汪斯衡 蔣佳 陳世益

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與關(guān)節(jié)鏡外科（上海 200040）

蠶絲及其衍生材料在運(yùn)動(dòng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用

汪斯衡 蔣佳 陳世益

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與關(guān)節(jié)鏡外科（上海 200040）

蠶絲作為古老的生物材料，在紡織及醫(yī)學(xué)中已有廣泛應(yīng)用，而近年來新技術(shù)新工藝的發(fā)展也為其在組織修復(fù)，尤其是運(yùn)動(dòng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用帶來新的可能，其強(qiáng)度和生物相容性也提示了其在硬組織修復(fù)中的可能性。本文綜述了蠶絲的生物特性及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)，并總結(jié)了新工藝的產(chǎn)生為其在組織修補(bǔ)方面帶來的可能性。

蠶絲；組織修補(bǔ)；生物力學(xué)；生物相容性

蠶絲作為人類最早使用的自然高聚物，已經(jīng)有3.8億年左右的歷史。蠶絲長久以來就被用于服裝、紡織等各方面，由于其獨(dú)特的強(qiáng)度、疏水性以及色澤等，其織物一直深受歡迎。近來，不少研究注意到其在強(qiáng)度、親水性等各方面的獨(dú)特性質(zhì)并將其用于組織修復(fù)。在運(yùn)動(dòng)損傷的修復(fù)中，蠶絲及其衍生物的運(yùn)用在近幾年取得了許多成果。本文著重說明蠶絲其特性在組織修復(fù)中的優(yōu)勢(shì)以及蠶絲和其衍生物在運(yùn)動(dòng)損傷修復(fù)中的新成果。

1 蠶絲的特性

蠶絲具有良好的延展力，也具有高度的抗張能力。以家蠶的蠶絲為例，受到張力時(shí)，其延展程度可以達(dá)到全長的18%，能夠承受的最大張力可以達(dá)到0.6 GPa，強(qiáng)度可達(dá)70 MJ·m-3[1]。同時(shí)具有如此大的延展性和抗張性是絕大多數(shù)人工合成材料無法達(dá)到的。其延展性目前比較公認(rèn)的原理是其中納米纖絲的排列可在受力下發(fā)生改變，并且能夠在不受力時(shí)恢復(fù)原狀[2]。其力學(xué)強(qiáng)度目前比較公認(rèn)的原理是絲素蛋白中大量存在的β片層二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)排列整齊，其間具有較強(qiáng)的相互作用[3]。

由于蠶絲蛋白固有的物理特性與其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，所以其制備也有一定的要求。人工生產(chǎn)蠶絲需要先將蠶絲溶解制備成水溶液，經(jīng)過脫水、酸化、結(jié)晶等工序完成。其中涉及到的一個(gè)重要步驟是如何使水溶液中具有α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的絲素蛋白結(jié)晶化（crystallize）形成β片層結(jié)構(gòu)。這涉及到晶核形成以及聚集生長兩個(gè)時(shí)相，一些金屬離子，如鉀離子和銅離子在這一過程中起到重要作用[4]。

自然的蠶絲產(chǎn)生過程存在兩個(gè)相間的轉(zhuǎn)變，第1個(gè)相是粘性水溶液相，此時(shí)的絲素蛋白處于從無序到有序變化的過程中，二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主。第2個(gè)時(shí)相為晶化相，其特點(diǎn)是晶格排列規(guī)整，具有疏水性，二級(jí)結(jié)構(gòu)以β片層為主[5]。由于兩個(gè)時(shí)相截然不同的物理性質(zhì)，其后的生物應(yīng)用也受此啟發(fā)分為兩個(gè)不同的方向，一是運(yùn)用晶化相為主的應(yīng)用，主要利用其強(qiáng)度和延展性；二是運(yùn)用水溶液相為主的應(yīng)用，主要利用其親水性和生物相容性。

