬感染W(wǎng)NV。Nicolli等[39]在加拿大的Manitoba省的健康科學中心對2003年5-10月的79名肝移植患者血清進行檢測發(fā)現(xiàn)，20名患者為WNVIgG-EIA陽性，采用HIA對這20份EIA陽性標本驗證示只有4份為陽性，又進行NT和RT-PCR進行驗證全部為陰性。說明HIA敏感性較ELISA低，特異性較NT低。而且，HIA的檢測結(jié)果受非特異性抑制劑影響，且與JEV血清復合群和其它黃病毒血清復合群之間存在廣泛的交叉反應等限制了該方法的應用[36]。

5 補體結(jié)合試驗

根據(jù)抗原抗體復合物可與補體結(jié)合從而消耗掉反應液中已知濃度的補體，以補體消耗的量推測出樣本中抗原或抗體的含量，該方法是過去常用的檢測方法。Autorino等[40]對于1998年WNV流行的意大利托斯卡納地區(qū)的159匹馬采用該方法進行檢測，并通過PCR證實有123匹馬為WNV陽性(78%)，在12匹患病馬的標本中經(jīng)CFT檢測均為WNV陽性，WNV抗體滴度為1∶4～1∶128之間。由于CFT在數(shù)據(jù)分析和結(jié)果判讀方面費時費力，在人類感染W(wǎng)NV的診斷中已很少使用[41]。

6 其它血清學檢測方法

補體依賴的細胞毒(CDC)法，該方法用于檢測馬血清中WNV NS1抗體的試驗發(fā)現(xiàn)它可將WNV感染的馬從JEV感染的馬中區(qū)分開來，較好地用于WNV感染的血清學診斷[42]。表面增強拉曼散射(SERS)免疫測定法，該方法利用涂覆有納米金的WNV E蛋白作為SERS的反應底物和A/G蛋白一起與拉曼標記孔雀綠共軛結(jié)合作為雙功能的拉曼標記/抗體結(jié)合物，將涂覆有納米金的E蛋白與兔的免疫血清共同孵化后，對夾心免疫復合物進行激光掃描顯示出SERS反應信號，通過特征性集束光譜峰在血清中的顯示比例能夠最低檢測出血清中2 ng/mL的抗體，與傳統(tǒng)的免疫檢測方法相比，它的敏感性是間接ELISA的400倍，可替代傳統(tǒng)的ELISA用于哺乳動物WNV感染的檢測[43]。膜電化學檢測法，該方法通過在納米多孔氧化鋁膜上放置一根感應電極，研制出了一種能夠識別病毒顆粒或者病毒E蛋白的基于膜電化學生物傳感器，并根據(jù)IgM抗E蛋白結(jié)構(gòu)域 III 的特點設計出了用于檢測WNV顆粒的特異性生物識別探針。它對于病毒蛋白和全病毒顆粒具有高靈敏性，最低可檢測到4 pg/mL，和 2個顆粒/100 mL[44]。該方法需樣本量少，能夠30 min內(nèi)完成蛋白質(zhì)和病毒顆粒的檢測，在宿主感染早期具有良好應用前景。

5 結(jié) 語

WNV是現(xiàn)今世界上流行范圍最廣的蟲媒病毒之一，嚴重威脅著人類公共健康，特別是兒童、老年人和免疫功能低下者。針對目前WNF并無特效藥物，以支持療法為主，尚無人用疫苗，預防WNV感染最好的方法仍然是防止蚊子叮咬，同時最近分離到的病毒株通過細胞培養(yǎng)和動物接種顯示W(wǎng)NV毒力正在增強[45]。盡管我國近年來在WNV流行病學和臨床特征的認識方面有了明顯提高，而且在實驗室檢測方面有新的發(fā)展，但WNV在我國屬于新發(fā)蟲媒傳染病，迫切需要加大力量研發(fā)出新的WNV血清學檢測技術(shù)，為及時發(fā)現(xiàn)WNF輸入病例和處置奠定基礎。

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Advances in normal serology test for West Nile virus infection

CUI Xin-guo1, GUO Xiao-fang1,2, ZHOU Hong-ning1,2

(1.InstitutionofPathogensandVectors,Pu’erDivision,DaliUniversity,Pu’er665000,China;2.YunnanKeyLaboratoryofArborInfectiousDiseasesPreventionandControlResearch/YunnanPublicHealthCoordinationandInnovationCenterandYunnanArbor-virusResearchCenterofYunnanInstitutionofParasiticDiseases,Pu’er665000,China)

West Nile fever (WNF) is a zoonotic disease which caused by West Nile virus (WNV) and transmitted by mosquitoes. WNV is widely distributed in the world such as Europe, the Middle Eastern, the North America and the other regions. Human are generally susceptible to WNV, its clinical symptoms mainly include high fever, malaise, headache, muscle pains, etc. If patient was complicated by neurological disease, the rate of mortality and disability could be high. Therefore, it is important to early diagnosis WNV infection for the patient treatment and prevention to prevent from its epidemic outbreak and spread. The technologies of laboratory test WNV include serology, viral isolation and molecular biology test, of those WNV serological test is still most important and widely used method, including neutralization test (NT), enzyme immunoassay (EIA), immuno-fluorescence assay (IFA), hemagglutination inhibition assay (HIA) and complement fixation test (CFT), etc.

West Nile fever; serological; test

Zhou Hong-ning, Email: zhouhn66@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.014

云南公共衛(wèi)生與疾病防控協(xié)同創(chuàng)新中心項目(No.2014YNPHXT03)，國家自然科學基金項目(No.81160357,30960327,30660160)，中英學者基金資助項目(Sino-British fellowship trust in UK，313669)

周紅寧，Email：zhouhn66@163.com

1.大理大學病原與生物媒介研究所(普洱分部)，普洱 665000；

2.云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室，云南省公共衛(wèi)生協(xié)同創(chuàng)新中心，云南省蟲媒病毒研究中心，云南省寄生蟲病防治所，普洱 665000

R373.9

A

1002-2694(2016)10-0922-06

2016-04-18；

2016-08-16

Supported by the Incubate projects of Yunnan Public Health and Disease Control-Prevention Collaborative Innovation Center (No. 2014YNPHXT03), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81160357, 30960327, 30660160), and the Program of Sino-British Fellowship Trust in UK (No. 313669)