何思佳，　舒莉萍，　任　濤，　何志旭△

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，貴州 貴陽 550001；2第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腫瘤科，重慶 400042)

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達(dá)努塞替對HL-60細(xì)胞抗腫瘤作用機制的研究*

何思佳1，舒莉萍1，任濤2，何志旭1△

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，貴州 貴陽 550001；2第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腫瘤科，重慶 400042)

[摘要]目的： 探討絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑達(dá)努塞替對人急性髓細(xì)胞白血病(AML)細(xì)胞株HL-60的細(xì)胞周期阻滯、自噬和凋亡的影響。方法: 用MTT法檢測達(dá)努塞替對HL-60細(xì)胞的生長抑制作用；用流式細(xì)胞術(shù)檢測相同時間不同濃度藥物組與同一濃度不同時間組的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬；用Western blot方法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK1/CDC2、 CDK2、 cyclin B1、 P21Waf1/Cip1、P27Kip1和 P53，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-xL、Bcl-2、 Bax、 PUMA、cleaved caspase-3及cleaved caspase-9以及自噬相關(guān)蛋白p-PI3K、PTEN、p-Akt、 p-mTOR、Beclin 1、LC3-I和LC3-II的水平。用共聚焦顯微鏡檢測同時間不同濃度藥物組細(xì)胞的自噬情況。結(jié)果: 達(dá)努塞替能明顯抑制HL-60細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯，可以通過線粒體caspase-3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。結(jié)論: 達(dá)努塞替可通過抑制作為染色體伴侶蛋白且在有絲分裂中調(diào)控染色質(zhì)復(fù)制與分離的極光激酶A/B有效抑制HL-60細(xì)胞生長，引起細(xì)胞周期阻滯、凋亡和自噬發(fā)生，可能是AML臨床治療具有前景的抗腫瘤靶點。

[關(guān)鍵詞]PI3K/Akt/mTOR信號通路； 細(xì)胞周期； 細(xì)胞凋亡； 自噬； HL-60細(xì)胞

急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓細(xì)胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)的一種亞型，以骨髓及外周血中異常增多的早幼粒細(xì)胞為主要特征，占AML的15%，預(yù)后兇險[1-2]。出血并發(fā)癥是導(dǎo)致APL早期死亡主要原因。因此，研究AML新的治療靶點和開發(fā)新藥十分必要。

極光激酶(Aurora kinase)家族是一類結(jié)構(gòu)與功能高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞有絲分裂中起重要調(diào)控作用[3-5]。其活性異常及過表達(dá)可以導(dǎo)致非整倍體的出現(xiàn)及細(xì)胞癌變。Sen等[4]首先發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌中極光激酶A的高表達(dá)，并相繼在胰腺癌和胃癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)極光激酶A的過表達(dá)。而且，極光激酶A和B的過表達(dá)可促進AML的病情進展，增加AML細(xì)胞的增殖能力和侵襲性[6]。因此，抑制極光激酶成為腫瘤治療的新策略。

已有一些靶向極光激酶的抑制劑，且顯示出抑制腫瘤生長的作用，有望進入臨床[7]。絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑達(dá)努塞替(danusertib，Danu；化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1A)是一種有效的泛極光激酶抑制劑，對極光激酶家族成員均有抑制作用，但主要抑制極光激酶B，極具發(fā)展前景[8-9]。目前，國內(nèi)尚未見有關(guān)于使用達(dá)努塞替作用于AML細(xì)胞的基礎(chǔ)研究。