蠶絲在體內(nèi)的降解主要通過蛋白水解和長期逐漸吸收這兩個(gè)方式實(shí)現(xiàn)[6]。蠶絲在體內(nèi)降解所需時(shí)間超過60天，因此屬于非降解材料。據(jù)估計(jì)蠶絲纖維在體內(nèi)1年內(nèi)會(huì)喪失大部分抗張力，在體內(nèi)2年后就無法在原移植處檢測(cè)到。蠶絲在體內(nèi)的降解受到患者健康狀況、蠶絲類型，蠶絲直徑以及其二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。然而由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)受倫理等多方面限制，這些因素對(duì)蠶絲降解的具體影響尚未完全闡明。Horan等[7]在體外運(yùn)用蛋白酶XIV對(duì)家蠶絲進(jìn)行70多天的降解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)酶可以降解溶于水里的絲素蛋白，但無法降解成片的絲素蛋白，這可能是由于二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊將酶切位點(diǎn)保護(hù)起來使其無法與酶接觸。這也解釋了蠶絲在體內(nèi)需要較長時(shí)間降解的原因。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)蠶絲植入皮下7天后開始降解，而在145天后皮下植入處仍可發(fā)現(xiàn)未降解的蠶絲。

2 蠶絲及其衍生材料在運(yùn)動(dòng)損傷修復(fù)中的作用

蠶絲由于其良好的生物力學(xué)特性，在自然界的可得性以及可預(yù)測(cè)的較長的降解時(shí)間，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面已經(jīng)具有很長的歷史。多年來，家蠶絲已被成功用

作縫線，但是一直有報(bào)道這樣的縫線會(huì)造成由巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)[9]。過去普遍認(rèn)為蠶絲的絲膠會(huì)導(dǎo)致過敏反應(yīng)[10]，而最近的研究則表明單獨(dú)的絲膠或絲素并不會(huì)引起過敏反應(yīng)[11，12]，只有二者結(jié)合在一起時(shí)才會(huì)引起過敏反應(yīng)。因此要避免過敏反應(yīng)只需單獨(dú)應(yīng)用其中一種組分即可。由于在結(jié)構(gòu)上絲素纖維是蠶絲的核心，且在蠶絲的力學(xué)性能中發(fā)揮了重要作用，而絲膠在蠶絲的力學(xué)性能中作用不大，所以通常將蠶絲脫膠后使用絲素蛋白，以獲得良好的生物相容性[13]。

2.1蠶絲直接用于組織修復(fù)

脫膠后的絲素蛋白單絲可制成多種扭曲的結(jié)構(gòu)，包括繩狀、纜狀，紡成紗狀用于組織修復(fù)[14]。Altman等[14]運(yùn)用蠶絲脫膠得到的單絲，經(jīng)過編織纏繞構(gòu)建了人工前交叉韌帶，其在軸向上有一定的力學(xué)強(qiáng)度和延展性。Gellynck等[15]發(fā)現(xiàn)蠶繭直接進(jìn)行脫膠處理后得到的基質(zhì)上有人軟骨細(xì)胞的長入，其長入率與孔隙的多少有關(guān)。Fan等[16]把兔骨髓間充質(zhì)來源干細(xì)胞（bone marrow derived stroma cells，BMSCs）種植在絲素支架上體外培養(yǎng)8 h后移植重建兔的ACL，術(shù)后8周、16周和24周時(shí)，大體觀察、組織學(xué)觀察和力學(xué)測(cè)試的結(jié)果均優(yōu)于無BMSCs的絲素支架對(duì)照組。隨后Fan等[17]在豬的ACL重建實(shí)驗(yàn)中也得到了相似的結(jié)果。這些結(jié)果較為確切地證實(shí)了蠶絲良好的組織相容性。

