王慧霞　詹向紅　李　偉　劉勝利　王有杰

(河南中醫(yī)學(xué)院，河南　鄭州　450008)

情緒應(yīng)激造模方法

王慧霞1詹向紅李偉劉勝利王有杰

(河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008)

〔關(guān)鍵詞〕情緒應(yīng)激；動物造模；行為學(xué)

社會應(yīng)激事件頻發(fā)引發(fā)的情緒問題日益增多，情緒沖突已成為多種疾病發(fā)病率升高的重要原因之一，并在引起衰老、導(dǎo)致疾病的過程中起重要作用。由于倫理學(xué)的限制，動物實(shí)驗(yàn)是較為理想的研究疾病發(fā)生機(jī)制的方法。但情緒的主觀性和復(fù)雜性使情緒動物模型的制備和評估存在較大難度，本文對近幾年常用的情緒應(yīng)激動物模型進(jìn)行簡要綜述。

1社會應(yīng)激法

傳統(tǒng)的情緒應(yīng)激動物模型將動物置于一系列不可逃避的物理或化學(xué)應(yīng)激環(huán)境中，通過建立動物之間短暫的不良社會關(guān)系，從而誘發(fā)負(fù)性情緒心理反應(yīng)及行為，更多地考慮到動物的社會屬性，是一種更加純粹的心理應(yīng)激造模方法，但模型的復(fù)制成功率較低，需對兩種動物的品系、月齡及周圍環(huán)境等因素嚴(yán)格控制。

1.1社交失敗模型最早是Mine等〔1〕設(shè)計的,實(shí)驗(yàn)者將一批雄性大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)以誘發(fā)其攻擊行為傾向。一旦另一受試動物進(jìn)入籠內(nèi),就會受到大鼠的猛烈攻擊。但采用其描述方法復(fù)制實(shí)驗(yàn)效果并不理想，研究〔1〕表明，不同品系的動物在社交失敗應(yīng)激中反應(yīng)有差異。

王靜等〔2〕采用樹鼩建立社會競爭失敗病因?qū)W模型，持續(xù)21 d。其中爭斗失敗者被稱為服從者，表現(xiàn)出逃跑、恐懼、順從等從屬性特征。這個過程可導(dǎo)致每天1 h的直接社交沖突和23 h的間接相互影響(比如通過氣味、視覺等)。與正常對照相比,失敗者21 d之后顯示體重、自主活動、躲避行為、尿液皮質(zhì)醇水平等的變化,并且這種改變可持續(xù)至少2 w以上。吳曉等〔3〕將攻擊性CD-1小鼠與C57小鼠放于同一環(huán)境中建立小鼠社交失敗模型并分析該模型的行為學(xué)變化特征，結(jié)果顯示應(yīng)激組C57小鼠在角落區(qū)域停留時間延長，而在社交區(qū)域停留軌跡明顯減少。2005年德國哥廷根大學(xué)〔4〕選用性情兇猛、攻擊性強(qiáng)的Lister Hooded雄鼠攻擊Wistar雄鼠，成功制備出與臨床表現(xiàn)吻合的抑郁癥動物模型，被擊敗動物糖皮質(zhì)激素和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)水平升高，免疫功能及對疾病的抵抗力下降，且有不同腦區(qū)的多巴胺、γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸和5-羥色胺(HT)結(jié)合受體逆轉(zhuǎn)改變，但Lister Hooded品系大鼠的獲取很難〔5〕。

社交失敗模型是一種社會性應(yīng)激，它模擬人類在正常交往中遇到挫折并孤立無助的情景，通過引起動物成員之間的社會沖突產(chǎn)生應(yīng)激，在大鼠中由一個侵略雄性所引起的社交失敗是一種自然應(yīng)激因子，該種應(yīng)激能引起分子、生理及行為變化，這種變化有時會很持久，包括自發(fā)及探索活動減少，侵略行為及性行為減少，服從行為及焦慮增加；同時文獻(xiàn)報道顯示，社交失敗應(yīng)激對獎賞系統(tǒng)產(chǎn)生影響〔6〕，從而引起動物興趣下降及快感缺失，這恰恰與抑郁癥的核心癥狀相似。

