陳 寧，王 平，冼靜雯，謝天柱，秦美容，李俊鵬，魯 藝，王曉煒，石海寧，龍紹蓉

(1.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，深圳 518057;2.哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院麻省總醫(yī)院，波士頓 02114; 3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000)

“3R”

皮膚致敏試驗(yàn)替代方法的研究進(jìn)展

陳 寧1，王 平1，冼靜雯1，謝天柱1，秦美容1，李俊鵬1，魯 藝1，王曉煒1，石海寧2，龍紹蓉3

(1.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，深圳 518057;2.哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院麻省總醫(yī)院，波士頓 02114; 3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450000)

皮膚致敏(過敏性接觸性皮炎)是皮膚接觸某些小分子化合物而引起的遲發(fā)性超敏反應(yīng)。經(jīng)典的檢測(cè)化學(xué)物接觸致敏性的方法是通過動(dòng)物試驗(yàn)來檢測(cè)，鑒于歐盟于2013年頒布全面禁止化妝品動(dòng)物試驗(yàn)的規(guī)定，替代試驗(yàn)將來是化學(xué)品/化妝品致敏研究的主要趨勢(shì)，本文綜合近年的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，對(duì)現(xiàn)行的通過OECD認(rèn)證的和正在開展研究的皮膚致敏替代試驗(yàn)，如LLNA、DPRA、KeratinoSensTM、h-CLAT試驗(yàn)等進(jìn)行綜合論述和評(píng)估，為未來體外替代試驗(yàn)?zāi)軌蚩陀^、公正的對(duì)致敏結(jié)果評(píng)估提供參考。

皮膚致敏;過敏性接觸性皮炎;體外替代

皮膚致敏(skin sensitization)(過敏性接觸性皮炎allergic contact dermatitis，ACD)是皮膚對(duì)外源物質(zhì)產(chǎn)生的免疫原性皮膚反應(yīng)，對(duì)于人類這種反應(yīng)以瘙癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特征。動(dòng)物反應(yīng)可能為皮膚紅斑和水腫［1］。經(jīng)典的檢測(cè)化學(xué)物接觸致敏性的方法是豚鼠最大值試驗(yàn)(guinea pig maximization test，GPMT)及局部封閉涂皮試驗(yàn)(Buehler test，BT)［2］，但這些試驗(yàn)需要大量的動(dòng)物。目前國(guó)際上對(duì)動(dòng)物福利的呼聲越來越高，歐盟現(xiàn)行化妝品法規(guī)1223/2009/EC于2009年頒布，2013年7月全面生效，取代 1976年頒布的 76/768/EC指令，成為歐洲化妝品行業(yè)的統(tǒng)一法規(guī)，新法規(guī)繼續(xù)保留了禁止動(dòng)物試驗(yàn)的規(guī)定［3］，加強(qiáng)替代方法的研發(fā)投入與支持，鼓勵(lì)替代方法的運(yùn)用，將成為未來藥品化妝品安全性評(píng)價(jià)的主要趨勢(shì)。

1 皮膚致敏體內(nèi)替代試驗(yàn)

1.1 小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn) (local lymph node assay，LLNA)

LLNA是用小鼠代替豚鼠對(duì)化學(xué)物致敏性進(jìn)行檢測(cè)，它是最早通過認(rèn)證的皮膚致敏替代方法，2002年世 界 經(jīng) 合 組 織 (Organization forEconomic Cooperation and Development，OECD)將其作為化學(xué)物致敏性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，即 OECD TG-429［4］。相比傳統(tǒng)的豚鼠法LLNA優(yōu)勢(shì)更加明顯，在于它周期短，減少了動(dòng)物的使用量，優(yōu)化了受試物給藥方法，減少了動(dòng)物的痛苦，只需要建立誘導(dǎo)階段，靈敏度高，能辨別低分子量的致敏化學(xué)物［5］。