2.2絲素蛋白膜

絲素蛋白膜可以通過多種工藝來制作，目的是為了改善其表面特性以及機(jī)械強(qiáng)度[18，19]。由于膜內(nèi)成骨是骨組織再生修復(fù)的重要方式之一，而絲素蛋白又具有一定的強(qiáng)度和生物相容性，不少研究嘗試?yán)媒z素蛋白膜為較大骨組織缺損的修復(fù)提供支撐條件。Meinel等[20]制作了一種基于絲素蛋白的可植入片狀支架用以修復(fù)小鼠巨大顱骨缺損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后5周組織工程骨組（以絲素蛋白為支架，負(fù)載細(xì)胞因子以及人間充質(zhì)來源干細(xì)胞）的X線片出現(xiàn)較為明顯的礦化，相比之下單純絲素蛋白組未出現(xiàn)明顯礦化。這一結(jié)果也與組織切片的結(jié)果相符。他們認(rèn)為單純的絲素蛋白膜支架只能提供一個(gè)宿主增殖的合適環(huán)境，長入的細(xì)胞缺少向成熟成骨細(xì)胞分化的傾向。與之相對(duì)，若干在兔顱骨缺損模型中的研究發(fā)現(xiàn)絲素蛋白膜能夠有效地促進(jìn)骨缺損處的骨再生[21，22]。

在絲素蛋白膜促進(jìn)骨質(zhì)再生模型中最有爭議的問題是絲素蛋白本身是否能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化信號(hào)的表達(dá)，這也是骨組織工程應(yīng)用中的重要問題之一。Miyamoto等[23]的研究顯示，絲素蛋白可以觸發(fā)成骨細(xì)胞早期及晚期分化信號(hào)的表達(dá)。如成骨細(xì)胞在和絲素蛋白接觸后的前14天內(nèi)I型膠原蛋白基因（Col1a1）的表達(dá)水平升高，而在40天后骨鈣素（osteocalcin）以及骨調(diào)節(jié)素（osteomodulin）的mRNA水平增加。Jones等[24]也報(bào)道絲素蛋白能夠支持成骨細(xì)胞的粘附和增殖，同時(shí)也能促進(jìn)破骨細(xì)胞的粘附和分化。雖然這些研究結(jié)果顯示絲素蛋白膜在骨組織工程應(yīng)用中的潛力，但用礦化成分或其他高聚物對(duì)絲素蛋白進(jìn)行改良應(yīng)該能改善其成骨能力，有更廣的應(yīng)用前景。

2.3水凝膠

絲素蛋白水凝膠是再生絲素蛋白溶液在酸性環(huán)境下，有脫水劑存在，具備一定的離子條件，經(jīng)聲學(xué)處理和凍干處理后經(jīng)由溶-膠轉(zhuǎn)變得到的[25，26]。這一過程可以通過提高蛋白濃度，提高溫度，添加鈣離子加快[27]。絲素蛋白水凝膠不溶于水，有著多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)材料，如人工皮膚、接觸性鏡片、給藥系統(tǒng)等，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[28]。人造軟骨是絲素蛋白水凝膠的重要應(yīng)用領(lǐng)域。經(jīng)水凝膠技術(shù)形成的絲蛋白支架相較膠原蛋白支架能使軟骨組織形成更穩(wěn)固、更同質(zhì)的結(jié)構(gòu)，相較膠原蛋白支架，其生物降解率更低，并且不需要其他有機(jī)溶劑就能被生產(chǎn)出來[29]。Chao等[30]觀察到絲素蛋白水凝膠基質(zhì)上形成的軟骨在機(jī)械特性和生物化學(xué)特性上都與瓊脂糖上形成的軟骨相似。這提示絲素蛋白水凝膠可作為一個(gè)可降解支架運(yùn)用于組織修復(fù)。Hofmann等[31]將人類骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞種植于一系列支架上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絲素蛋白水凝膠支架上的細(xì)胞增殖速率較膠原支架更高，同時(shí)絲素支架上軟骨粘多糖的沉積也更為均質(zhì)。Diab等[32]將靜電紡絲PCL納米纖維管和絲素蛋白水凝膠構(gòu)成一個(gè)給藥系統(tǒng)，用于大鼠股骨粉碎性骨折模型中骨成型蛋白-2（BMP-2）的給藥，給藥系統(tǒng)使模型取得了更好的成骨效果。Etienne等[33]也報(bào)道絲蛋白水凝膠上種植的成纖維細(xì)胞能夠增殖并且合成蛋白，組織分析顯示，將這一復(fù)合體植入皮下30天后可有血管長入。以上這些研究均提示，經(jīng)水凝膠技術(shù)處理的絲素蛋白具有良好的生物相容性，并且有助于細(xì)胞附著生長，是良好的組織修復(fù)材料。

