賈會玉，李中南，陳光亮（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽合肥 30038；.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 3003）

糖尿病腎病中轉(zhuǎn)化生長因子β1/Sma和Mad相關(guān)蛋白信號通路的作用及其相關(guān)藥物研究進(jìn)展

賈會玉1，李中南2，陳光亮1
（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 230031）

轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）參與糖尿病腎?。―N）的進(jìn)程已作為臨床慢性腎病進(jìn)展的重要生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。Sma和Mad相關(guān)蛋白（Smad）是TGF-β家族下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，TGF-β1與受體結(jié)合激活Smad2和Smad3，上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)結(jié)締組織生長因子的轉(zhuǎn)錄，Smad3促進(jìn)系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)積聚和細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腎纖維化；Smad2和Smad7則起著負(fù)向調(diào)控作用，抑制腎纖維化。TGF-β1特異性抑制劑（SB431542等）具有抗腎纖維化作用，大多處在臨床前研究階段，已上市的對DN有一定療效的藥物如苯那普利、阿托伐他汀、氯沙坦和吡非尼酮等可抑制TGF-β1表達(dá)，雷公藤、冬蟲夏草和小檗堿也通過降低TGF-β1水平延緩DN進(jìn)程。本文就近年來TGF-β1/Smad信號通路及其防治藥物在DN中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

糖尿病腎?。晦D(zhuǎn)化生長因子β1；信號通路；藥物

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）以膠原蛋白基質(zhì)過度累積為特征，最終發(fā)展為終末期腎衰竭，而腎間質(zhì)纖維化是其共同途徑和主要病理基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Sma和Mad相關(guān)蛋白（Sma-and Madrelated protein，Smad）信號通路介導(dǎo)系膜細(xì)胞增生、上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）積聚，最終導(dǎo)致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化［1］。TGF-β1是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可作為臨床慢性腎病進(jìn)展的重要生物學(xué)標(biāo)志及主要治療靶標(biāo)［2］?？刂艱N的進(jìn)展不僅要控制血糖，同時要延緩腎纖維化過程。

1　TGF-β11介導(dǎo)腎纖維化和糖尿病腎病的發(fā)生和惡化

TGF-β是一種能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化的生物多肽，由二硫鍵鏈接的2個分子質(zhì)量均為12.5 kμ的亞基組成，以二聚體形式存在的TGF-β才具有生物學(xué)活性。TGF-β有5種亞型，即TGF-β1～TGF-β5，各亞型之間的同源性高達(dá)64%～82%。哺乳動物中主要亞型為TGF-β1～TGF-β3，以TGF-β1最為重要，在骨、肺、腎及胎盤組織中含量豐富。在腎組織中，TGF-β主要分布在腎小球、腎小管以及間質(zhì)中。新合成的TGF-β需要在多種因素（如pH值的波動、活性氧自由基和血纖維蛋白溶酶等）刺激下經(jīng)蛋白酶切去N端的相關(guān)肽才能被激活。

研究發(fā)現(xiàn)，在DN早期，TGF-β1水平及TGF-β1mRNA表達(dá)即明顯升高，實(shí)驗(yàn)動物和DN患者Smad2和Smad3均有較強(qiáng)的表達(dá)，血糖水平與TGF-β1水平存在著明顯的正相關(guān)關(guān)系［3］。用鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）復(fù)制DN模型，第4周和12周大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生，腎組織中TGF-β1和TGF-β2mRNA表達(dá)明顯增加［4］。高糖培養(yǎng)基使腎近曲小管和腎小球細(xì)胞肥大，細(xì)胞中TGF-β1mRNA表達(dá)及蛋白水平均顯著升高［5］。在TGF-β1誘導(dǎo)下成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并導(dǎo)致α平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）及其mRNA的表達(dá)明顯增加。Brennan等［6］使用RNA測序技術(shù)檢測了TGF-β1刺激后，腎小管上皮細(xì)胞2027個基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)生的差異，證實(shí)了TGF-β1介導(dǎo)了腎纖維化和DN的發(fā)生及惡化。