由于LLNA不能很好地區(qū)分致敏物和刺激物，在某些皮膚致敏物質(zhì)試驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)假陰性或者假陽性結(jié)果，如氯化鎳、硫酸鎳、十二烷基硫酸鈉等，且需使用放射性核素，易造成環(huán)境污染［6］。國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者對(duì)試驗(yàn)方法改進(jìn)，如增加刺激性指標(biāo)如耳緣厚度和耳重的檢測(cè)［7］;分析免疫表型 B220+［8］，CD69+［9］等;將淋巴結(jié)增殖情況(稱重和計(jì)數(shù))納入致敏性指標(biāo)［10］。2010年，OECD又增加了兩種新的方法，即 LLNA:DA方法(TG442A)［11］和 LLNA: Brdu-ELISA方法(TG442B)［12］。這兩種方法彌補(bǔ)了TG429方法放射性物質(zhì)的污染的缺陷，但仍有一定制約性，如LLNA:DA的試驗(yàn)結(jié)果受檢測(cè)時(shí)間影響較大，OECD標(biāo)準(zhǔn)要求:從取淋巴結(jié)到檢測(cè)過程須在20 min內(nèi)完成，且每只動(dòng)物的檢測(cè)時(shí)間要保持一致，從處死到 ATP檢測(cè)約在 30 min內(nèi)完成［11］。LLNA:BrdU-ELISA法難免存在由于皮膚刺激劑或者呼吸道致敏劑引發(fā)的假陽性對(duì)檢測(cè)的干擾［12］。

2.2 正在研究和驗(yàn)證的LLNA改良法

近幾年，研究者們繼續(xù)對(duì)LLNA改良法進(jìn)行不斷改進(jìn)和探索［13-16］，Ulker［13］對(duì)LLNA:Brdu方法進(jìn)行改良，增加淋巴結(jié)細(xì)胞的Th1型和Th2型細(xì)胞因子的指標(biāo)測(cè)定，對(duì)三種不同的致敏物質(zhì)，結(jié)果表明改良LLNA:Brdu和放射性LLNA方法的致敏檢測(cè)結(jié)果一致性良好。陽曉燕［14］用 LLNA:DA改良法對(duì)4種化妝品原料和6種化妝品產(chǎn)品進(jìn)行致敏檢測(cè)，增選耳厚差、耳重為刺激指標(biāo)，淋巴結(jié)重量、淋巴細(xì)胞數(shù)和 ATP發(fā)光值為致敏指標(biāo)，將刺激指標(biāo)和致敏指標(biāo)結(jié)合對(duì)化妝品刺激性和致敏性做出綜合評(píng)價(jià)。

Yamashita等［15］用一種包含激發(fā)階段的改良法—LLNA:DAE法區(qū)分LLNA:DA檢測(cè)中出現(xiàn)的邊界陽性化合物，并進(jìn)行交叉致敏測(cè)試。該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右耳背部進(jìn)行4次化學(xué)物質(zhì)接觸誘導(dǎo)，最后對(duì)左耳背部進(jìn)行激發(fā)反應(yīng)，通過測(cè)試發(fā)現(xiàn)包括邊界陽性的24種化學(xué)物質(zhì)中，23種化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果與 LLNA方法一致。Yamashita［16］等對(duì) LLNA: DAE法進(jìn)行進(jìn)一步探索試將其作為一種獨(dú)立的皮膚致敏檢測(cè)方法來評(píng)估不同之間的相對(duì)皮膚致敏效力，他對(duì)3種化學(xué)物(己基肉桂醛、異丁子香酚和2，4-二硝基氯苯)進(jìn)行初步劑量研究，發(fā)現(xiàn)32種化合物的左耳淋巴結(jié)激發(fā)反應(yīng)程度和致敏效力之間存在一定的定性關(guān)系。

目前，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)LLNA改良方法(flow cytometry-based LLNA，F(xiàn)C-LLNA)包括:(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖:流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)能通過測(cè)定淋巴結(jié)細(xì)胞中的 BrdU快速、靈敏地檢測(cè)細(xì)胞增殖［17］;(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞亞群及致敏相關(guān)標(biāo)志物:如CD40L，CD62L等［18］;(3)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行致敏相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè):IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNFα［19］。該方法在敏感度和準(zhǔn)確率方面展示出較好的前景，但仍未通過OECD的方法學(xué)認(rèn)證［20］。

2 皮膚致敏體外替代試驗(yàn)

2.1 直接肽反應(yīng)試驗(yàn) Direct Peptide Reactivity Assay(DPRA)

化學(xué)物穿透皮膚后，大多數(shù)化學(xué)物可與皮膚蛋白質(zhì)結(jié)合形成穩(wěn)定的免疫復(fù)合物啟動(dòng)免疫反應(yīng)。由于這些化學(xué)致敏原大多是親電性的，因此可以與氨基酸的親核中心共價(jià)結(jié)合。DPRA實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)是通過量化包含半胱氨酸和賴氨酸的合成肽模型的化學(xué)物質(zhì)的活性，來模擬親電子化學(xué)物質(zhì)和親核中心的共價(jià)結(jié)合過程。該試驗(yàn)研究肽反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，將受試物孵育24小時(shí)后，用高效液相HPLC測(cè)肽的殘留量來評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的致敏性，它能將化合物按照不同致敏程度進(jìn)行分類［21］。

