吳　佳， 劉　偉， 李保新

(陜西省生命分析化學(xué)重點實驗室， 陜西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 陜西 西安 710119)

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聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的銅納米粒子熒光探針高靈敏檢測L-半胱氨酸

吳佳， 劉偉， 李保新*

(陜西省生命分析化學(xué)重點實驗室， 陜西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 陜西 西安 710119)

摘要：以聚胸腺嘧啶寡核苷酸為模板分子，利用一步法溫和快速合成了穩(wěn)定性好、熒光性能優(yōu)異的銅納米粒子?；贚-半胱氨酸能通過巰基高選擇性地與銅納米粒子發(fā)生相互作用形成Cu—S鍵，從而淬滅銅納米粒子熒光的現(xiàn)象，建立了測定L-半胱氨酸的熒光檢測新方法。此方法測定L-半胱氨酸的線性范圍為3~50 μmol/L，檢出限為0.56 μmol/L，可望用于尿液中L-半胱氨酸含量的測定。

關(guān)鍵詞：聚胸腺嘧啶； 銅納米粒子； 熒光； L-半胱氨酸

半胱氨酸作為一種重要的生物巰基化合物，在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊、代謝、解毒及氧化還原反應(yīng)等很多過程中起到積極作用[1-4]，其變化直接反映了生物體的生理狀況。半胱氨酸水平較低時可能引起許多健康問題，如造血減少、毛發(fā)色素脫失、皮膚損傷、肝功能損傷和癌癥[5]。半胱氨酸還被廣泛應(yīng)用于各種化妝品和藥物制劑中[6]。因此，排除其他氨基酸和類似物的干擾，實現(xiàn)半胱氨酸在環(huán)境、藥物和具有高靈敏度和選擇性的生物樣品或制劑中的檢測具有非常重要的意義。目前檢測L-半胱氨酸的方法主要包括高效液相色譜法[7]、質(zhì)譜法[8]、電化學(xué)法[9-10]、比色法[11-12]、熒光法[13]、化學(xué)發(fā)光法[14]。然而，這些方法存在檢測成本高、消耗時間較長、實驗過程繁瑣以及需要專業(yè)技術(shù)人員操作大型儀器等不足。

近十年來，貴金屬熒光納米材料由于其獨特的電學(xué)性質(zhì)、光學(xué)性質(zhì)，被廣泛地用于生物偶聯(lián)技術(shù)、催化、納米器件、細胞成像以及生物傳感等各個領(lǐng)域[15-19]。其中，以蛋白質(zhì)、氨基酸、DNA為模板合成的熒光納米粒子，具有不易光漂白、生物相容性好、合成條件溫和等優(yōu)點。比如，雙鏈DNA穩(wěn)定的熒光銅納米粒子已被成功應(yīng)用于各類生物傳感器的構(gòu)建，主要包括DNA的檢測[20-21]、小分子的測定[22-23]、酶活性的檢測[24-25]。最近，王柯敏課題組報道了聚胸腺嘧啶寡核苷酸作為一種特殊的單鏈DNA也可用作模板合成熒光性能優(yōu)異的銅納米粒子[26]，并利用此熒光探針實現(xiàn)了S1核酸酶[27]及銅離子[28]的檢測。聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的熒光銅納米粒子與其他熒光納米材料相比，合成方法更為簡單快速，室溫下即可生成，且合成時間只需2 min；雙鏈DNA穩(wěn)定的熒光銅納米粒子因需要進行鏈雜交反應(yīng)，合成時間大于1 h[29]；銀納米簇的合成需要控制溫度，還需避光，反應(yīng)時間相對較長；金納米簇的合成對實驗溫度要求很嚴格，反應(yīng)時間至少為12 h[15]。因而，聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的熒光銅納米粒子為生物及化學(xué)分析檢測提供了新穎的傳感平臺。