2間接刺激法

此類造模方法并非直接對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行負(fù)性軀體刺激如足底電擊、束縛、禁食禁水或冷刺激產(chǎn)生應(yīng)激，而是以另一批動物為依托，實(shí)驗(yàn)者對其施加各種電擊等刺激，同時將模型組動物與直接應(yīng)激動物置于同一環(huán)境中，以此誘發(fā)動物的心理應(yīng)激反應(yīng)。該類方法在一定程度上降低了模型的軀體應(yīng)激成分，是一種較為理想的情緒應(yīng)激動物模型，但其所誘發(fā)的情緒成分復(fù)雜，尚不夠明確。

2.1旁觀電擊法Katsura等〔7〕設(shè)計的旁觀電擊小鼠方案作為小鼠的心理應(yīng)激模型。被電擊小鼠(電擊電流為2 mA，周期5 s，間歇55 s)產(chǎn)生驚叫、驚跳，甚至便失禁；實(shí)驗(yàn)應(yīng)激組小鼠不受電擊，而是旁觀電擊小鼠遭受電擊的過程，通過視覺、聽覺等產(chǎn)生心理應(yīng)激。實(shí)驗(yàn)后期有些動物在電擊鼠驚叫驚跳時身體轉(zhuǎn)向另一側(cè)，毫無反應(yīng)，這與動物在此過程中心理產(chǎn)生的適應(yīng)性有關(guān)；同時，有的實(shí)驗(yàn)動物為逃避足底電擊,會爬到箱壁和頂部；動物的排泄物可能導(dǎo)致電流減小或消失等,嘗試通過增加電流的強(qiáng)度和延長電擊時間來克服這些問題。

2.2間接電擊法課題組〔8〕前期的實(shí)驗(yàn)提出一種新的情緒誘發(fā)方法——間接電擊激怒法，實(shí)驗(yàn)過程中人為地用電極觸碰攻擊鼠胸腹部，攻擊鼠受電擊后被激怒，對應(yīng)激組大鼠發(fā)起攻擊，雙方互相撕咬、對峙，產(chǎn)生憤怒心理和行為。該法的優(yōu)點(diǎn)在于誘發(fā)的憤怒情緒較為理想，很大程度上減少軀體應(yīng)激成分。

3直接刺激法

直接刺激法的種類較多，是目前情緒應(yīng)激動物模型最常用的方法，特點(diǎn)是將動物置于一種不可避免的應(yīng)激環(huán)境，給予一種或多種刺激，如足底電擊、束縛等，模型制作過程相對簡單易操作，對實(shí)驗(yàn)條件要求較低，更容易實(shí)現(xiàn)；但不可避免地存在軀體應(yīng)激，若合理控制則較為成功。

3.1足底電擊、束縛等很多文獻(xiàn)以足底電擊結(jié)合聲音或光照作為應(yīng)激條件，結(jié)果顯示:應(yīng)激對照組與心理應(yīng)激組受到的軀體刺激相同,但后者無法根據(jù)光信號預(yù)見電刺激,因此較前者更緊張,心理應(yīng)激程度更高〔9〕。研究〔10〕采用光電結(jié)合方法對糖尿病大鼠進(jìn)行應(yīng)激。結(jié)果顯示糖尿病大鼠血糖明顯升高，光電結(jié)合應(yīng)激抑制大鼠的反應(yīng)，并對糖尿病大鼠的行為、 血糖產(chǎn)生影響。

束縛是一種純粹的挫折應(yīng)激，短時間的束縛應(yīng)激可成功制作動物焦慮模型，隨著束縛應(yīng)激時程的增長，動物更多地表現(xiàn)出嗜睡、興趣降低等抑郁樣行為。但不同的束縛方式所引起的軀體應(yīng)激差異大。賀立娟等〔11〕運(yùn)用慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)法建立肝氣郁結(jié)證大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn),給予大鼠慢性束縛21 d后，模型組 ACTH、皮質(zhì)酮(CORT)水平顯著升高，柴胡疏肝散給藥干預(yù)后可顯著降低其水平，該結(jié)果提示此模型的中醫(yī)病理機(jī)制與肝失疏泄有關(guān)。此外,噪音刺激、強(qiáng)迫游泳、冷熱刺激等也可引發(fā)不可逃避性應(yīng)激模型。