該方法由 Gerberick和他的同事在 2004年開發(fā)［22］，2007年進(jìn)行改良［23］。為了拓寬該方法的使用范圍，2009年Gerberick又進(jìn)一步改良，在致敏物與半胱氨酸的酶促反應(yīng)中加入了辣根過氧化物酶—過氧化氫(HRP/P)，使該方法也能用于抗原前體物的檢測(cè)［24］。2013年，歐洲替代方法研究中心(European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal Testing(EURL-ECVAM)將其作為皮膚致敏替代試驗(yàn)的推薦方法［25］，2015年2月，OECD公布DPRA試驗(yàn)方案(TG442C)［21］。

2.2 樹突狀細(xì)胞檢測(cè)法

樹突狀細(xì)胞DC能將抗原遞呈給初級(jí)免疫T細(xì)胞，調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，皮膚朗格罕細(xì)胞(Langerhans cell，LC)是主要位于表皮的未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)。在抗原遞呈的過程中，iDC捕獲和處理抗原，刺激T淋巴細(xì)胞活化并引起多種生物學(xué)變化，通過檢測(cè)DC生物學(xué)指標(biāo)的變化，可評(píng)價(jià)化學(xué)物的致敏性。目前，檢測(cè)比較成熟的細(xì)胞因子是 IL-1β，TGF和 TNF-α，膜表面分子主要有CD86，CD54，和MHC II［26、27］。

LC樣樹突狀細(xì)胞模型來源主要是誘導(dǎo)培養(yǎng)CD34+造血干細(xì)胞和外周血獲得的樹突狀細(xì)胞，但此類細(xì)胞模型存在著不足:實(shí)驗(yàn)室之間、來源個(gè)體間差異性、、費(fèi)用昂貴等。為克服這些限制，目前一些來源廣泛，活力較強(qiáng)的各類單核細(xì)胞系(THP1、U937和 MUTZ-3等)成為目前研究的熱點(diǎn)內(nèi)容［29］。

2.3 人細(xì)胞系激活實(shí)驗(yàn) (human cell line activation test，h-CLAT)

由于人單核白血病細(xì)胞 THP-1(human monocytic leukaemia cell line)能表現(xiàn)出與樹突細(xì)胞類似的性質(zhì)，并在細(xì)胞因子的作用下分化為樹突樣細(xì)胞。當(dāng)與致敏物接觸時(shí)，THP-1細(xì)胞表面的CD86和 CD54表達(dá)增強(qiáng)，從而使其成為有效的評(píng)價(jià)皮膚致敏的體外研究方法［30］。h-CLAT試驗(yàn)采用THP-1進(jìn)行體外皮膚致敏研究，通過檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86和 CD54的變化來反映化學(xué)物的致敏性。THP-1細(xì)胞不需要細(xì)胞因子誘導(dǎo)，即可被致敏物激活，目前細(xì)胞已商品化，對(duì)常用致敏物檢測(cè)特異性高。h-CLAT法已經(jīng)初步獲得認(rèn)可，通過不同國(guó)家實(shí)驗(yàn)室間的合作研究驗(yàn)證，歐洲替代方法研究中心(EURL-ECVAM)已完成了對(duì)它的可行性驗(yàn)證［31］，2015年12月，OECD已經(jīng)公布了 h-CLAT的方法草案［32］。

Ashikaga等［33］通過檢測(cè)細(xì)胞 CD86和 CD54的表達(dá)水平對(duì)100種化學(xué)物致敏性的進(jìn)行判定，h-CLAT與 LLNA結(jié)果的一致性仍然高達(dá) 84%，h-CLAT不僅能分辨出極度致敏和強(qiáng)致敏，而且能分辨出中度致敏和弱致敏。Parise等［34］發(fā)現(xiàn)給藥暴露48 h后，可以用h-CLAT法通過分析THP-1的CD86的表達(dá)水平將23種致敏物質(zhì)的22種鑒定出來，結(jié)合CD86和IL-8的分析對(duì)致敏物做綜合判斷。

2.4 ARE-Nrf2熒光素酶檢測(cè)法(KeratinoSensTM)

Nrf2是攜帶有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，幾乎能在所有細(xì)胞中表達(dá)，它含6個(gè)功能區(qū)，分別被命名為Neh1～6。正常情況下，其在胞質(zhì)中通過 Neh2與阻遏蛋白Keap1蛋白結(jié)合而被降解。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)或體內(nèi)的氧化磷酸化作用可以促使Nrf2與Keap1解體，隨后 Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，在各個(gè)功能區(qū)的密切配合下與抗氧化/親電反應(yīng)元件(antioxidant/electrophile response element，ARE)結(jié)合，啟動(dòng) Nrf2-ARE信號(hào)通路并促使下游II相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá)［35］。