材料和方法

1細(xì)胞株與試劑

人HL-60細(xì)胞株由美國南佛羅里達(dá)大學(xué)周樹鋒教授惠贈。達(dá)努替塞、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Sigma；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自Thermo；細(xì)胞凋亡試劑盒購自BD ；自噬檢測試劑盒購自Enzo Life Sciences；p-Aurora kinase B、Aurora kinase B、p-mTOR、m-TOR、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt抗體均購自于CST；β-actin及II 抗購自于Santa Cruz。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組HL-60細(xì)胞使用含10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)、鏈霉素(100 mg/L)和2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM(Corning)培養(yǎng)液，細(xì)胞在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。實驗分為空白對照組、陰性對照組(0.05%的DMSO)和Danu實驗組。Danusertib實驗組用0.1、1和5 μmol/L的Danu處理HL-60細(xì)胞24 h，或用5 μmol/L Danu處理HL-60細(xì)胞4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h后觀察相關(guān)指標(biāo)變化。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活力取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞加入96孔板， 每孔8 000個。設(shè)空白對照組、陰性對照組(0.05%的DMSO)和Danu實驗組，每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入 MTT試劑，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)3 h，離心去上清，再加入100 μL DMSO，酶標(biāo)儀490 nm處讀吸光值。通過在Danu濃度曲線下細(xì)胞的相對活力值計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期收集各組HL-60細(xì)胞，PBS洗2次，分別以3 mL 70%的乙醇固定于-20 °C過夜，用含有1 g/L RNase A 和50 mg/L PI的PBS重懸細(xì)胞。室溫下避光孵育30 min 后使用流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)檢測G1、S與G2/M期的細(xì)胞分布情況。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡收集各組HL-60細(xì)胞預(yù)冷PBS洗2次，用含有2.5 μL的Annexin V-PE和2.5 μL的7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D,7-AAD；核酸染料)的1×binding buffer 100 μL輕柔重懸細(xì)胞，室溫避光孵育15 min后，加入150 μL 1×binding buffer，在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞死亡率、早期凋亡率及晚期凋亡率。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞自噬收集各組HL-60細(xì)胞，分別用250 μL 1×assay 緩沖液洗滌 1 次，再用250 μL含有0.25 μL Cyto-ID和0.25 μL Hoechst的1×assay緩沖液輕柔重懸細(xì)胞，置于37 °C避光孵育30 min，離心棄上清，分別加入250 μL 1×assay緩沖液輕柔混后移入流式管，置于冰上于1 h內(nèi)于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞自噬率。

2.6Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及PI3K/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)取處于對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，按預(yù)定濃度和時間Danu處理細(xì)胞后，預(yù)冷PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液110 μL冰上裂解，14 000g/min、4 ℃離心15 min，平衡后，100 ℃下變性5 min。35 μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，孵I抗4 ℃過夜，II抗室溫孵育2 h，使用化學(xué)發(fā)光劑Bio-Rad ChemiDocTMXRS 顯影，條帶用Image Lab 3.0 (Bio-Rad)軟件分析。

2.7激光共聚焦顯微鏡觀察HL-60細(xì)胞自噬分別收集0.1、1和5 μmol/L濃度的Danu處理24 h后的HL-60細(xì)胞，1×assay 緩沖液洗滌1次，使用100 μL含有0.25 μL Cyto-ID與0.25 μL Hoechst的1×assay緩沖液輕柔混勻細(xì)胞，37 ℃避光孵育30 min，1×assay緩沖液洗滌3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min后， 1×assay緩沖液洗3次。取5 μL細(xì)胞滴入載玻片，用蓋玻片推片，滴入20 μL含有DAPI的Mouting media(Sigma)并指甲油封片，使用TCS SP2 laser scanning 共聚焦顯微鏡(Leica)，以405/488 nm波長檢測HL-60細(xì)胞自噬信號。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用Prism 5.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行結(jié)果處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較則采用單因素方差分析(one-way ANOVA)結(jié)合Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1達(dá)努塞替對HL-60細(xì)胞活力的抑制

MTT方法檢測結(jié)果顯示，以0.1、1、10、25、50和100 μmol/L Danu處理HL-60細(xì)胞24 h，細(xì)胞生長抑制率分別為97.2%、99.3%、71.5%、61.9%、32.9%和30.1%，與對照組相比，Danu能明顯抑制HL-60細(xì)胞生長(P<0.05)，IC50值為30.19 μmol/L,見圖1B。

Figure 1. The chemical structure (A) and the effect of danusertib (Danu) on the viability of HL-60 cells for 24 h determined by MTT assay (B). Mean±SD.n=3.