本文以聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的銅納米粒子作為熒光探針，基于L-半胱氨酸能通過巰基高選擇性地與銅納米粒子發(fā)生相互作用形成Cu—S鍵，從而淬滅銅納米粒子熒光的現(xiàn)象，建立了測定L-半胱氨酸的熒光新方法，實現(xiàn)了對L-半胱氨酸的簡單、快速、高靈敏、高選擇性檢測。該方法測定L-半胱氨酸的線性范圍為3~50 μmol/L，檢出限為0.56 μmol/L，考察了可能的干擾組分對該體系的影響，并將該方法已應(yīng)用于尿液中加入L-半胱氨酸含量的測定。

1實驗

1.1儀器和試劑

F-4600型熒光分光光度計(日本Hitachi公司)，JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本Jeol公司)，PB-10酸度計(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，QL-861漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、抗壞血酸鈉購于sigma公司，L-半胱氨酸(L-Cys)購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，硫酸銅(CuSO4)、氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2)、氯化鉀(KCl)、氯化鎂(MgCl2)、葡萄糖購于上海化學(xué)試劑有限公司，甘氨酸(Gly)、 L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-脯氨酸(L-Pro)、L-丙氨酸(L-Ala)、L-谷氨酸(L-Glu)、L-精氨酸(L-Arg)、L-蛋氨酸(L-Met)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-色氨酸(L-Trp)、尿素購于阿拉丁試劑(上海)有限公司。聚胸腺嘧啶寡核苷酸(T30，5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)由生工生物工程有限公司合成，純化方式為PAGE。T30溶解在MOPS緩沖液(10 mmol/L MOPS，150 mmol/L NaCl，pH 7.6)中，并儲存在4 ℃。所用試劑均未進一步純化，實驗用水均為超純水(Millipore-Q 18.2 MΩ·cm)。

1.2熒光銅納米粒子的制備及L-半胱氨酸的檢測

向10 μL 10-4mol/L T30溶液中加入963 μL MOPS緩沖液(10 mmol/L MOPS，150 mmol/L NaCl，pH 7.6)和20 μL 0.1 mol/L抗壞血酸鈉溶液，最后加入7 μL 10 mmol/L CuSO4溶液[26]。充分振蕩混勻后，室溫下孵育2 min，以形成熒光銅納米粒子(CuNPs)，分別進行熒光光譜測定。

在1.5 mL離心管中，分別加入100 μL以T30為模板合成的熒光銅納米粒子溶液和100 μL不同濃度的L-半胱氨酸，充分混勻后，室溫下反應(yīng)5 min后分別進行熒光光譜測量。發(fā)射和激發(fā)狹縫寬度均為10 nm，掃速為1 200 nm/min，平均采樣時間為0.05 s，PMT檢測電壓為700 V。

2結(jié)果與討論

2.1熒光探針設(shè)計

L-半胱氨酸的檢測原理如圖1所示，聚胸腺嘧啶寡核苷酸是銅納米粒子形成的有效模板，且形成的銅納米粒子具有強的熒光發(fā)射。但是，當加入一定量的L-半胱氨酸到該傳感體系中時，銅納米粒子的熒光響應(yīng)強度明顯降低。L-半胱氨酸淬滅銅納米粒子熒光的機理仍在探究之中。根據(jù)卿志和等[26]的報道，聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的銅納米粒子形成過程可能是，胸腺嘧啶與Cu2+首先特異性結(jié)合形成絡(luò)合物，然后由抗壞血酸鈉沿著模板聚胸腺嘧啶寡核苷酸的輪廓將Cu2+還原為銅原子。推測L-半胱氨酸淬滅銅納米粒子熒光的機理可能是：一方面，L-半胱氨酸與Cu2+具有很強的結(jié)合作用，可形成絡(luò)合物[30]；另一方面，相比其他氨基酸，L-半胱氨酸含有巰基，可形成Cu—S鍵[31]，破壞了銅納米粒子的結(jié)構(gòu)，從而引起熒光信號的減弱。