HaCaT(human keratinocytes)是人類永生化角質(zhì)細(xì)胞，包含有ARE元件的熒光素酶報(bào)告基因，Nrf2-ARE檢測(cè)就是利用HaCaT細(xì)胞檢測(cè)熒光素酶的活力水平來判斷細(xì)胞是否有致敏反應(yīng)。EURL ECVAM公布的數(shù)據(jù)顯示，該方法在不同實(shí)驗(yàn)室間的可重復(fù)率達(dá)到85%，準(zhǔn)確性和 LLNA相比達(dá)到77%，特異性達(dá)到76%，并于2014年2月推薦該方法的試驗(yàn)方案［36］，2015年2月OECD公布了該方法的指導(dǎo)原則(TG442D)［37］。

2.5 人工皮膚/重建表皮模型

現(xiàn)在主要有兩種類型的體外三維培養(yǎng)人皮膚模型:表皮類似物或皮膚類似物。

已經(jīng)商品化并被歐盟推薦使用的重組人皮膚模型有EpiskinTM、EpidermTM和SkinEthic RHE［38］等，張廣靜［39］等研究表明永生化細(xì)胞組織工程皮膚模型檢測(cè)的敏感性和特異性均高于原代培養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)建的皮膚模型。Ramadan等［40］2016年模擬皮膚內(nèi)環(huán)境，利用動(dòng)態(tài)灌流微培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建人永生化細(xì)胞HaCaT和人白血病單核淋巴細(xì)胞(U937)共培養(yǎng)的三維模型。曹玉萍［41］等將 THP-1細(xì)胞分別與 KC和色素性組織工程表皮共培養(yǎng)三維模型，通過檢測(cè)THP-1細(xì)胞表面的標(biāo)記物變化及培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的變化來判斷待檢物質(zhì)的致敏性。

2.6 結(jié)構(gòu)活性關(guān)系分析

化合物的生物學(xué)特性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，有許多理論電腦模型能利用與未知化學(xué)物結(jié)構(gòu)近似的已知化學(xué)物的現(xiàn)有理化資料預(yù)測(cè)該未知化學(xué)物的理化特性。如結(jié)構(gòu)活性關(guān)系分析(structural activity relationship，SAR)和定量結(jié)構(gòu)活 性 分 析 ( quantitative structural activity relationship，QSAR)。Gould［42］將LLNA實(shí)驗(yàn)中存在潛在致敏力的28種化合物(EC3＜1%)用計(jì)算機(jī)進(jìn)一步DEREK分析，從結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)方面，如分子量，LogP等參數(shù)，結(jié)合結(jié)構(gòu)性預(yù)警分析和理化分析對(duì)LLNA結(jié)果進(jìn)行綜合判斷，結(jié)構(gòu)性分析顯示其中13種化合物陰性，15種化合物陽性，所有化合物的分子量均小于550 Da，對(duì)其中21種化合物進(jìn)行 EC3值分析，8種是 EC3值的數(shù)量級(jí)是正確的，8種不正確，5種不能判定。通過結(jié)合計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)及理化分析能對(duì)LLNA結(jié)果做出更準(zhǔn)確的判斷。Urbisch［43］等用QSAR Toolbox方法和DPRA方法相比在致敏性判斷結(jié)果上有84%的一致性。其中非致敏物質(zhì)判斷一致性83% ～100%，致敏物質(zhì)判斷一致性55% ～61%。Dimitrov等［44］在 2015年建立一種對(duì)體內(nèi)、體外測(cè)試試驗(yàn)(DPRA vs.LLNA)結(jié)果轉(zhuǎn)換時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)整合和分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，這套方法的分級(jí)和篩選方式不僅能用于皮膚試驗(yàn)評(píng)估，還能用于化學(xué)物體內(nèi)外毒理和健康評(píng)價(jià)及QSAR模型的建立。