圖1達(dá)努塞替的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對HL-60細(xì)胞活力的影響

2達(dá)努塞替對HL-60細(xì)胞中極光激酶B的抑制

如圖2所示，與對照組比較，0.1～5 μmol/L Danu處理HL-60細(xì)胞24 h后細(xì)胞中磷酸化極光激酶B的表達(dá)量均有所降低，其中1和5 μmol/L處理組的降低效應(yīng)最顯著；達(dá)努塞替明顯抑制磷酸化極光激酶B活性，而總極光激酶B表達(dá)量無明顯變化(P<0.05)。

Figure 2. Danusertib (Danu) inhibited the expression of phosphorylated Aurora kinase B in the HL-60 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2達(dá)努塞替抑制HL-60細(xì)胞磷酸化極光激酶B的表達(dá)

3達(dá)努塞替誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞周期G2/M阻滯

用1和5 μmol/L的達(dá)努塞替處理24 h后的HL-60細(xì)胞G2/M期百分率與對照組細(xì)胞相比均顯著增加 (P<0.01)。使用5 μmol/L的達(dá)努塞替在不同時點處理HL-60細(xì)胞后，與對照組細(xì)胞相比G2/M期增加明顯，48 h和72 h差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3A。

Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的結(jié)果顯示，促進細(xì)胞有絲分裂的蛋白質(zhì)CDK1/CDC2、 CDK2和cyclin B1的表達(dá)量顯著降低，相反，抑制細(xì)胞有絲分裂的蛋白質(zhì)P21Waf1/Cip1、P27Kip1和 P53的表達(dá)量顯著增加。24 h的實驗組中cyclin B1的表達(dá)量被顯著抑制，CDK1/CDC2的表達(dá)量僅在5 μmol/L濃度組低于對照組；相反，P27Kip1和 P53的蛋白表達(dá)量與對照組細(xì)胞相比明顯增加,見圖3B。

4達(dá)努塞替通過激活線粒體途徑誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡

5 μmol/L Danu處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)。觀察藥物的時間依賴性可見，使用5 μmol/L的達(dá)努塞替處理細(xì)胞4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h的凋亡百分率分別為8.6%、9.8%、9.8%、10.3%、9.4%和13.4%;其中，在藥物處理24 h和72 h后，細(xì)胞凋亡相對于對照組明顯增加(P<0.01),見圖4A。

0.1～5 μmol/L Danu處理細(xì)胞24 h后,促細(xì)胞凋亡蛋白Bax表達(dá)量較對照組高，而抑制細(xì)胞凋亡的蛋白Bcl-2和Bcl-xL減少。Bcl-2家族下游相關(guān)蛋白cleaved caspase-9與cleaved caspase-3均增加。隨著藥物濃度的增加，PUMA蛋白的表達(dá)量較對照組逐漸增加，見圖4B。5 μmol/L Danu處理不同時間后，與對照組相比，Bax的表達(dá)量在處理12 h、24 h、48 h和72 h后分別增加了1.9、2.0、2.1和2.5倍；相反，Bcl-2從處理4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h 后表達(dá)量卻降低到46.7%、45.7%、27.7%、43.7%、33.7%和18.0%，Bcl-xL的表達(dá)量與對照組細(xì)胞相比降低至87.3%、51.0%、30.3%、35.0%、41.3%和32.7%，見圖4C。

Figure 3. Danusertib (Danu) induced cell cycle arrest in the HL-60 cells. The cells were treated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h or with 5 μmol/L Danu for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h, and subjected to flow cytometric analysis. The protein samples were subjected to Western blot. A: the bar graphs showing the percentages of HL-60 cells in G1, S and G2/M phases; B: the expression of CDK1/CDC2, CDK2, cyclin B1, P21Waf1/Cip1, P27Kip1, and P53 in HL-60 cells. β-actin was used as the internal control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

圖3達(dá)努塞替誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

5達(dá)努塞替通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬

與對照組細(xì)胞相比，0.1～5 μmol/L Danu處理細(xì)胞 24 h后，細(xì)胞自噬率增加，其中1和5 μmol/L處理組顯著增加。5 μmol/L Danu處理細(xì)胞48 h和72 h自噬率與對照組相比明顯增加，見圖5A。Western blot的實驗結(jié)果顯示0.1～5 μmol/L Danu處理細(xì)胞24 h Beclin 1和LC3-II均呈顯著上升趨勢，見圖5B。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果亦顯示自噬作用隨劑量增加而增強,見圖6。時間效應(yīng)的研究結(jié)果亦一致,見圖5C。