3.2慢性不可預(yù)知性心理應(yīng)激近幾年來國內(nèi)外研究多采用多重復(fù)合應(yīng)激法誘發(fā)動物的情緒反應(yīng)，慢性不可預(yù)見性心理應(yīng)激方法誘導(dǎo)動物抑郁等復(fù)合負(fù)性情緒行為，此種應(yīng)激模型中應(yīng)激因子多樣化且不可預(yù)測，能避免單一刺激所引起的適應(yīng)性，可應(yīng)用于慢性心理應(yīng)激的神經(jīng)生物學(xué)和行為心理學(xué)研究。它包括一系列不可預(yù)知的低強(qiáng)度應(yīng)激,如束縛、強(qiáng)迫游泳、禁食禁水、搖晃等,從病因?qū)W角度模擬抑郁癥的環(huán)境誘因,以曠場行為反應(yīng)及動物糖水消耗量作為觀測指標(biāo),經(jīng)過特異性及可信性評價,被認(rèn)為是經(jīng)典的慢性抑郁模型〔12〕。富文俊等〔13〕發(fā)現(xiàn)逍遙散可通過下調(diào)慢性不可預(yù)知性心理應(yīng)激損傷大鼠下丘腦室旁核區(qū)ACTH釋放激素(CRH)mRNA表達(dá)而部分恢復(fù)慢性應(yīng)激大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)負(fù)反饋功能，結(jié)果提示此動物模型的預(yù)測效度較優(yōu)。研究〔14〕顯示，慢性不可預(yù)知性心理應(yīng)激上調(diào)多巴胺D2受體表達(dá)，下調(diào)前額皮質(zhì)蛋白激酶A,轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)、p-CREB、cAMP 和蛋白激酶A水平下降，這與臨床上抑郁患者的發(fā)現(xiàn)一致，初步提示多巴胺系統(tǒng)功能失調(diào)在應(yīng)激相關(guān)的抑郁癥等精神障礙疾病中起到核心作用。Mahar等〔15〕將抑郁癥和抗抑郁藥物作用的血清素和神經(jīng)性假設(shè)聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)慢性不可預(yù)知性應(yīng)激顯著地減弱5-HT 神經(jīng)遞質(zhì)和5-HT1A 自受體的敏感性，并且通過減少神經(jīng)再生減輕海馬對HPA軸的抑制，使應(yīng)激軸過度活躍惡化。

4基于條件反射的造模方法

4.1懲罰性飲水懲罰性飲水模型是將動物的飲水行為和不確定的電擊結(jié)合起來，動物如果想滿足飲水的需要就可能會受到電擊的創(chuàng)傷，由此造成動物在飲水和避免電擊之間的趨避沖突，產(chǎn)生焦慮反應(yīng)。這種造模方法是從動物的本能需要出發(fā)，當(dāng)動物的本能遭到威脅時，它們在心理上產(chǎn)生趨避反應(yīng)沖突，誘發(fā)焦慮情緒〔16〕。此種動物模型有較好的預(yù)測效度，是研究抗焦慮藥物藥理學(xué)機(jī)制的良好模型。

在實(shí)施這種造模方法前，必須禁水足夠時間，同時要將大鼠置于電擊箱中適應(yīng)4～5 h，才能達(dá)到理想效果；由于不同性別甚至不同動物個體在飲水需求方面的差異，它們所遭受的電擊程度不一，造成個體所誘發(fā)的焦慮程度不一；這與Basso等〔17〕的研究結(jié)果一致，當(dāng)與雄性大鼠同等體重匹配時，雌性大鼠受到更少的懲罰反應(yīng)，更少的飲水?dāng)z入量，雌性大鼠比雄性大鼠對足底電擊有更低的疼痛閾值，不同的抗焦慮藥物在兩種性別中顯示出的抗焦慮樣作用有較大差異。Pisua等〔18〕研究顯示，喹硫平對C57BL6/N 飲水沖突模型大鼠顯示出一種抗焦慮作用，可以認(rèn)為懲罰性飲水模型大鼠血漿中5-HT含量的變化與模型所誘發(fā)的負(fù)性情緒反應(yīng)有一定的相關(guān)性。這些提示5-HT系統(tǒng)在焦慮情感障礙模型中的重要作用。

