史子學(xué)，王秀杰

（1.上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，上海 嘉定 201800；2.北京科高大北農(nóng)飼料有限責(zé)任公司，北京 懷柔 101407）

檢測新技術(shù)

高通量測序技術(shù)應(yīng)用于豬病檢測的探討

史子學(xué)1，王秀杰2

（1.上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，上海 嘉定 201800；2.北京科高大北農(nóng)飼料有限責(zé)任公司，北京 懷柔 101407）

高通量測序技術(shù)以及全基因組深度測序技術(shù)的快速發(fā)展，加速了檢測技術(shù)的更新步伐。文章對高通量測序技術(shù)的發(fā)展及在微生物檢測領(lǐng)域應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對高通量測序技術(shù)檢測豬病的實(shí)踐應(yīng)用進(jìn)行了分析。

高通量測序技術(shù)；豬??；新發(fā)和突發(fā)傳染病

早期確診并快速清除感染豬是控制豬病的關(guān)鍵，豬病病原體潛伏在豬體內(nèi)未檢出的時間越長，導(dǎo)致傳染病擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)就越大。在早期，人們通過典型的臨床癥狀及病理變化即可進(jìn)行豬病診斷。然而，近30年來，非典型臨床病例和混合感染現(xiàn)象越來越多，給豬病診斷增加了難度，單純的依靠臨床癥狀、病理解剖或僅僅檢測個別豬病，已不能對大多數(shù)病例做出正確診斷。從養(yǎng)豬業(yè)的實(shí)際需求來說，一方面對于臨床的豬病要求盡量全面的檢測出病原種類；另一方面，新發(fā)與再現(xiàn)豬病、豬病混合感染的復(fù)雜趨勢，都對豬病檢測提出了更高的要求。

近年來出現(xiàn)的高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱為下一代測序技術(shù)，在病原體檢測及未知病原體發(fā)現(xiàn)方面具有重要意義。高通量測序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定；覆蓋面廣，能檢測樣品中全部遺傳信息；準(zhǔn)確性高，其準(zhǔn)確率可高達(dá)99.99%。這為豬病的檢測提供了一種重要的檢測技術(shù)。

1 高通量測序技術(shù)的發(fā)展

測序技術(shù)一直推動著病原學(xué)研究的發(fā)展，先進(jìn)的測序技術(shù)為病原檢測提供了強(qiáng)大的工具。從20世紀(jì)90年代開始，Sanger測序法被廣泛應(yīng)用在生物信息學(xué)研究當(dāng)中，并在人類基因組計(jì)劃（HGP）中發(fā)揮了巨大的作用。但由于Sanger測序法通量太低、速度較慢，運(yùn)用Sanger方法的病原體序列研究受到測序深度的限制，只能了解到病原群體中部分的個體，并且不能全面檢測到病原體基因組的數(shù)據(jù)。而且傳統(tǒng)的Sanger測序方法要先構(gòu)建一個 cDNA文庫，然后采用挑選克隆測序的方法，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)程序繁瑣，且時間和經(jīng)濟(jì)成本較高，所以傳統(tǒng)的測序法并沒有對病原檢測技術(shù)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

以高通量測序?yàn)樘攸c(diǎn)的新一代測序技術(shù)具有極高的測序通量、速度快、成本顯著降低和高度自動化的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于基因組測定、表達(dá)譜分析、病原微生物檢測等海量基因序列的相關(guān)研究中[1]。高通量測序與Sanger方法相比被稱為深度測序，包括第二代測序和第三代測序技術(shù)（基于納米孔的單分子測序方法），其中第二代測序技術(shù)包括基因芯片測序和高通量測序平臺?；蛐酒瑴y序是在芯片上并行地對可高達(dá)百萬的DNA 分子進(jìn)行測序，一次可以產(chǎn)生巨大數(shù)據(jù)量的測序結(jié)果，它顯示了測序技術(shù)劃時代的變革，成為新一代測序技術(shù)的重要成員?；蛐酒瑴y序方法雖然達(dá)到了快速和高通量的標(biāo)準(zhǔn)，但是需要預(yù)先知道待測基因的序列制作芯片，其測序靈活性很差，對于研究基因組數(shù)據(jù)庫不完備的物種受到限制。