2　TGF-β11/Smad信號通路在糖尿病腎病中的調(diào)節(jié)作用

Smad是TGF-β家族下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，迄今共發(fā)現(xiàn)8種，分別為Smad1～Smad8。根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)和功能，又分為3類［7］，即特異受體調(diào)節(jié)型（RSmad），包括Smad1，Smad2，Smad3，Smad5和Smad8；公共調(diào)節(jié)型（co-Smad），包括Smad4 （TGF-β信號分子在進(jìn)入細(xì)胞核前，必須同Smad4結(jié)合才能將信號傳導(dǎo)）；抑制型（Ⅰ-Smad），包括Smad6和Smad7（它們在TGF-β信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮抑制作用）。TGF-β1與TGF-βⅠ型受體（TGF-β receptor typeⅠ，TβR-Ⅰ）和TβR-Ⅱ結(jié)合形成TβR-Ⅱ-TGF-β1-TβR-Ⅰ三聚體才能被Smad2和Smad3所識別，將信號繼續(xù)傳導(dǎo)［8］。被激活的Smad2和Smad3進(jìn)一步將信號傳遞給Smad4，并與Smad4形成復(fù)合體，上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的轉(zhuǎn)錄，同時誘導(dǎo)Smad7啟動子轉(zhuǎn)錄增加［1］。CTGF介導(dǎo)細(xì)胞遷移、侵襲、血管發(fā)生和細(xì)胞凋亡，促使膠原及纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積，可能是最終導(dǎo)致組織器官纖維化的關(guān)鍵因子［9］。

在多種DN小鼠模型上證明了Smad3在腎纖維化中起關(guān)鍵作用［10］。敲除Smad3基因的小鼠和細(xì)胞，則抑制了細(xì)胞纖維化；敲除Smad2基因的腎小管上皮細(xì)胞及胚胎成纖維細(xì)胞給予TGF-β1刺激，細(xì)胞內(nèi)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ及降解酶抑制劑7、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）抑制劑-1表達(dá)增加，ECM降解酶8和MMP-2表達(dá)降低，細(xì)胞纖維化［11］。在對腎小管上皮細(xì)胞9和人腎小管上皮細(xì)胞（human kidney 2，HK-2）的研究中，Smad2和Smad3對TGF-β1表現(xiàn)出了相反的應(yīng)答，Smad2小分子干擾RNA未能降低細(xì)胞纖維化，甚至細(xì)胞纖維化有所增強(qiáng)［12］。而抑制Smad2引起的促纖維化機(jī)制與TGF-β1/Smad3關(guān)系密切，抑制Smad2，細(xì)胞內(nèi)Smad3磷酸化、核轉(zhuǎn)運(yùn)、啟動因子以及同Smad3關(guān)系密切的膠原啟動因子Ⅰ型膠原蛋白A2基因活性均有所增強(qiáng)，這表明Smad2和Smad3在腎纖維化中扮演著不同的角色［11］。

Smad7是抑制型Smad蛋白，能夠競爭性地與TβR-Ⅰ結(jié)合，反饋性抑制Smad3的磷酸化，對其活性進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)［13］。敲除Smad7基因的STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎小球基質(zhì)Ⅰ型和Ⅳ型膠原水平顯著增加［14］。腎超表達(dá)的Smad7還可以抑制白細(xì)胞介素-1β和腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的NF-κB炎癥反應(yīng)，抑制腎纖維化和炎癥激活的NF-κB炎癥通路，保護(hù)腎臟，這可能與Smad7能誘導(dǎo)產(chǎn)生NF-κB抑制劑-α有關(guān)［15］。