4.2空瓶應(yīng)激空瓶應(yīng)激法是以不確定性空瓶飲水刺激作為應(yīng)激源，訓(xùn)練動物在特定的時間段飲水，當(dāng)動物感受到缺水應(yīng)激之后，只給予動物一個沒有水的空瓶,動物吸吮空瓶而得不到水,從而產(chǎn)生挫折感，進(jìn)而誘發(fā)動物的情緒反應(yīng)。

王瑋文等〔19〕發(fā)現(xiàn)不同時程的空瓶應(yīng)激激活HPA和交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(SNS)軸(腎上腺素、去甲腎上腺素和CORT水平升高)的程度不同,這可能與持續(xù)的慢性應(yīng)激后SNS反應(yīng)出現(xiàn)一定程度的適應(yīng)性相關(guān)。歐陽俊彥等〔20〕采用不確定性空瓶應(yīng)激制作焦慮大鼠模型，發(fā)現(xiàn)GABA與焦慮大鼠額葉皮質(zhì)的一氧化氮(NO)合酶(NOS)及NO均呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，提示GABA可能通過調(diào)節(jié)焦慮大鼠額葉皮質(zhì)中的NO含量發(fā)揮抗焦慮作用。

5問題與展望

情緒應(yīng)激動物模型嘗試在實(shí)驗(yàn)動物上復(fù)制人類精神障礙疾病的特征，此模型相關(guān)的生理和行為變化需符合特定情緒狀態(tài)(表面效度)、疾病的病因?qū)W(結(jié)構(gòu)效度)及藥理學(xué)治療反應(yīng)(預(yù)測效度)。但情緒應(yīng)激的發(fā)生是一個復(fù)雜過程，應(yīng)激反應(yīng)因應(yīng)激原種類、動物種屬、性別、生理狀態(tài)、周齡、應(yīng)激狀態(tài)、應(yīng)激持續(xù)時間的不同而有所差異,在一定程度上解釋了各種情緒應(yīng)激所導(dǎo)致的結(jié)果不一致性，但存在著一個基本的趨勢：SNS和HPA是應(yīng)激反應(yīng)的重要環(huán)節(jié),而血清兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素含量的上升被視為應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志〔9〕。應(yīng)激所引起的個體反應(yīng)是由神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫等系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)共同作用的，究竟哪些系統(tǒng)在情緒應(yīng)激發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在應(yīng)激的哪一進(jìn)程起作用，有待進(jìn)一步證實(shí)。

另外認(rèn)知在應(yīng)激發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的中介作用，不同認(rèn)知水平及性格特質(zhì)個體產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)不同，且應(yīng)激的病理生理改變涉及多個腦區(qū)，考察動物的基線認(rèn)知水平，并將其加入情緒應(yīng)激動物模型的考慮因素中，會使情緒應(yīng)激動物模型更接近人類情緒障礙疾病的發(fā)生機(jī)制，例如在實(shí)驗(yàn)之前，采用水迷宮篩選認(rèn)知水平接近的動物參與造模。

因此，發(fā)展有效、客觀的情緒應(yīng)激動物模型，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計、指標(biāo)選擇，系統(tǒng)全面地認(rèn)識指標(biāo)的變化，將會對進(jìn)一步明確情緒應(yīng)激過程的各個生理反應(yīng)，深入分析情緒的心理學(xué)發(fā)生機(jī)制及探討中醫(yī)情志疾病起因和發(fā)病機(jī)制有重要指導(dǎo)意義。

6參考文獻(xiàn)

1Mine K,Noda T,Fujiwara M,etal.Autonomic drug effects and gastric secretion in a new experimental model of stress ulcers in rats〔J〕.Pharmacol Biochem Behav,1983;19(2):359-64.

2王靜，周啟心，呂龍寶，等.社會競爭失敗病因?qū)W的抑郁癥樹鼩模型〔J〕.動物學(xué)研究，2012；33(1):92-8.