2 主流的高通量測序技術(shù)

以454高通量測序?yàn)榇淼氖悄壳白罹邞?yīng)用前景的第二代測序技術(shù)，其克服了先前測序技術(shù)的不足，采用邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列，尤其適合沒有基因組參考序列的物種的基因組或轉(zhuǎn)錄組測序。454高通量測序則避免了Sanger測序中涉及的繁重的大量克隆實(shí)驗(yàn)，顯著減少了工作量和提高了工作效率。454高通量測序技術(shù)是現(xiàn)今應(yīng)用最廣泛的測序技術(shù)，公認(rèn)特點(diǎn)是成本低、通量高、速度快，可以快速產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)。以高通量測序檢測環(huán)境中微生物多樣性流程為例：環(huán)境樣品提取基因組DNA—16S rDNA高變區(qū)ITS PCR富集—構(gòu)建測序文庫—上機(jī)測序—得到高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)—生物信息學(xué)分析。目前各個公司研制出了不同的454高通量測序平臺，2005年，454公司推出基于焦磷酸測序技術(shù)的454測序儀為標(biāo)志，代表著新一代測序技術(shù)的推廣和應(yīng)用。2006年，美國Illumina公司進(jìn)軍新一代DNA測序市場，研發(fā)出了測序平臺—Solexa測序儀。2007年，美國ABI公司也推出了第二代測序平臺—SOLiD測序儀。454 FLX進(jìn)行測序的片段比較長，高質(zhì)量的讀長可達(dá)到400 bp左右，比較適合對未知基因進(jìn)行全序列的測定。Solexa測序價(jià)格低廉，性價(jià)比最高，同等條件下成本只有454測序的1/10。且具有全自動化的測序系統(tǒng)，可以讀取的片段數(shù)目較多，非常適合大量小片度的測序。SOLiD測序?qū)τ诿總€堿基讀取兩次，準(zhǔn)確度高，原始堿基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%，15X覆蓋率時接近100%。

3 高通量測序在病原體檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

雖然各種454高通量測序平臺沒有達(dá)到測序方面的完美，但這幾種平臺均適合用于臨床對病原進(jìn)行快速、精確地檢測，并且此技術(shù)在發(fā)現(xiàn)未知病原體研究上已顯示了技術(shù)先進(jìn)性[2]。高通量測序在醫(yī)學(xué)、環(huán)境、食品領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛[3]。例如，早產(chǎn)兒通常面對較大的健康問題，有時甚至受到致死性感染，這可能是由于腸道微生物引起的。研究人員利用羅氏454 GS FLX Titanium測序系統(tǒng)對于11例極低出生體重嬰兒的腸道樣本進(jìn)行測序，不僅獲得了細(xì)菌的信息，還有真核真菌和蛔蟲的片段。根據(jù)檢測結(jié)果，可以針對性地對這些嬰兒使用抗菌素和針對白色念珠菌感染的制霉菌素抗真菌藥物等積極治療手段。此外，最近，挪威和英國的417家養(yǎng)殖場發(fā)現(xiàn)一種破壞心臟和肌肉組織，致死率高達(dá)20%的心臟和骨骼肌炎癥（HSMI）。雖然研究表明這是一種傳染病，但研究人員未能鑒定出病原體。美國哥倫比亞大學(xué)及挪威國家醫(yī)學(xué)研究所等機(jī)構(gòu)的研究人員組成了一個專門的研究小組，利用羅氏454測序系統(tǒng)的高通量測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)該疾病是一種與呼腸孤病毒相關(guān)的未知病毒感染引起的。借助高通量測序和生物信息學(xué)方面的經(jīng)驗(yàn)，在幾周內(nèi)獲得了這種未知病毒的全基因組序列。高通量測序技術(shù)可以檢測土壤中細(xì)菌、真菌、原生動物、病毒及類病毒等微生物的多樣性。Sogin等檢測深海和未探索的稀有生物圈微生物多樣性，454測序結(jié)果顯示，大西洋海底和熱泉中的微生物比先前報(bào)道的數(shù)據(jù)高1～2個數(shù)量級，并且微生物類群更豐富。Li等采用454測序技術(shù)研究國內(nèi)釀酒發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌的多樣性，檢測到的細(xì)菌分屬于15個科，真菌分屬于6個科，60%的真菌ITS1序列屬于酵母科。國內(nèi)外研究表明，高通量測序平臺應(yīng)用于病原微生物及未知病原體檢測具有巨大潛力。

