劉澤眾,李揚帆,常惠蕓

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化學發(fā)光技術(shù)在人獸共患病診斷中的應(yīng)用

劉澤眾,李揚帆,?；菔|

中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室 國家口蹄疫參考實驗室，蘭州730046，Email:907222118@qq.com

摘要:化學發(fā)光技術(shù)是一種極其敏感的新型檢測技術(shù)。本文闡述了化學發(fā)光技術(shù)的原理與類型,介紹了可應(yīng)用于化學發(fā)光檢測技術(shù)中的納米、磁珠、生物傳感器等相關(guān)新型技術(shù)，同時對當前該技術(shù)在人獸共患病、動物疫病診斷中的最新應(yīng)用做了報道，最后提出了未來幾年化學發(fā)光檢測技術(shù)的發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：化學發(fā)光;動物疫病;人獸共患病;檢測

由于各種疫病診斷的需要，在近50年內(nèi)，各種診斷技術(shù)迅速發(fā)展?？焖?、準確、高效的診斷技術(shù)對于社會、經(jīng)濟、人類生活的發(fā)展十分重要。Yallow等[1]于1961年發(fā)明了放射性免疫(Radioimmunoassay,RIA)診斷的方法，該方法開創(chuàng)了檢測微量物質(zhì)的先河。但放射性免疫會產(chǎn)生放射性污染,因此在放射性免疫的基礎(chǔ)上逐漸建立了化學發(fā)光(Chemiluminescence, CL)檢測技術(shù)?；瘜W發(fā)光具有高的敏感性和信噪比、低的背景熒光信號、寬的線性范圍，能夠通過發(fā)光檢測儀器定量分析被檢樣品等諸多優(yōu)點而在生命科學的各領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[2]。近幾年來，納米、磁珠、試紙條層析、生物傳感器、流動注射系統(tǒng)、毛細管電泳、以及高效液相色譜等技術(shù)不斷發(fā)展，極大推動了化學發(fā)光技術(shù)的更新?lián)Q代。在當前的各種化學發(fā)光檢測研究中，如何進一步縮短檢測時間、減少檢測費用、增加檢測敏感性與特異性、實現(xiàn)多組分同時檢測和現(xiàn)場檢測成為了研究的熱點[3]。

1化學發(fā)光的原理

化學發(fā)光劑分子在化學反應(yīng)過程中因受到某些催化劑或氧化劑的作用獲得能量,而從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，但處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，當該分子重新躍遷回到基態(tài)時,伴隨著以光子的形式釋放出能量,從而產(chǎn)生了化學發(fā)光[4]。因此化學發(fā)光不需要任何激發(fā)光源，消除了激發(fā)光源的散射，降低了背景熒光信號，可以在很寬的線性范圍內(nèi)檢測極低濃度的分析物[5]。將化學發(fā)光應(yīng)用于免疫反應(yīng)和核酸雜交分析可極大提高檢測的靈敏性。

2發(fā)光劑的種類

2.1魯米諾(luminuo)及其衍生物魯米諾是最早使用的發(fā)光劑，起初被用來直接標記生物大分子，然后通過與過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生化學發(fā)光，從而起到輔助檢測的作用。但該化學反應(yīng)緩慢，發(fā)光強度較弱，時間較短，常常需要在催化劑和發(fā)光增強劑的作用下進行，因此當時沒有廣泛應(yīng)用。后來由于辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)可以催化魯米諾發(fā)光，因此人們用辣根過氧化酶標記生物大分子，待反應(yīng)結(jié)束后，除去未結(jié)合的辣根過氧化酶，再加入足量的底物魯米諾產(chǎn)生化學發(fā)光。該方法提高了發(fā)光強度，延長了發(fā)光時間，是目前使用最為廣泛的化學發(fā)光系統(tǒng)。

2.21,2-二氧環(huán)乙烷衍生物(AMPPD)AMPPD是堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的底物。同樣將堿性磷酸酶標記生物大分子，待反應(yīng)結(jié)束后加入足量的AMPPD引發(fā)化學發(fā)光。由于ALP-AMPPD無論在液相與固相檢測中都具有很高的靈敏度，而成為目前最重要的發(fā)光體系之一。