此外，1.5 μmol/L濃度Danu處理組p-PI3K/PI3K比率分別降低至78%和53%。同樣，與對照組相比，p-Akt與總Akt的比值亦降低，然而PTEN的表達(dá)量卻顯著增加。除此之外，細(xì)胞在藥物處理后p-mTOR/mTOR比值降低明顯。綜合上述結(jié)果表明達(dá)努塞替通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生自噬，見圖5B。

討論

在細(xì)胞有絲分裂中極光激酶對中心粒周期、紡錘體變化、染色體分離及胞質(zhì)分裂具有重要調(diào)控作用，并且參與細(xì)胞癌變的發(fā)生與發(fā)展。極光激酶B還是正常胞質(zhì)分裂必不可少的激酶之一，它通過不同的底物分子調(diào)控胞質(zhì)分裂的各個階段。所以，極光激酶理所當(dāng)然成為抗癌治療靶點[10]。

絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑達(dá)努塞替是泛極光激酶抑制劑，作為潛在抗癌藥物已經(jīng)進入臨床II期實驗，具有抗慢性粒細(xì)胞白血病及難治性轉(zhuǎn)移性前列腺癌的活性。在正常細(xì)胞中，其激酶表達(dá)僅在胸腺組織中較高，其余組織中表達(dá)水平很低，因此可以認(rèn)為，此極光激酶抑制劑相對特異性的靶向腫瘤組織，對其它正常組織損傷性較小[11]。而在含有致癌基因Ras-V12的細(xì)胞中，極光激酶B過表達(dá)與促進細(xì)胞癌變與侵襲有關(guān)。同時在肝癌細(xì)胞與胰腺癌細(xì)胞中達(dá)努塞替可通過干擾細(xì)胞有絲分裂與產(chǎn)生多倍體來抑制細(xì)胞增殖[12]。鑒于臨床資料顯示ATRA治療APL存在白細(xì)胞增多癥、維甲酸綜合征和維甲酸耐藥三大弊端，本研究嘗試使用絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑達(dá)努塞替作用于HL-60細(xì)胞，觀察對其生物學(xué)特性的影響，并探討可能涉及的分子機制，以其作為新的小分子靶向制劑的臨床研究打下基礎(chǔ)。

Figure 4.Danusertib (Danu) induced apoptotic death in the HL-60 cells in a dose- and time-dependent manner. A: bar graphs showed the percentages of apoptotic cells in the HL-60 cells treated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h or with 5 μmol/L Danu for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h, and 72 h; B: the expression of Bcl-xL, Bcl-2, Bax, PUMA, cleaved caspase 9 and cleaved caspase 3 in the HL-60 cells treated with Danu for 24 h; C: the relative levels of Bcl-xL, Bcl-2 and Bax in HL-60 cells treated with 5 μmol/L Danu for 0～72 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

圖4達(dá)努塞替誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡且具有劑量與時間依賴性

研究結(jié)果表明，達(dá)努塞替可以顯著抑制HL-60細(xì)胞的增殖，其機制是通過抑制對有絲分裂起促進作用的CDK1/CDC2、 CDK2和cyclin B1蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞周期阻滯因子P21Waf1/Cip1、P27Kip1和 P53蛋白的表達(dá)，引起細(xì)胞周期G2/M阻滯。綜合表明，達(dá)努塞替可引起細(xì)胞周期重新分布，主要阻滯于G2/M期，并呈濃度及時間依賴性。達(dá)努塞替的抗腫瘤效應(yīng)除了降低細(xì)胞增殖作用外，還有促進細(xì)胞凋亡的功能。既往研究發(fā)現(xiàn)達(dá)努塞替可以明顯促進卵巢癌細(xì)胞和乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)生[11-12]。本研究也觀察到，0.1～5 μmol/L的達(dá)努塞替處理24 h后，HL-60細(xì)胞的凋亡率上升到10.0%～13.8%，伴有藥物劑量和作用時間的依賴性。由于Bcl-2家族蛋白在凋亡程序中扮有重要作用，能夠通過不同的分子機制對線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要調(diào)控作用，各種凋亡刺激信號通過BH3蛋白引起B(yǎng)ax蛋白位移到線粒體外膜并多聚化，形成通道以刺激線粒體釋放細(xì)胞色素C和Smac，細(xì)胞色素C再與凋亡蛋白酶caspase-9形成凋亡小體，導(dǎo)致下游通路中的級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展。同時，抗凋亡蛋白Bcl-2可以通過翻譯后修飾或促進PUMA，一種作為通過P53依賴途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白的表達(dá)量產(chǎn)生抑制作用[13]。因此我們通過Western blot檢測了凋亡前體蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)變化。本研究亦證明在達(dá)努塞替作用下，隨著劑量與時間的增加Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)降低，而Bax和PUMA蛋白表達(dá)增加，從而啟動caspase 3級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。