4 高通量測序技術(shù)在生豬等養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用

Eilliott等通過常規(guī)方法研究豬舍空氣中微生物，鑒定到存在大腸桿菌、葡萄球菌、彎曲桿菌、革蘭氏陰性菌、變形菌、放線菌等。李紅梅等[4]使用高通量測序技術(shù)檢測規(guī)模化豬場空氣中微生物及其污染傳播規(guī)律，發(fā)現(xiàn)豬舍空氣微生物種類多樣性，包括有16種門、115種科、217種屬，在鑒定的10種優(yōu)勢菌群中，6種為病原微生物，表明高通量測序技術(shù)在豬病檢測中具有非常大的應(yīng)用價(jià)值。王楷宬等[5]應(yīng)用高通量測序檢測禽類臨床樣品中未知病原，高效率地發(fā)現(xiàn)2種新病毒，并得到該病毒的部分基因組，為后續(xù)制定防控策略提供了可靠數(shù)據(jù)。

5 高通量測序技術(shù)檢測豬病的應(yīng)用前景

當(dāng)前我國豬病流行的新形勢及新發(fā)、突發(fā)豬病的潛在威脅，為高通量測序技術(shù)應(yīng)用于豬病檢測提供了現(xiàn)實(shí)需求。相比前幾年，高通量測序技術(shù)的經(jīng)濟(jì)成本已經(jīng)大大降低，對于全面掌握一個豬場或地區(qū)豬病的流行背景確實(shí)為一種可靠工具，例如，可以對某一地區(qū)或豬場病死豬無害化處理冷庫中樣品，定期用高通量測序技術(shù)檢測，得到的數(shù)據(jù)可為當(dāng)?shù)刂贫ㄒ卟》揽夭呗蕴峁﹨⒖迹部勺鳛榛A(chǔ)數(shù)據(jù)上報(bào)國家動物疫情測報(bào)站。高通量測序技術(shù)在應(yīng)用中也要注意臨床樣品選擇問題，不同的豬傳染病的病原體在組織中載量有差別，豬藍(lán)耳病病毒在血液中載量高、豬流感優(yōu)先檢測呼吸道、肛拭子等樣品，檢測豬瘟則推薦采集扁桃體、腎臟和淋巴結(jié)等。如何選擇臨床樣品，有效檢測各種豬病需要在臨床應(yīng)用中進(jìn)一步探討。

6 結(jié)語

高通量測序技術(shù)在豬病檢測領(lǐng)域的應(yīng)用，將極大地提高我們對臨床樣品中豬病混合感染及未知病原的全面認(rèn)識，對豬病檢測、診斷水平帶來跨越式的提升。2016年國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目已發(fā)布，2項(xiàng)豬重要疫病的診斷與檢測新技術(shù)研究獲得立項(xiàng)，相信將對豬病檢測診斷技術(shù)帶來進(jìn)一步的創(chuàng)新性發(fā)展。

[1] QUAIL M A, KOZAREWA I, SMITH F,et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system[J].Nat Meth,2008, 5(12):1005-1010.

[2] 李建彬, 莊璐, 安小平,等. 利用高通量測序快速檢測疑似感染患者體內(nèi)未知病原體[J]. 生物信息學(xué), 2011, 9(4):303-306, 313.

[3] 秦楠, 栗東芳, 楊瑞馥. 高通量測序技術(shù)及其在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2011, 51(4): 445-457.

[4] 李紅梅, 白林, 姜冬梅,等. 基于16 S rDNA高通量測序方法檢測豬舍空氣微生物多樣性[J]. 畜牧生物技術(shù), 2015, 51(3):81-84.

[5] 王楷宬, 陳貴錢, 蔣文明,等. 新一代高通量測序在禽病毒檢測中的應(yīng)用[C]. 中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家禽學(xué)分會第9次代表會議暨第16次全國家禽學(xué)術(shù)討論會論文集, 2013.

2016-06-30）

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助（31302132）

史子學(xué)（1978-），男，博士，研究方向：重大動物疫病防控。