圖1　聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的銅納米粒子檢測L-半胱氨酸原理示意圖

本文在設(shè)計序列時選擇了T30作為模板合成銅納米粒子，TEM檢測及粒徑分布圖(圖2)確證了銅納米粒子的形成，其平均粒徑為2.0 nm。圖3表明銅納米粒子的熒光性能良好，最大激發(fā)波長為340 nm，最大發(fā)射波長為615 nm。圖4為聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的銅納米粒子與100 μmol/L L-半胱氨酸作用前后的熒光響應(yīng)光譜圖。當沒有L-半胱氨酸存在時，銅納米粒子保持其熒光特性；加入L-半胱氨酸后，銅納米粒子的熒光被淬滅，在615 nm處的熒光強度明顯降低?；谝陨犀F(xiàn)象，本文以聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的銅納米粒子為熒光探針構(gòu)建了檢測L-半胱氨酸的新方法。

圖2　聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的銅納米粒子的透射電鏡圖(a)和粒徑分布柱狀圖(b)

圖3　聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的銅納米

圖4　聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的銅納米粒子在100 μmol/L

2.2實驗條件優(yōu)化

根據(jù)實驗原理，檢測L-半胱氨酸傳感體系的靈敏度極大程度上取決于聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的銅納米粒子熒光探針的性質(zhì)。本文考察了銅納米粒子的合成條件，包括T30的濃度、Cu2+的濃度、抗壞血酸鈉的濃度，以及銅納米粒子與L-半胱氨酸的反應(yīng)時間對整個傳感體系的影響。T30作為形成銅納米粒子的模板，其濃度對銅納米粒子的熒光強度有很大的影響。隨著T30濃度的增加，銅納米粒子的熒光強度也逐漸增加。T30的濃度為1 000 nmol/L時所形成的銅納米粒子熒光相對較強，達到了檢測要求，更有利于提高L-半胱氨酸檢測的靈敏度。銅納米粒子的形成包含Cu2+被還原為銅原子的過程，隨著Cu2+濃度的增加，熒光強度也逐漸升高，而當Cu2+濃度高于70 μmol/L時，形成的銅納米粒子的熒光強度略有降低，因此Cu2+濃度選擇70 μmol/L較為合適?？箟难徕c作為形成熒光銅納米粒子的還原劑，其濃度達到2 mmol/L時，熒光強度最大。不同濃度的L-半胱氨酸剛加入銅納米粒子，立刻引起了銅納米粒子熒光的淬滅，當反應(yīng)時間較短時，體系熒光強度未能達到穩(wěn)定值，為保證反應(yīng)的充分進行以及實驗結(jié)果的準確性，選擇5 min作為銅納米粒子與L-半胱氨酸的反應(yīng)時間。

2.3方法靈敏度和選擇性

在最佳的實驗條件下對該方法的靈敏度進行了考察，實驗結(jié)果如圖5a所示，當L-半胱氨酸濃度在3~50 μmol/L范圍內(nèi)時均能不同程度地淬滅銅納米粒子的熒光，其最大淬滅效率可達96%，隨著L-半胱氨酸加入濃度的逐漸增大，熒光強度減小的程度也越來越大，銅納米粒子在615 nm處的熒光強度逐漸降低。根據(jù)銅納米粒子熒光強度變化與L-半胱氨酸濃度之間的關(guān)系，我們建立一種基于熒光法定量檢測L-半胱氨酸的分析方法。F0-F與L-半胱氨酸濃度的關(guān)系如圖5b所示，其中F0和F分別表示不存在和存在目標物時的熒光信號。L-半胱氨酸濃度在3~50 μmol/L范圍內(nèi)時，F(xiàn)0-F與L-半胱氨酸濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R為0.997 0，該熒光方法對L-半胱氨酸的檢出限為0.56 μmol/L。