3　糖尿病腎病時激活TGF-β11/Smad對ECM的積聚和EMT的調(diào)控

3.1激活TGF-β11/Smad促進(jìn)ECM積聚

激活的TGF-β1/Smad信號通路可以增加ECM中各種成分的表達(dá)，早期DN腎小球ECM的增加主要與纖維黏連蛋白的大量沉積有關(guān)，而腎小管ECM累積主要與Ⅳ型膠原的大量沉積有關(guān)。大部分的膠原蛋白基因和組織抑制劑MMP-1的表達(dá)都依賴Smad3［16］。TGF-β1能促進(jìn)ECM產(chǎn)生細(xì)胞表達(dá)α-SMA，使其活化并發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)變?yōu)榧±w維母細(xì)胞，后者能合成和分泌大量膠原等ECM成分［5］。這可能是由于α-SMA基因的啟動子中含有2個Smad3反應(yīng)區(qū)，Smad3促進(jìn)表達(dá)細(xì)胞骨架蛋白α-SMA。目前已把α-SMA作為檢測肌成纖維細(xì)胞的主要標(biāo)志性蛋白，α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞有比正常成纖維細(xì)胞更強(qiáng)的分泌ECM的功能［5］。與Smad3作用相反，敲除Smad7基因，則促進(jìn)ECM成分的分泌［13］。

3.2激活TGF-β11/Smad促進(jìn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

EMT亦是DN的病理特征之一。實(shí)驗(yàn)證明，腎小管上皮細(xì)胞以及腎小球足細(xì)胞都有可能發(fā)生這種轉(zhuǎn)化。若發(fā)生在足細(xì)胞上，會導(dǎo)致足細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)的損傷和斷裂，因此喪失濾過屏障的功能，導(dǎo)致大量蛋白尿的發(fā)生［17］。大部分EMT相關(guān)基因均受TGF-β1/Smad信號通路調(diào)控，TGF-β1的下游因子CTGF在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中起到重要作用［18］。外源性給予能抑制Smad3的Smad3磷酸化連接酶，顯著降低HK-2細(xì)胞鈣黏蛋白的表達(dá)［19］。敲除Smad3基因可抑制單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型中腎的EMT進(jìn)程和ECM的聚積，提示Smad3基因敲除對腎纖維化起保護(hù)作用，而Smad7可有效抑制腎小管發(fā)生EMT進(jìn)而減輕腎纖維化［13］。

4　基于TGF-β11/Smad的糖尿病腎病相關(guān)藥物

已上市的對DN有一定療效的藥物中，有許多是通過抑制TGF-β1水平來實(shí)現(xiàn)的。

4.1TGF-β11抑制劑

4.1.1人工合成的TGF-β11抑制劑

TGF-β1特異性抑制劑主要有以下2種，第1種是重組人緣化單克隆抗體CAT-192，為英國劍橋抗體技術(shù)公司開發(fā)。其高度的特異性和親和力可以與TGF-β1形成抗原抗體復(fù)合物，阻止其信號傳遞。目前已作為治療硬皮病藥物進(jìn)入臨床Ⅱ期［20］。第2種是小分子抑制劑：①TβR-Ⅰ抑制劑，如SB431542，LY2157299和SB525334?？商禺愋缘匾种芓βR-Ⅰ，阻礙TGF-β1信號的傳遞。體外研究表明，此類抑制劑能有效地抑制TGF-β1誘導(dǎo)的組織細(xì)胞纖維化［21］。② TβR-Ⅰ和TβR-Ⅱ雙重抑制劑LY2109761，可顯著抑制人成纖維細(xì)胞Smad1及Smad2的磷酰化，降低下游信號因子骨形成蛋白的表達(dá)，具有明顯的抗纖維化作用［22］。③TGF-β1Ⅰ型受體間變性淋巴瘤激酶4（ALK4）和ALK5的抑制劑SB505124，無論在體內(nèi)還是體外均能有效地抑制TGF-β1的表達(dá)，并下調(diào)CTGF和α-SMA的水平，抑制成纖維細(xì)胞增長［23］。④骨形態(tài)蛋白型受體ALK2和ALK3抑制劑LDN193189，在體外能通過TGF-β1/Smads信號通路抑制成肌細(xì)胞分化［24］。