2.3吖啶酯吖啶酯(acridinium ester,AE)是一種重要的化學發(fā)光試劑，在臨床免疫檢測、核酸分析、環(huán)境樣品檢測中已經(jīng)應(yīng)用了40多年[6]。同其它發(fā)光劑不同，吖啶酯可以直接標記生物大分子，在堿性溶液如過氧化氫的作用下就可發(fā)光，且具有發(fā)光強度高、發(fā)光時間長的優(yōu)勢。

2.4三聯(lián)吡啶釕三聯(lián)吡啶釕(Ru(bipy)3+)是電化學發(fā)光(Electrochemiluminescence,ECL)的標記物。Hercules等[7]于1964年首次報道了電化學發(fā)光技術(shù)，其基本原理是應(yīng)用三聯(lián)吡啶釕在陽極表面與電子供體三丙胺(TPA)進行電子轉(zhuǎn)移，最后引發(fā)持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)光。近些年來，電化學發(fā)光常與其他檢測技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，如高效液相色譜、流動注射系統(tǒng)、免疫傳感器等。其中電化學發(fā)光與免疫傳感器聯(lián)合應(yīng)用最為廣泛，該應(yīng)用結(jié)合了電化學發(fā)光的高敏感性和免疫反應(yīng)的高特異性，可以通過簡單的儀器量化信號，極大地方便了生物檢測[8]。

3化學發(fā)光最新相關(guān)技術(shù)

3.1納米技術(shù)隨著納米生物學的發(fā)展，納米技術(shù)在生物醫(yī)學中的應(yīng)用越來越受到科研工作者的青睞[9]。近些年來，基于納米的化學發(fā)光檢測技術(shù)不斷發(fā)展。納米技術(shù)在化學發(fā)光技術(shù)中的應(yīng)用克服了放射性免疫安全性差(RIA)、熒光免疫靈敏度低(fluorescence immunoassay,IFA)、酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunoassay,ELIA)穩(wěn)定性差的問題[10]。其中磁性納米顆粒、金屬納米顆粒、氧化石墨烯等新型納米材料在化學發(fā)光中的應(yīng)用顯現(xiàn)出了很好的效果。

磁性納米顆粒具有良好的生物相容性與吸附性能，且能夠在外加電場的作用下迅速從反應(yīng)混合物中分離出來，因而受到廣泛的關(guān)注。目前磁性納米顆粒已經(jīng)廣泛應(yīng)用在核酸和蛋白純化[11]、免疫反應(yīng)[12]、磁共振成像[13]、藥物傳遞[14]等生物學的各領(lǐng)域。

金納米具有許多獨特的性質(zhì)，1)比表面積大：可作為載體承載大量的生物分子或化學發(fā)光劑；2)功能多樣化：不同大小、形狀的金納米具有不同的性質(zhì)；3)表面易于修飾：可通過共價結(jié)合或靜電作用與生物大分子結(jié)合；4)催化作用：可直接催化魯米諾-硝酸銀，魯米諾-過氧化氫系統(tǒng)的化學發(fā)光；5)光學作用：表面等離子體共振現(xiàn)象[15-16]?；诮鸺{米的化學發(fā)光有兩種途徑，一種為金納米作為載體承載例如魯米諾、抗體、生物素等大分子來放大化學發(fā)光信號，另外一種為金納米作為催化劑直接放大化學發(fā)光信號[17]。目前金納米已經(jīng)廣泛用于檢測蛋白質(zhì)[18]與DNA[19]等。

氧化石墨烯是一種新型的納米材料,它不僅具有納米材料的諸多優(yōu)點，還可以猝滅吖啶酯-過氧化氫系統(tǒng)產(chǎn)生的化學發(fā)光，因此應(yīng)用該特點可以發(fā)展均相化學發(fā)光檢測方法。

3.2免疫傳感器技術(shù)免疫傳感器在獸醫(yī)和臨床診斷中是一個非常有用的工具。免疫傳感器包括兩部分,一部分為生物受體即抗原或抗體,用來捕獲分析物；另一部分為換能器,用來把識別到的分析物轉(zhuǎn)換成可定量的信號。將免疫傳感器與化學發(fā)光結(jié)合可實現(xiàn)檢測的自動化。然而，在設(shè)計免疫傳感器的過程中，如何把抗原或抗體固定到換能器上是非常重要的，好的固定方法可以增加檢測的敏感性[20]。