目前還沒有一種體外測(cè)試方法的結(jié)果能完全代替動(dòng)物試驗(yàn)單獨(dú)用于化學(xué)物皮膚致敏性評(píng)估，每一種體外方法只能反應(yīng)皮膚致敏不良反應(yīng)結(jié)局路徑(AOP)中的一部分關(guān)鍵信息，不能完整的反應(yīng)整個(gè)皮膚致敏機(jī)制過程。一種新的替代方法的建立首先必須具備能體現(xiàn)3R原則、科學(xué)、有效及可操作性等優(yōu)勢(shì)，經(jīng)歐盟驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室(EU-NETVAL)驗(yàn)證其數(shù)據(jù)可重復(fù)性，與體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)方法要有相關(guān)性和一致性，其結(jié)果能夠較好地預(yù)測(cè)受試物的毒理學(xué)及生物學(xué)效應(yīng)。然后國(guó)際和各國(guó)權(quán)威部門組織同行評(píng)議和方法學(xué)驗(yàn)證，如ECVAM、ICCVAM(NICEATM)等。再后，根據(jù)專家的評(píng)估意見提交相關(guān)管理部門，如歐盟委員會(huì)評(píng)估同意接受可成為歐盟方法納入法規(guī)管理的軌道。如要成為 OECD的標(biāo)準(zhǔn)，還需更廣泛機(jī)構(gòu)的驗(yàn)證和反復(fù)修改，還要聽取社會(huì)評(píng)論，才能發(fā)布為OECD的試驗(yàn)指南。［45，46］近年來，研究人員采用組合測(cè)試策略(ITS)將DPRA、h-CLAT、KeratinoSensTM結(jié)合LLNA和計(jì)算機(jī)模擬的數(shù)據(jù)組合分析、已涵蓋皮膚致敏的各階段的生化反應(yīng)數(shù)據(jù)，構(gòu)建皮膚致敏性評(píng)價(jià)的框架。Urbisch［47］等結(jié)合DPRA，KeratinoSensTM和h-CLAT三種檢測(cè)方式，將27種抗原前體物中的22種檢測(cè)出來，陽性致敏率達(dá)到81%。Strickland等結(jié)合了LLNA，DPRA，h-CLAT和ARE-Nrf2熒光素酶檢測(cè)法建立一種整體評(píng)估策略，利用計(jì)算機(jī)QSAR Toolbox分析影響皮膚滲透力的6種相關(guān)理化性質(zhì)參數(shù)，建立 54種不同的 QSAR Toolbox計(jì)算機(jī)模型。

經(jīng)過20多年的不斷研究和探索，致敏免疫反應(yīng)分子研究的逐漸清晰，為體外構(gòu)建可靠的化學(xué)物致敏性評(píng)價(jià)體系奠定了理論基礎(chǔ)，隨著歐盟相關(guān)法規(guī)禁止使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行化妝品安全性評(píng)價(jià)的推進(jìn)，致敏體外替代實(shí)驗(yàn)的研究進(jìn)程也在不斷加快，更多的經(jīng)過歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM)確認(rèn)的方法正在得到認(rèn)可，替代實(shí)驗(yàn)的研究具有廣闊的前景，我國(guó)在替代實(shí)驗(yàn)研究方面剛剛起步，應(yīng)加快替代實(shí)驗(yàn)在國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室的普及和開展，推動(dòng)替代實(shí)驗(yàn)的不斷發(fā)展。

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Research progress of alternative in vitro methods to evaluate skin sensitization

CHEN Ning1，WANG Ping1，XIAN Jing-wen1，XIE Tian-zhu1，Qin Mei-rong1，LI Jun-peng1，LU Yi1，WANG Xiao-wei1，SHI Hai-ning2，LONG Shao-rong3
(1.Shenzhen Institute for Drug Control，Shenzhen，518057，China;2.Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School，Boston，02114，USA;School of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou，450000，China)

Skin sensitization(allergic contact dermatitis，ACD)，is a serious condition caused by small reactive molecules and is characterized by a delayed-type hypersensitivity.Animal tests were usually used in the evaluation of sensitizing potential of chemical substances in the past.However，there is an increasing interest from the public for reducing and ultimately replacing animal tests.The European Union(EU)has posed a ban on animal testing of cosmetic ingredients that includes skin sensitization since 2013.Therefore，alternative in vitro tests are the main tendency in chemical substances and cosmetic sensitizing potential research in the future.In this study，different kinds of in vitro test methods that were adopted by OECD or on research(LLNA，DPRA，KeratinoSensTM，h-CLAT)were reviewed through recent years literature，comprehensive introduction and evaluation were made to obtain reliable hazard and potency information on potential skin sensitizers.

Skin sensitization;Allergic contact dermatitis;Alternative in vitro testing;Cosmetics

R-33

A

1671-7856(2016)12-0085-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.017

2016-06-14

深圳市藥品檢驗(yàn)研究院重點(diǎn)學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目。

陳寧(1982-)，主管藥師，博士，研究方向:藥理毒理學(xué)，E-mail:cn82cn@163.com。

王平(1972-)，主任藥師，博士，研究方向:藥理毒理學(xué)，E-mail:wangping662@sina.com。