3吳曉，吳金峰，董競成.社交應(yīng)激動物模型的建立及其效果評價〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013；33(6):800-4.

4Rygula R，Abumaria N，F(xiàn)lugge G，etal.Anhedonia and motivational deficits in rats:impact of chronic social stress〔J〕.Behav Brain Res，2005;162(1):127-34．

5魏盛，王海蘋，喬明琦.慢性束縛應(yīng)激及居住入侵法制備經(jīng)前期綜合征肝氣郁證大鼠模型的行為學(xué)觀測與分析〔J〕.世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化),2012;14(4)：1848-52.

6Rygula R,Abumaria N,Domenici E，etal.Effects of fiuoxetine on behavioral deficits evoked by chronic social stress in rats〔J〕.Behav Brain Res，2006;174(1):188-92．

7Katsura M,Mohri Y,Shuto K，etal.Psychological stress,but not physical stress,causes increase in diazepam binding inhibitor(DBI)mRNA expression in mouse brains〔J〕.Brain Res Mol Brain Res，2002;104(1):103-9．

8劉勝利.慢性憤怒應(yīng)激對大鼠腦老化的影響及其神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制〔D〕.鄭州：河南中醫(yī)學(xué)院，2010.

9曹碧茵，施建蓉，童瑤，等.心理應(yīng)激動物模型的研制及其應(yīng)用〔J〕.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué),2005;14(2):191-2.

10葉茂茂，李慧吉，武成，等.光電結(jié)合應(yīng)激法對糖尿病大鼠心理應(yīng)激病證結(jié)合模型制作的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2013;19(3):274-5，279.

11賀立娟，王玉來，郭蓉娟，等.肝氣郁結(jié)證大鼠模型的建立及評價〔J〕.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(中醫(yī)臨床版),2013;20(6):10-3.

12Willner P,Towell A,Sampson D,etal.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress,and its restoration by a tricyclic antidepressant〔J〕.Psychopharmacology(Berl),1987;93(3):358-64.

13富文俊，敖海清，孫琪,等.逍遙散對慢性應(yīng)激損傷大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素表達(dá)的影響〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011;17(19):216-8.

14Chen C,Yang JM,Hu TT,etal.Elevated dopamine D2 receptor in prefrontal cortex of CUMS rats is associated with downregulated cAMP-independent signaling pathway〔J〕.Can J Physiol Pharmacol,2013;91(9):750-8.

15Mahar I,Bambico FR,Mechawar N，etal.Stress,serotonin,and hippocampal neurogenesis in relation to depression and antidepressant effects〔J〕.Neurosci Biobehav Rev,2014;38:173-92.

16Vogel JR,Beer B,Clody DE.A simple and reliable conflict procedure for testing anti-anxiety agents〔J〕.Psychopharmacologia，1971;21(1):1-7.

17Basso AM,Gallagher KB,Mikusa JP,etal.Vogel confiict test:sex differences and pharmacological validation of the mode〔J〕.Behav Brain Res,2011;218(1):174-83.

18Pisua C,Pira L,Pani L.Quetiapine anxiolytic-like effect in the Vogel conflict test is serotonin dependent〔J〕.Behav Pharmacol,2010;21(7)：649-53.

19王瑋文，邵楓，林文娟.不同時程應(yīng)激對大鼠行為、免疫和交感神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)的影響〔J〕.心理學(xué)報,2007;39(2):292-8.

20歐陽俊彥，胡卓炎，禇玥,等.γ-氨基丁酸對情緒應(yīng)激大鼠額葉皮質(zhì)一氧化氮合酶和一氧化氮水平的影響〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2013;35(5):385-9.

〔2015-04-30修回〕

(編輯苑云杰/王一涵)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30973695，81173148)

通訊作者：詹向紅(1963-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事情志與衰老相關(guān)疾病的理論及應(yīng)用研究。

〔中圖分類號〕R33

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2530-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.105

1河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校

李偉(1969-)，男，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合病理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

第一作者：王慧霞(1987-)，女，碩士，主要從事情志與衰老相關(guān)性疾病的理論及應(yīng)用研究。