唐　娜， 陶樹興*， 梁　健， 馮曉磊, 戶引紅， 許真珍， 熊　平

(1 陜西師范大學 生命科學學院， 陜西 西安 710119；

2 渭南德龍生物科技有限公司，陜西 渭南 714000)

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產(chǎn)絲氨酸蛋白酶芽胞桿菌的鑒定及其生防作用

唐娜1， 陶樹興1*， 梁健1， 馮曉磊1, 戶引紅2， 許真珍1， 熊平1

(1 陜西師范大學 生命科學學院， 陜西 西安 710119；

2 渭南德龍生物科技有限公司，陜西 渭南 714000)

摘要：為篩選絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生菌用于生物防治，利用絲氨酸蛋白酶的特殊底物BApNA和特異性抑制劑PMSF確定產(chǎn)絲氨酸蛋白酶菌株，依據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA比對分析對菌株進行鑒定，用對峙法、抑菌圈法和液體振蕩培養(yǎng)法觀察抗植物病原真菌的作用，用96孔板法觀察抗線蟲作用。實驗篩選到產(chǎn)絲氨酸蛋白酶的芽胞桿菌SNUB19，鑒定結果為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)，該菌株發(fā)酵液的無菌濾液對尖孢鐮刀菌等植物病原真菌有顯著的抑制作用，對南方根結線蟲有較強的致死效應。

關鍵詞：絲氨酸蛋白酶； 芽胞桿菌； 菌種鑒定； 植物病原真菌； 南方根結線蟲

隨著耕地面積的減少和保護栽培的發(fā)展，作物連作不可避免。作物連作中由植物病原真菌和根結線蟲引起的土傳病害是造成作物減產(chǎn)和品質下降的重要原因，世界上每年由此造成的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失達上千億美元[1-2]。目前，作物土傳病害的防治主要采取物理防治、化學防治和生物防治3種防治措施，物理防治的防效較低，化學防治中有害物質殘留較高,因此生物防治受到廣泛重視[3]。絲氨酸蛋白酶是一類活性中心含有絲氨酸的蛋白酶，它可以水解特殊底物Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽(BApNA)并受苯甲基磺酰氟(PMSF)特異性抑制[4-5]。絲氨酸蛋白酶屬于堿性蛋白酶，作用的最適pH值一般為8~10[6]。目前絲氨酸蛋白酶的研究與應用非常活躍，產(chǎn)絲氨酸蛋白酶微生物在植物病原真菌和根結線蟲生物防治中的應用已引起廣泛關注[7]。本實驗室從多年連作大棚栽培的番茄根際土壤中篩選到兩株絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生菌SNUB18和SNUB19，SNUB18為假單胞菌(Pseudomonassp.)，SNUB19為芽胞桿菌(Bacillussp.)。本文報道SNUB19的鑒定結果及其對植物病原真菌的抑菌作用和對南方根結線蟲的致死效應。

1材料和方法

1.1實驗菌株和線蟲

芽胞桿菌(Bacillussp.)SNUB19：為本實驗室從多年連作大棚栽培的番茄根際土壤中分離獲得。

植物病原真菌：玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)PF3、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)PF4、葡萄炭疽病菌(Colletotrichumgloeospori-oide)PF5、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici) PF6、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)PF8，由西北農(nóng)林科技大學植物保護學院提供；香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)Foc4-1，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所提供；尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)SNUF9，為本實驗室保藏菌株。

南方根結線蟲(Meloidogyneincongnita(Kofold&White) Chitwood)：2齡幼蟲由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所提供。

1.2培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、干酪素培養(yǎng)基、脫脂牛奶培養(yǎng)基、玉米粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基按文獻[8]配制。

1.3主要化學試劑

Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽酸鹽(BApNA)為Sigma公司產(chǎn)品；苯甲基磺酰氟(PMSF)購自國藥集團化學試劑有限公司；EDTA、Triton x-100購自天津市登峰化學品有限公司；干酪素蛋白胨、牛肉膏、MgCl2、MgSO4·7H2O、NaCl、Na2CO3、NaCl、三羥甲基氨基甲烷、三氯乙酸、冰乙酸等均為分析純試劑；伊利脫脂牛奶為市售產(chǎn)品。

1.4主要儀器設備

E600型Nikon ECLIPSE相差顯微鏡，SZX-ILLK200型解剖顯微鏡，日本Nikon公司產(chǎn)品；SW-CJ-1CU型潔凈工作臺,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；H2Q-F100型全溫震蕩培養(yǎng)箱，太倉市實驗設備廠。5415R臺式冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司；Sigma 3-18k型離心機，Sigma離心機有限公司；MF1型自動菌落計數(shù)儀，杭州訊數(shù)科技公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司； 0.22 μm微孔濾膜，邁博瑞生物膜技術有限公司；牛津杯，上海東方藥品科技實業(yè)有限公司；96孔板，USA costar。