圖5　不同濃度L-半胱氨酸對銅納米粒子熒光淬滅光譜圖(a)、熒光強度差值(F0-F) 與L-半胱氨酸濃度關(guān)系圖(b)

為了進一步探究所設(shè)計的熒光法檢測L-半胱氨酸的選擇性，本文考察了體系對其他氨基酸的響應(yīng)情況，如甘氨酸、 L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-精氨酸、L-蛋氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸。50 μmol/L L-半胱氨酸的加入使得銅納米粒子的熒光明顯減小，淬滅程度極大；而50 μmol/L其他氨基酸獨自存在于銅納米粒子溶液中，對銅納米粒子的熒光信號強度基本沒有影響，其對銅納米粒子熒光強度變化率為±5%。同時，本文還考察了尿液中可能含有的干擾物質(zhì)對L-半胱氨酸檢測的影響，10-7mol/L葡萄糖、10-4mol/L尿素以及10-5mol/L Na+、K+、Ca2+、Mg2+均無干擾。

2.4樣品分析

為了進一步考察該方法的實用性及準確性，本文將不同濃度的L-半胱氨酸加入到稀釋100倍的尿液樣品中，將銅納米粒子作為熒光探針，以上述標準曲線進行L-半胱氨酸含量的檢測，結(jié)果列于表1。本方法對尿液中L-半胱氨酸加入量檢測的回收率在95.6% ~ 100.9%之間，相對標準偏差范圍為2.5%~5.1%，這些結(jié)果表明該傳感體系對尿液中L-半胱氨酸含量的測定具有適用性和可靠性。

表1　尿液中測定加入L-半胱氨酸含量的分析結(jié)果

3結(jié)論

本文報道了以聚胸腺嘧啶寡核苷酸介導(dǎo)的銅納米粒子為熒光探針檢測L-半胱氨酸。當L-半胱氨酸存在時，銅納米粒子的熒光被淬滅，依據(jù)加入L-半胱氨酸前后的熒光信號強度的變化，實現(xiàn)了對L-半胱氨酸的定量分析。與常規(guī)測定法相比，該方法無需對DNA進行標記從而極大地降低了檢測成本；過程中無須任何洗滌、分離等操作步驟，操作簡單方便；同時，整個實驗過程在10 min內(nèi)即可完成，高效快速；此外，該方法還具有較好的選擇性，不受其他組分的干擾，方法靈敏度也較高，檢出限達到了0.56 μmol/L，已成功應(yīng)用于尿液中L-半胱氨酸含量的測定，在實際應(yīng)用方面具有較好的前景。

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〔責任編輯王勇〕

第一作者： 王艷,女,碩士研究生，研究方向為電化學(xué)分析。E-mail：1006579188@qq.com

Poly(thymine)-templated copper nanoparticles as fluorescent probes

for highly sensitive detection of L-cysteine

WU Jia, LIU Wei, LI Baoxin*

(Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science of Shaanxi Province,

School of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi Normal University,

Xi′an 710119, Shaanxi, China)

Abstract:A simple and sensitive method for the detection of L-cysteine was established using fluorescent copper nanoparticles (CuNPs) synthesized by polythymine (poly T) as a templet. In the presence of L-cysteine, the fluorescence of CuNPs was tremendously quenched through a robust Cu-S bond between -SH in cysteine molecule and Cu of CuNPs. Under the optimized experimental conditions, the probe exhibited excellent performance in the range from 3 to 50 μmol/L with a detection limit of 0.56 μmol/L. Moreover, the developed bioassay was successfully applied to selective detection and determination of L-cysteine in human urine samples.

Keywords:polythymine; copper nanoparticles; fluorescence; L-cysteine

通信作者：* 郭志慧,女,副教授,博士。E-mail：zhguo@snnu.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金(21375085)

收稿日期：2015-02-10

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2016.01.312

文章編號：1672-4291(2016)01-0060-06

中圖分類號：O657.3

文獻標志碼：A