Figure 5.Danusertib (Danu) induced autophagic cell death in the HL-60 cells in a dose- and time-dependent manner. A: the percentages of autophagic cells in the HL-60 cells treated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h or with 5 μmol/L Danu for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h; B: the protein levels of p-PI3K, PI3K, PTEN, p-Akt, Akt, p-mTOR, mTOR, Beclin 1, LC3-I, and LC3-II in the HL-60 cells treated with Danu at 0.1, 1, and 5 μmol/L for 24 h; C: the expression of Beclin 1, LC3-I, and LC3-II in the HL-60 cells treated with Danu at 5 μmol/L for 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h. β-actin was used as the internal control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;#P<0.05,##P<0.01vs0 h group.

圖5達(dá)努塞替誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬且具有劑量與時間依賴性

細(xì)胞自噬是細(xì)胞程序性死亡的重要部分。自噬在細(xì)胞凋亡中扮有重要作用。一般認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞中，在應(yīng)激、放射或化療等情況下，自噬起到保護細(xì)胞作用。Beclin 1 是酵母 Atg6/Vps30同源基因的表達(dá)產(chǎn)物， 最早被發(fā)現(xiàn)時它被認(rèn)為是一種與細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)因子Bcl-2 相互作用的蛋白，而在腫瘤發(fā)生的過程中，則處于上調(diào)細(xì)胞自噬信號通路上最重要的調(diào)節(jié)因子。Beclin 1通常以復(fù)合物Beclin 1/PI3K3C的形式發(fā)揮作用，通過與各種蛋白的相互作用來達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的目的。LC3是唯一的 1 個定位于自噬泡內(nèi)膜、參與多種信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的自噬蛋白。LC3-I為LC3前體ProLC3加工后形成的可溶體，經(jīng)暴露剪切后與自噬泡膜表面PE結(jié)合，得到定位于自噬泡膜上的膜結(jié)合形式的LC3-II，LC3-II則是自噬研究中的主要標(biāo)志物[14]。本研究結(jié)果顯示，達(dá)努塞替能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生自噬。不同濃度達(dá)努塞替處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞自噬率最高可達(dá)到20.3%，激光共聚焦顯微鏡觀察還發(fā)現(xiàn)自噬作用隨劑量增加而增強。本研究還發(fā)現(xiàn)，作為細(xì)胞自噬作用中的關(guān)鍵蛋白Beclin 1和LC3-II表達(dá)量顯著增加，同時作為PI3K的拮抗蛋白PTEN的表達(dá)量也是顯著增加，說明達(dá)努塞替對HL-60細(xì)胞自噬的促進作用具有劑量依賴及時間依賴性。而在關(guān)于涉及自噬的信號通路中，mTOR是一種PI3K相關(guān)激酶，通過mTOR信號復(fù)合物mTORC1和mTORC2形成PI3K-Akt-mTOR信號通路，是細(xì)胞內(nèi)3大主要信號通路之一，PI3K/Akt/mTOR軸具有極其重要的地位和作用[15]。在一些腫瘤細(xì)胞如白血病、卵巢癌等腫瘤中經(jīng)常出現(xiàn)該信號通路的異?；罨⑴c腫瘤細(xì)胞周期、凋亡與自噬的生物學(xué)過程，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖與存活[16]。目前，該通路中的受體及激酶已經(jīng)成為抗白血病的新靶點。PI3K是脂質(zhì)激酶家族成員，能特異性使磷酸肌醇環(huán)上的3-羥基磷酸化，也是PI3K/Akt/mTOR通路中的始動因子。Akt又稱蛋白激酶B，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要蛋白激酶，也是PI3K下游靶蛋白。mTOR是一種與PI3K/Akt通路相關(guān)的蛋白激酶，可以通過磷酸化激活與mRNA翻譯相關(guān)的蛋白來增強轉(zhuǎn)錄與翻譯，同時也能通過磷酸化滅活翻譯抑制蛋白[17]。Akt通過磷酸化mTOR的Ser2448位點激活mTOR，加快腫瘤的發(fā)生[18-20]。同時，PTEN作為PI3K的拮抗蛋白也是一個重要的抑癌蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，PTEN的缺失會導(dǎo)致腫瘤血管的生成增加而加速腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。關(guān)于達(dá)努塞替是否通過干預(yù)PI3K/Akt/mTOR信號通路而誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬的機制在本實驗中也得到印證。Western blot結(jié)果提示達(dá)努塞替對總PI3K、mTOR與Akt表達(dá)量沒有影響，其發(fā)揮自噬作用是通過抑制磷酸化PI3K、mTOR和Akt的表達(dá)來來起作用的。據(jù)文獻報道[19]，在細(xì)胞信號通路中AMPK的磷酸化位點在Thr172時對細(xì)胞自噬具有促進作用，在一些特定的環(huán)境中，AMPK在Ser317和Ser77位點的磷酸化后可直接通過Unc-51樣激酶促進自噬的發(fā)生，并且p38 MAPK的激活可以抑制自噬的發(fā)生，p38 MAPK信號通路在自噬的產(chǎn)生中可能起一定的調(diào)控作用，我們假設(shè)以上調(diào)節(jié)通路也可能影響PI3K-Akt-mTOR通路中產(chǎn)生交叉作用，但調(diào)節(jié)機制尚不十分清楚。值得注意的是，達(dá)努塞替在誘導(dǎo)自噬的同時促進凋亡的發(fā)生。抑制自噬是否可以進一步增敏達(dá)努塞替對HL-60細(xì)胞的殺傷作用，包括體內(nèi)實驗研究，是未來的一個研究方向。