2.4絲素蛋白支架

如前所述，將絲素蛋白制作成多孔海綿狀結(jié)構(gòu)是目前認(rèn)為較好的生物材料結(jié)構(gòu)，因?yàn)檫@樣的結(jié)構(gòu)能夠較好地模仿體內(nèi)的微環(huán)境，有利于細(xì)胞附著生長[28，34]。形成這種多孔海綿狀結(jié)構(gòu)的方法有靜電紡絲[34]和水凝膠技術(shù)[22]等。

隨著絲素蛋白支架在骨和軟骨組織工程領(lǐng)域應(yīng)用的增加，其機(jī)械強(qiáng)度成為人們關(guān)注的問題。為得到具有更好機(jī)械強(qiáng)度和生物結(jié)局的材料，人們常將無機(jī)[35，36]或有機(jī)[37]的填充物添加入材料制成混合絲蛋白3-D支架，以獲得更好的機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性。通常填充物是在支架制作過程中添加以保證其同質(zhì)性，然而也有

在支架制作完成后加入填充物顆粒的報(bào)道[35]?；旌吓浞皆O(shè)計(jì)的難點(diǎn)在于兩種成分之間的相容性，否則會(huì)造成混合不均、相分離以及組織副反應(yīng)等結(jié)局[38]。絲-絲混合支架是高強(qiáng)度絲蛋白3-D支架的代表之一，Rajkhowa等[39]將碾碎的絲蛋白顆粒混入多孔的絲蛋白海綿中，這一處理顯著地提升了材料的抗壓性，從不足50 kPa提升到了約2.2 MPa。作為改進(jìn)，Mandal等[40]將長度為10～600 μm的絲素蛋白纖維添加入多孔3-D支架中加強(qiáng)其抗壓能力，使抗壓能力達(dá)到13 MPa。

在絲素蛋白支架中混入各種成分以改善其生物特性已成為近年研究的熱點(diǎn)。Chen等[41]將人類胚胎干細(xì)胞來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hESC-MSC）結(jié)合于絲蛋白-膠原蛋白海綿支架上，研究其促腱組織生長能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腱組織能夠均勻地長入支架中，并有一定的強(qiáng)度。Jiang等[36]用將羥基磷灰石添加入水凝膠的方法建立了再生絲素蛋白支架，證明支架能夠在體外增強(qiáng)骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力，為骨組織修復(fù)提供了依據(jù)。Fan等[42]用蠶絲纖維強(qiáng)化了明膠/絲素蛋白雜交支架，并且將間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)于其上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種植于雜交支架上的MSC具有更高的增值率和DNA含量，MSC在支架上分布均勻，并且也可檢測(cè)出軟骨相關(guān)膠原蛋白的表達(dá)，證明MSC在支架上可以向成纖維細(xì)胞分化。