4.1.2天然TGF-β11抑制劑

人體內(nèi)的蛋白聚糖和肝細(xì)胞生長因子（hepato?cyte growth factor，HGF）具有天然的TGF-β1抑制劑作用。蛋白聚糖通過激活法尼酯X受體，上調(diào)蛋白聚糖的表達(dá)，可以顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)α-SMA和黏附蛋白E的表達(dá)，有效地抑制腎小管EMT［25］。HGF能有效抑制HK-2細(xì)胞TGF-β1的釋放，減緩細(xì)胞的凋亡［26］。HGF能明顯降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠TGF-β1mRNA及CTGF mRNA的表達(dá)，抑制早期DN進(jìn)一步發(fā)展，減輕蛋白尿，使腎小球系膜明顯變薄和系膜基質(zhì)降解［27］。

4.2基于TGF-β11防治糖尿病腎病的化學(xué)藥物

4.2.1血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑抑制腎局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)減少血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生，進(jìn)而保護(hù)腎，減少尿蛋白的排泄。苯那普利可以降低STZ誘導(dǎo)DN大鼠腎組織中的TGF-β1、整合素連接激酶和α-SMA的基因表達(dá)［28］。早期2型DN患者口服苯那普利片，能有效降低DN患者血清TGF-β1、內(nèi)皮素-1、血管內(nèi)皮生長因子以及尿白蛋白排泄率水平。

4.2.2血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑

氯沙坦鉀對STZ誘導(dǎo)的大鼠DN具有保護(hù)作用，能有效降低胰島素抵抗和尿蛋白水平，并降低TGF-β1的水平，減輕細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。其機(jī)制可能是通過減少腎組織單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)，阻止巨噬細(xì)胞浸潤，下調(diào)TGF-β1表達(dá)［29］。

4.2.3阿托伐他汀

阿托伐他汀可減少DN患者蛋白尿，延緩腎功能的惡化，臨床上常用于治療糖尿病并發(fā)癥。阿托伐他汀能改善STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的血糖和血脂水平，提高抗氧化能力，減緩腎損傷，可能與其顯著降低TGF-β1水平、增強(qiáng)腎組織中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性有關(guān)［30］。阿托伐他汀也通過抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖及抑制血管緊張素Ⅱ的表達(dá)及分泌，降低基質(zhì)蛋白的生成與沉積，保護(hù)腎功能。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可明顯降低高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平及mRNA轉(zhuǎn)錄水平［31］。

4.2.4吡非尼酮

吡非尼酮（pirfenidone）是一種新型抗纖維化藥物。吡非尼酮能下調(diào)db/db小鼠腎小球內(nèi)TGF-β1表達(dá)、阻止Smad3的磷酸化并減少系膜基質(zhì)基因表達(dá)和系膜基質(zhì)擴(kuò)張，其腎保護(hù)作用可能與阻止RNA的加工處理有關(guān)［32］。77例DN患者進(jìn)行隨機(jī)、雙盲實(shí)驗(yàn)，分別服用吡非尼酮和安慰劑治療1年。與安慰劑組比較，吡非尼酮組估算腎小球?yàn)V過率顯著增加［33］。氟非尼酮（吡非尼酮的改進(jìn)型）預(yù)處理HK-2中加入TGF-β15 μg·L-1，TGF-β1誘導(dǎo)的纖維連接蛋白、Smad2、Smad3和α-SMA蛋白的表達(dá)均顯著降低［34］。

4.3基于TGF-β11/Smad信號通路防治糖尿病腎病的植物藥

雷公藤多苷可以抑制TGF-β1/Smad信號通路的過度表達(dá)，降低ECM成分的生成，有效緩解腎纖維化［35］。臨床上，雷公藤多苷可顯著降低早中期DN患者24 h尿蛋白定量和血肌酐水平［36］。

在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中，冬蟲夏草制劑可以下調(diào)大鼠腎組織中TGF-β1，TβR-Ⅰ，Smad2/ Smad3，TβR-Ⅱ和FN mRNA的表達(dá)水平，降低血肌酐和尿蛋白，延緩DN的發(fā)展［37］。在高糖培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞中加入冬蟲夏草提取物，TGF-β1mRNA的表達(dá)水平下降。