Figure 6. Danusertib (Danu) induced autophagy in the HL-60 cells observed under confocal microscope (×400). The HL-60 cells were incubated with Danu at 0.1, 1 and 5 μmol/L for 24 h and then subjected to confocal microscopy. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖6通過共聚焦顯微鏡檢測達(dá)努塞替誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬

綜上所述，達(dá)努塞替對HL-60細(xì)胞可以抑制細(xì)胞增殖，激活細(xì)胞線粒體凋亡通路與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬來發(fā)揮抗癌作用，這種極光激酶抑制劑可能成為今后抗AML選擇性靶向治療的新策略。

致謝：本課題在美國南佛羅里達(dá)大學(xué)藥學(xué)院周樹鋒教授實驗室完成，周樹鋒教授及周志偉博士等對本實驗設(shè)計、實驗過程及數(shù)據(jù)分析等方面給予了很大支持和指導(dǎo)，在此一并致謝。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Antitumor mechanism of danusertib in human AML HL-60 cells

HE Si-jia1, SHU Li-ping1, REN Tao2, HE Zhi-xu1

(1DepartmentofPediatrics,TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guizhou550001,China;2CancerCenter,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China.E-mail:hzx@gmc.edu.cn)

[KEY WORDS]PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; Cell cycle; Apoptosis; Autophagy; HL-60 cells

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of danusertib, a pan-inhibitor of Aurora kinases, on the viability, cell cycle, apoptosis and autophagy of human acute myelocytic leukemia (AML) HL-60 cells.METHODS: The effect of danusertib on the viability of HL-60 cells was examined by MTT assay. The effect of danusertib on apoptosis of HL-60 cells was quantitated by the flow cytometry using an Annexin V/7-AAD apoptosis detection kit. The effect of danusertib on autophagy in the HL-60 cells was assessed by flow cytometry and confocal microscopic analysis. The levels of various proteins related to the cell cycle, apoptosis and autophagy were determined by Western blot.RESULTS: Danusertib decreased the viability of human AML HL-60 cells and induced the cell cycle arrest in G2/M phase. Danusertib also induced mitochon-drium-dependent apoptosis by activation of caspase-3 and autophagy in the HL-60 cells via inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.CONCLUSION: Danusertib shows effective antitumor ability for promising AML treatment.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 0990- 08

[收稿日期]2015- 12- 07[修回日期] 2016- 03- 11

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 31460312)

通訊作者△Tel: 0851-86908118； E-mail: hzx@gmc.edu.cn

[中圖分類號]R730.23

[文獻標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.005