3.3流動注射和毛細管技術(shù)免疫反應(yīng)需要很多培育與洗滌步驟。相對于靜態(tài)的免疫反應(yīng)，流動注射免疫反應(yīng)實現(xiàn)了自動化，減少了手動操作的環(huán)節(jié)，大大縮短了檢測時間[21]，將其與化學發(fā)光技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可實現(xiàn)對臨床樣品的自動化、高通量檢測。而毛細管技術(shù)與化學發(fā)光聯(lián)合應(yīng)用也具有多種優(yōu)點，最主要的是該方法操作簡單，通過便攜的生物傳感器可實現(xiàn)現(xiàn)場檢測的目的。

3.4試紙條與微流控技術(shù)傳統(tǒng)的流動注射技術(shù)雖然具有諸多優(yōu)點，但會造成大量貴重試劑的浪費，不僅使檢測成本增加，同時也可能造成環(huán)境的污染，而微流控技術(shù)可以很好的克服這個缺點[5]。微流控技術(shù)是在直徑為微米單位的管子中進行樣品的準備、混合、反應(yīng)、分離、分析、定量[22]。Martinez等[23]于2007年第一次研制出了基于試紙的微流控分析儀器。由于該方法充分利用了微流控的高效性與試紙條的簡便性，使之成為目前最廉價的檢測方法之一。該方法具有多種優(yōu)點：1)所需樣品少，可準確分析復雜樣品。2)可高通量快速檢測。3)通過微流控技術(shù)，傳感器可以與試紙結(jié)合，使定量分析被檢樣品成為可能。4)適合現(xiàn)場檢測。

4相關(guān)人獸共患病化學發(fā)光檢測方法

化學發(fā)光檢測技術(shù)在人獸共患病的診斷中已經(jīng)廣泛應(yīng)用。人獸共患病病原如禽流感(avian influenza)H1N1病毒、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)、布魯氏菌(Brucella)、結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、耶爾森氏菌(Yersinia)等的化學發(fā)光檢測方法近幾年都有報道。

4.1禽流感H1N1病毒化學發(fā)光檢測方法Li等[24]結(jié)合了磁性納米顆粒技術(shù)、生物素-親和素系統(tǒng)、HRP催化魯米諾的化學發(fā)光、雜交反應(yīng)、PCR等方法建立了檢測禽流感H1N1病毒DNA的方法。該方法是將磁珠羧基化，與氨基化的探針連接，然后對禽流感H1N1病毒的DNA片段進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物與磁珠探針進行雜交，在外加電場的作用下，雜交物被快速分離出來，再加入生物素標記的報告DNA進行雜交反應(yīng)，最后加入標記有親和素的辣根過氧化物酶，通過親和素-生物素反應(yīng)使辣根過氧化酶連接到PCR擴增產(chǎn)物上，在底物魯米諾-雙氧水系統(tǒng)中產(chǎn)生化學發(fā)光反應(yīng)。該研究用對碘苯酚作為增強劑進一步延長發(fā)光時間，最后通過對各種反應(yīng)條件的探索優(yōu)化，對禽流感H1N1病毒DNA的檢測極限可以低至0.1 pmol/L。相比于之前的檢測方法，該方法的敏感性更高。

4.2乙肝表面抗原(HBsAg)化學發(fā)光檢測方法Shourian等[17]建立了檢測乙型肝炎表面抗原的化學發(fā)光檢測方法。該方法將生物素與魯米諾共價結(jié)合到金納米表面，并將鏈親合素與抗HBsAg抗體偶聯(lián)，待該抗體捕捉到HBsAg后，通過生物素-親和素反應(yīng)，使金納米-魯米諾共軛物結(jié)合在免疫復合物上。由于鏈親合素是一個四聚體蛋白，因此不止一個親和素可以與其結(jié)合，導致了大量的魯米諾結(jié)合在復合物上，從而極大地提高了檢測的靈敏性。該方法的檢測極限可低至0.36 pg/mL。Xiang等[25]建立了毛細管化學發(fā)光檢測乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的方法。該方法用便攜式的分析儀可在25 min內(nèi)定量檢測出人血清中的HBsAg，其線性范圍為0.4～15.0 ng/mL,靈敏度為0.3 ng/mL, 特異性高達100%。相比于其他的微載體化學發(fā)光檢測法，該方法通過與毛細管技術(shù)結(jié)合，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測的目的。并且可進一步應(yīng)用到人獸共患病的診斷中去。