高脂高糖聯(lián)合STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，小檗堿組大鼠空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇均明顯下降，高密度脂蛋白膽固醇升高，大鼠腎組織形態(tài)學(xué)明顯改善，腎TGF-β1和糖基化終末產(chǎn)物的表達(dá)降低［38］。體外培養(yǎng)DN大鼠腎小球系膜細(xì)胞，加入不同濃度小檗堿，細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，TGF-β1的分泌減少，系膜細(xì)胞的環(huán)腺苷酸水平顯著升高［39］。

5　展望

TGF-β1/Smad信號通路是一個高度分化、多功能性和高效性的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，TGF-β1是導(dǎo)致DN纖維化的關(guān)鍵因子，Smad蛋白是TGF-β1在胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)的信號分子，調(diào)控著細(xì)胞膜至核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smad分子的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)決定了該超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的多樣性。目前尚有許多問題需要進(jìn)一步研究，如特定條件下的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其在不同細(xì)胞中的特異性作用，纖維化形成過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的交互作用，整體阻斷TGF-β1對機(jī)體可能產(chǎn)生的不良影響等。

TGF-β1/Smad信號通路作為靶目標(biāo)為阻止和治療糖尿病并發(fā)癥提供了一個新的治療策略。Smad3和Smad7的失衡（Smad3超活化與Smad7活性降低）是DN腎纖維化的主要機(jī)制和重要特征，下調(diào)Smad3和（或）上調(diào)Smad7的蛋白表達(dá)，是一個治療DN的有效策略。此外，應(yīng)基于TGF-β1/ Smad信號通路上特異作用靶點(diǎn)，開展更廣泛的藥物篩選工作，如抑制TGF-β1的產(chǎn)生，抑制TGF-β1刺激的下游CTGF和α-SMA等，抑制Smad磷酸化，抑制Smad3表達(dá)，調(diào)節(jié)TβR的表達(dá)，上調(diào)Smad7蛋白的表達(dá)等。

此外，文獻(xiàn)建議將TGF-β1作為慢性腎功能損傷的診斷指標(biāo)，但至今尚未見對這一指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)地評價，尚無公認(rèn)的臨床正常值范圍和腎損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)該開展大樣本的臨床流行病學(xué)研究，探討TGF-β1作為慢性腎功能損傷診斷指標(biāo)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

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Effect of transforming growth factor beta 1/Sma-and Mad-related protein signal pathwayin diabetic nephropathy and related drugs：a review

JIA Hui-yu1，LI Zhong-nan2，CHEN Guang-liang1
（1.Clinical College of Integrative Medicine，Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China；2.The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，China）

Transforming growth factor-β1（TGF-β1）has become an important biological marker and therapeutic target of clinical progression of chronic kidney diseases.Sma-and Mad-related protein （Smad）is a downstream signal transduction protein of the TGF-β family.TGF-β1activates Smad2 and Smad3 before increasing the transcription of connective tissue growth factors in the nucleus.Smad3 promotes mesangial cell proliferation，extracellular matrix accumulation，epithelial-mesenchymal transition，leading to renal fibrosis.However，Smad2 and Smad7 play a negative regulatory role by inhibiting renal fibrosis.TGF-β1specific inhibitor（SB431542，etc.）has antifibrosis effect，most of which is in the preclinical stage.The drugs on the market that are effective for DN，such as benzodiazepines，atorvastatin，losartan，and pirfenidone，can inhibit the expression of TGF-β1，while tripterygium wilfordii，cordyceps sinensis，and berberine can delay the process of diabetic nephropathy by reducing TGF-β1levels.

diabetic nephropathy；transforming growth factor-β1；signaling pathway；drugs

The project supported by National Basic Research Project of TCM（JDZX2012004）

CHEN Guang-liang，E-mail：chguangl@163.com

R963

A

1000-3002-（2016）03-0266-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.013

2015-03-09接受日期：2015-07-07）

（本文編輯：賀云霞）

國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項項目（JDZX2012004）

賈會玉，女，碩士研究生，主要從事藥物防治代謝性疾病的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究；陳光亮，男，博士，教授，主要從事藥物防治代謝性疾病的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。

陳光亮，E-mail:chguangl@163.com