2.5絲素蛋白顆粒

再生絲素蛋白微?？梢詫⒔z素蛋白溶液經(jīng)多種工藝加工而成，如凍干粉碎技術(shù)、噴涂干燥技術(shù)、噴射粉碎技術(shù)、自組裝技術(shù)以及冷凍解凍技術(shù)等[18]。與之相對(duì)，碾磨絲素蛋白顆?？梢灾苯佑山z素蛋白纖維碾磨而成，不需要經(jīng)過化學(xué)溶劑處理[39]。由于得到的顆粒在顯微結(jié)構(gòu)上存在巨大的差別，因此碾磨得到的絲素蛋白顆粒主要用于填充3-D絲蛋白支架，以加強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度，而通過再生技術(shù)得到的絲素蛋白微粒則常用于各種藥物或細(xì)胞因子的給藥[18，39]。因此，如能開發(fā)出一種絲素蛋白顆粒，既能加強(qiáng)支架的機(jī)械強(qiáng)度，又能達(dá)到給藥的目的，將給組織修復(fù)工程帶來很大的推進(jìn)作用[18]。Saran等[43]用可塑性油灰和絲素蛋白顆粒負(fù)載羥基磷灰石、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）等構(gòu)成了BMP-2緩釋系統(tǒng)，結(jié)果顯示這樣一個(gè)系統(tǒng)顯著增加了大鼠C2C12的成骨分化。Fei等[44]將絲素蛋白和銀納米顆粒復(fù)合成顆粒材料，具有有效的抗菌和破壞細(xì)菌生物膜的能力。Bai等[45]報(bào)道采用干燥再溶解工藝并且控制反應(yīng)的溫度和濃度，可以有效地通過自組裝工藝，生產(chǎn)具有不同納米結(jié)構(gòu)的絲素蛋白顆粒，為這一材料的應(yīng)用帶來新的啟示。

3 蠶絲用于運(yùn)動(dòng)損傷修復(fù)的優(yōu)劣

生物修補(bǔ)材料是自然產(chǎn)生或人工合成的一類材料，植入生物體后可通過機(jī)械支持，促進(jìn)局部組織再生與修復(fù)。在考量生物修復(fù)材料的優(yōu)劣時(shí)，首先應(yīng)考慮材料的組織相容性，此外還需考量材料的機(jī)械強(qiáng)度、可降解性等[6，28]。蠶絲及其衍生材料作為生物修補(bǔ)材料的優(yōu)劣如下。

就生物相容性而言，生絲的生物相容性并不理想。未脫膠或脫膠不完全的生絲用于人體時(shí)往往會(huì)引起以巨噬細(xì)胞增多為主要表現(xiàn)的炎癥反應(yīng)，這樣的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致傷口愈合減緩，造成并發(fā)癥增多等[46]。過去普遍認(rèn)為蠶絲的絲膠會(huì)導(dǎo)致過敏反應(yīng)[10]，而最近的研究則表明單獨(dú)的絲膠或絲素并不會(huì)引起過敏反應(yīng)[11，12]，只有二者結(jié)合在一起時(shí)才會(huì)引起過敏反應(yīng)。因此要避免過敏反應(yīng)只需單獨(dú)應(yīng)用其中一種組分即可。因此蠶絲用于組織工程前往往需要先經(jīng)過脫膠處理，常用的方法是在堿性的熱水中浸泡一定時(shí)間[47]。經(jīng)妥善脫膠處理后的絲素蛋白在體內(nèi)不呈現(xiàn)顯著的免疫原性，其抗原性與膠原蛋白相同[13]。

近年來發(fā)現(xiàn)對(duì)絲素蛋白進(jìn)行進(jìn)一步工藝上的處理能夠提高其促進(jìn)局部組織再生的作用和生物相容性[18]。由此衍生出了多種再生絲素蛋白處理工藝，將蠶絲處理成水溶液后，經(jīng)過各種技術(shù)，如噴涂[19]、濕紡[48]、靜電紡絲[34]、凍干法[25]等，依據(jù)其生物效應(yīng)的需要制成多種形態(tài)，如薄膜狀[49]、多孔支架狀[36]等，以達(dá)到不同的組織修復(fù)目的。將絲素蛋白制成薄膜狀或多孔支架狀能較好地增加材料的表面積，在材料本身生物相容性較好的情況下能夠加強(qiáng)組織細(xì)胞在材料表面的附著，促進(jìn)組織修復(fù)[18]。此外靜電紡絲形成的多孔支架和凍干法形成的水凝膠具有與體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)類似的微結(jié)構(gòu)[28]，多項(xiàng)研究也證明在這樣的支架上，干細(xì)胞能更好地分化為有功能的細(xì)胞，從而更好地與周圍組織融合[30-33，42]。