4.3 結(jié)核桿菌化學發(fā)光檢測方法He等[26]人建立了檢測結(jié)核桿菌DNA的化學發(fā)光檢測方法。由于在普通的檢測中，復雜的標記方法以及分離、洗滌步驟不僅耗時多，而且還顯著影響檢測的靈敏性。利用氧化石墨烯可以克服上述缺點，使得在檢測過程中不需要對DNA探針進行標記，也無需分離和洗滌步驟。其基本的檢測過程在均質(zhì)的液相中進行，在沒有目標DNA時，DNA探針和吖啶酯通過靜電作用被吸附在氧化石墨烯表面上，此時由于氧化石墨烯可以猝滅吖啶酯產(chǎn)生的化學發(fā)光，使得發(fā)光強度很弱。但當加入目標DNA后，DNA探針與目標DNA雜交形成雙鏈，使DNA探針構(gòu)象發(fā)生改變，繼而從氧化石墨烯表面釋放出來。此外，雙鏈DNA對吖啶酯具有強大的離子吸附能力，也能使吖啶酯從氧化石墨烯表面釋放出來，從而脫離了氧化石墨烯的猝滅作用，使化學發(fā)光強度顯著增強。利用這個方法檢測結(jié)核桿菌DNA，檢測極限可低至0.65 nmol/L，顯著低于之前報道的電化學發(fā)光檢測法。

4.4布魯氏菌化學發(fā)光檢測方法Liebes等[27]用光纖作為換能器設(shè)計出了檢測抗布魯氏菌抗體的化學發(fā)光免疫傳感器。該方法通過用各種硅烷、二苯甲酮衍生物作為硅烷偶聯(lián)劑，使布魯氏菌顆粒固定到光纖上。然后對應(yīng)用各種硅烷化試劑的光纖化學發(fā)光免疫傳感器(CL-OFIS)、比色ELISA、CL-ELISA進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以DCBZS(4-(3′-dichloromethylsilyl)propyloxybenzophenone)修飾的CL-OFIS檢測抗布魯氏菌IgG抗體的最低檢測限為0.207 μg/mL，明顯低于比色ELISA的檢測極限0.828 μg/mL和CL-ELISA的檢測極限0.414 μg/mL。此外，CL-OFIS較傳統(tǒng)的ELISA耗時少，操作程序簡單,更加適合現(xiàn)場疫病的診斷。

4.5戊型肝炎和耶爾森氏菌化學發(fā)光檢測方法Klaus[28]等通過將流動注射技術(shù)與化學發(fā)光免疫芯片結(jié)合起來，可實現(xiàn)同時檢測豬血清中是否含有戊型肝炎病毒和耶爾森氏菌。該研究將戊型肝炎抗原O2C-gt1、O2C-gt3和耶爾森氏菌外活性蛋白D組成重組抗原固定到載玻片上，用顯微陣列分析平臺MCR3 (MCR3結(jié)合了化學發(fā)光和流動注射系統(tǒng))來檢測抗戊型肝炎病毒和抗耶爾森氏菌的IgG抗體。該方法可在9 min內(nèi)自動完成檢測過程，其特異性和重復性都明顯高于ELISA。

4.6李斯特菌化學發(fā)光檢測方法Liu等[29]第一次將試紙微流控化學發(fā)光檢測技術(shù)與簡單的電荷耦合器(charge-coupled device CCD)結(jié)合，減少了檢測時間且降低了檢測成本。該方法利用對碘酚來加強辣根過氧化酶-魯米諾-雙氧水系統(tǒng)的化學發(fā)光，并且改變了蠟絲網(wǎng)印刷的方法，降低了加熱溫度，減少了能量的消耗。最重要的是該方法巧妙地利用折紙的方法構(gòu)建了微閥門，使加樣和洗滌步驟更加方便，同時降低了交叉污染的可能性。用該試紙微流控化學發(fā)光傳感器來檢測由李斯特菌靶向hlyA基因擴增而來的198 bp的DNA，在最優(yōu)條件下，線性范圍為1.94×10-1pmol/L～1.94×104pmol/L,最低檢測限為6.3×10-2pmol/L，相比于其它的基于CCD微流控化學發(fā)光檢測DNA的方法低3-5個數(shù)量級。

4.7多種腹瀉病原化學發(fā)光檢測方法Wang 等[30]利用PCR、親和素-生物素系統(tǒng)、DNA雜交、辣根過氧化酶催化的化學發(fā)光等技術(shù)可對多種腹瀉病原同時進行高效檢測。該方法用戊二醛連接氨基化的載玻片和氨基化的DNA探針，然后從腸出血性大腸桿菌、霍亂弧菌(Vibriocholerae)、志賀氏桿菌(Shigella)、沙門氏菌(Salmonella)中分離出6組基因，用多重PCR同時擴增3組基因。在每個檢測單位中，同時加入3個基因的擴增產(chǎn)物，可實現(xiàn)多組分同時檢測。檢測最低限為0.75 nmol/L，該方法也可進一步應(yīng)用到現(xiàn)場檢測中。Liu等[31]將連接依賴性PCR應(yīng)用到上述基于親和素-生物素、磁性納米顆粒的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)中可實現(xiàn)對基因拷貝數(shù)定量檢測。由于連接依賴性PCR和磁性納米技術(shù)的應(yīng)用，使信號進一步得到了放大，從而增加了對基因拷貝數(shù)檢測的敏感性。

5相關(guān)動物疫病化學發(fā)光檢測方法

近幾年來關(guān)于化學發(fā)光檢測技術(shù)在動物疫病診斷中的應(yīng)用只有圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)、豬細小病毒(porcine parvovirus virus, PPV)、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)等幾篇報道。

5.1豬細小病毒化學發(fā)光檢測方法Zhou等[32]將檢測抗體和辣根過氧化酶同時固定在金納米上作為納米探針，建立了快速檢測豬細小病毒的化學發(fā)光檢測方法。在最優(yōu)條件下，陽性血清在稀釋1∶80～1∶5 120倍時呈線性關(guān)系，在稀釋1∶10 240(S/N=3)時為檢測最低限，相比于ELISA的檢測極限(1∶160，S/N=3)要低很多。此外，為了分析金納米的優(yōu)越性，該研究對以金納米為載體的化學發(fā)光檢測方法和普通的化學發(fā)光檢測方法進行了比較，兩種方法分別對1∶200倍稀釋的陽性血清進行了檢測，得到的信噪比分別為54.1和29.4。這說明以金納米為載體能顯著提高化學發(fā)光檢測的敏感性。

5.2豬圓環(huán)病毒化學發(fā)光檢測方法Zhang等[33]通過用羥氨放大金納米顆粒反應(yīng)來增強化學發(fā)光信號，建立了高效檢測2型豬圓環(huán)病毒的化學發(fā)光檢測方法。在最優(yōu)的實驗條件下，檢測極限可以低至2.67×102copies/mL。同時該實驗檢測了36份臨床血清樣品，與PCR法比較，該方法有較高的敏感性和特異性，可以進一步應(yīng)用到其他疾病的診斷中去。5.3偽狂犬病毒化學發(fā)光檢測方法Yang等[34]基于上述磁性納米顆粒的作用原理建立了高效檢測偽狂犬病毒的化學發(fā)光檢測方法，其檢測極限可低至100 amol/5 pM。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.05.013

中圖分類號：R372

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)05-485-05

Corresponding author:Chang Hui-yun, Email:changhuiyun@126.com

收稿日期：2015-03-17修回日期：2016-02-22

Application of chemiluminescence for diagnosis of zoonoses

LIU Ze-zhong, LI Yang-fan, CHANG Hui-yun

(StakeKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology/NationalFoot-and-MouthDiseasesReferenceLaboratory/LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China)

Abstract:Chemiluminescence is a new and extremely sensitive technology. In this paper, we reviewed the fundamental principal and category of chemiluminescence, and described the new technologies used in chemiluminescence detection system, such as nanomaterials，magnetic beads，biosensors and so on. Subsequently, the latest application of chemiluminescence in zoonoses diagnostics and animal diseases diagnostics has been particularly reported. Finally, the prospects of chemiluminescence for the next few years are proposed．

Key words:chemiluminescence; animal diseases; zoonoses; detection Supported by the China Agriculture Research System (No.CARS-36-06B)