生物力學(xué)強(qiáng)度也是蠶絲作為組織修復(fù)材料的重要原因之一。蠶絲本身即具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，能承受的最大張力可達(dá)0.6 GPa[1]，因此蠶絲最初的應(yīng)用即被用作縫線。然而近年來，蠶絲不再主要以單絲或纖維形式用于組織修復(fù)，各種再生絲素蛋白材料逐漸成為研究的熱點(diǎn)[18]。由于骨和韌帶依然是絲素蛋白組織工程的重要研究領(lǐng)域，因此已有多項(xiàng)研究通過在支架中加入多種填充物[39，40]，或者改變制作工藝[48]以提高支架的機(jī)械性能。目前絲素蛋白支架已有一定的力學(xué)強(qiáng)度，但尚未達(dá)到完全承載骨或者腱負(fù)載所需強(qiáng)度，要做到強(qiáng)度和生物特性俱佳還有待更多研究。

蠶絲在體內(nèi)降解所需時(shí)間較長，蠶絲包埋于皮下后在1年內(nèi)會(huì)失去其力學(xué)強(qiáng)度，2年內(nèi)將無法在包埋處找到[6]，這一較長而又可預(yù)測(cè)的降解時(shí)間與骨及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷愈合所需時(shí)間相匹配。因此將蠶絲用于運(yùn)動(dòng)系

統(tǒng)損傷的修復(fù)已經(jīng)引起人們的關(guān)注[14]。蠶絲降解速度如此之慢主要是由于其中的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)將酶切位點(diǎn)保護(hù)了起來[7]。然而目前常用的各種再生絲素蛋白材料的形成來自于絲素蛋白水溶液[18]，不具有蠶絲本身所具有的高度晶化的結(jié)構(gòu)，因此有可能會(huì)影響到其在體內(nèi)的降解速率，使其強(qiáng)度過早降低。再生絲素蛋白材料生產(chǎn)的工藝非常多，產(chǎn)出的材料由于結(jié)構(gòu)不同在體內(nèi)也有不同的降解速率，然而目前尚未見足夠的文獻(xiàn)說明各種不同的材料在體內(nèi)的降解速率。降解速率過快可能會(huì)影響對(duì)應(yīng)材料在愈合期較長的組織損傷中的應(yīng)用。

4 展望

目前蠶絲已被用于組織工程修復(fù)的多個(gè)方面，其生物相容性問題已在多代人的努力下得到了較好的解決。而新工藝下產(chǎn)生的多孔修復(fù)材料由于其對(duì)細(xì)胞生長的支持作用較好，已成為目前研究的熱點(diǎn)。然而生產(chǎn)出的多孔修復(fù)材料的生物力學(xué)強(qiáng)度是否足夠適用于受力部位的組織修復(fù)成為研究中遇到的新問題。目前已有一些研究改良了支架的機(jī)械特性，但仍不能完全滿足高負(fù)荷部位，如腱、骨以及關(guān)節(jié)等損傷的修復(fù)。如何提高這些材料的強(qiáng)度將是近期研究的一個(gè)方向。此外，多孔絲素蛋白材料的體內(nèi)降解速率尚未得到很好的闡明，對(duì)這些方面的進(jìn)一步研究將有助于更有效地將基礎(chǔ)生物材料學(xué)的研究結(jié)果用于臨床。

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2015.10.25

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）資助（編號(hào)：2015AA033703），國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（編號(hào)：81271958，81370052，81572108），高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金博導(dǎo)類資助課題（編號(hào)：20120071110067）

陳世益，Email：cshiyi@163.com