1.5絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選

制備土壤樣品懸液，用脫脂牛奶平板分離產(chǎn)蛋白酶菌株。將獲得的產(chǎn)蛋白酶菌株經(jīng)純化后，通過液體振蕩培養(yǎng)和離心制備粗酶液，用絲氨酸蛋白酶特殊底物BApNA和特異性抑制劑PMSF確定菌株所產(chǎn)蛋白酶是否為絲氨酸蛋白酶[4-5]。

1.6絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生菌的鑒定

形態(tài)學觀察： 將絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生菌涂布于脫脂牛奶培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)48～72 h，觀察記錄菌落形狀、大小、顏色、邊緣、表面光滑度等。用常規(guī)制片法和染色法觀察細胞的形狀、大小、兩端形狀、細胞排列方式、芽胞及位置等。

生理生化特性測定：按文獻方法進行[9-10]。

16s rDNA 序列分析與系統(tǒng)學分析: 16s rDNA基因序列分析由上海生工生物工程有限公司完成；基因比對采用美國國家生物技術信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST在線完成，系統(tǒng)學分析建樹采用軟件MEGA4.1完成。

1.7抗植物病原真菌的觀察

用平板對峙法、牛津杯法測定SNUB19對7株植物病原真菌的抗菌譜，用凹載玻片培養(yǎng)法、載玻片培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)法探討SNUB19對尖孢鐮刀菌SNUF9的抑菌機理[11]。

1.8抗南方根結線蟲試驗

實驗在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所完成。將芽胞桿菌SNUB19的發(fā)酵液離心、除菌過濾得到無菌上清液，用96孔板每孔加入10 μL線蟲懸液后再加入190 μL無菌上清液，置28 ℃孵育，定時觀察線蟲存活情況，拍照，統(tǒng)計死亡率。

校正死亡率(%)=(處理組死亡率—對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)×100%。

1.9數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件完成。

2結果分析

2.1絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選和鑒定

2.1.1絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選從多年連作大棚栽培的番茄根際土壤中分離獲得的芽胞桿菌(B. sp.)SNUB19在脫脂牛奶平板上菌落呈不規(guī)則形，邊緣不整齊，為不透明的白色，表面干燥，無金屬光澤，蛋白質水解圈清晰可見(圖1)。酶的最適pH為8.0。采用絲氨酸蛋白酶的特殊底物BApNA，特異性抑制劑PMSF對酶的抑制率為91.50%±0.13%，而EDTA 和Triton X-100對蛋白酶的抑制率分別為23.10%±0.61%和17.60%±0.46%，可以初步認定菌株SNUB19所產(chǎn)蛋白酶為絲氨酸蛋白酶。

a.平板涂布　　　　　　　b.平板點接

2.1.2芽胞桿菌SNUB19的鑒定芽胞桿菌SNUB19的菌體為桿狀，寬0.7～0.8 μm，長2～3 μm，革蘭氏染色為陽性(圖2a)，培養(yǎng)3 d后菌體內形成芽胞，芽胞位于菌體的中間或位于菌體的一端，芽胞寬0.6～0.8 μm，長1.0～1.5 μm(圖2b)。

圖2 芽胞桿菌SNUB19的形態(tài)特征

芽胞桿菌SNUB19的生理生化特性見表1。

表1 芽胞桿菌SNUB19的生理生化特性實驗結果

芽胞桿菌SNUB19測序得到的16s rDNA序列長度為1432bp，將序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST在線比對，結果顯示菌株SNUB19在系統(tǒng)進化樹中與Bacillussubtilis(登錄號HQ678671.1)的親緣關系最近(圖3)。根據(jù)芽胞桿菌SNUB19的形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》[9-10]，絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生菌SNUB19鑒定結果為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。

圖3 芽胞桿菌SNUB19系統(tǒng)進化分析

2.2枯草芽胞桿菌SNUB19的抗真菌作用

2.2.1枯草芽胞桿菌SNUB19對7種植物病原真菌的抑制作用采用平板對峙法測定枯草芽胞桿菌SNUB19對7種植物病原真菌抑菌區(qū)的寬度，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=180.34，明顯大于F(2,6)=10.93，差異極顯著；用牛津杯法測定SNUB19的無菌濾液對7種植物病原真菌的抑菌圈直徑，經(jīng)方差分析F=154.951，遠大于F(6,14)=2.85，差異極顯著；兩種方法均證實枯草芽胞桿菌SNUB19對7種植物病原真菌有不同程度的抑菌作用，其中對玉米大斑病菌PF3、番茄灰霉病菌PF4、葡萄炭疽病菌PF5和辣椒炭疽病菌PF6的抑制作用較強(見表2)。

表2 枯草芽胞桿菌SNUB19對植物

注：同列數(shù)值后相同字母表示差異不顯著，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2.2枯草芽胞桿菌SNUB19對尖孢鐮刀菌的抑菌機理探討

(1)枯草芽胞桿菌SNUB19對尖孢鐮刀菌SNUF9孢子萌發(fā)的影響

圖4是采用凹玻片培養(yǎng)法觀察枯草芽胞桿菌SNUB19無菌濾液對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響。統(tǒng)計表明，培養(yǎng)6 h對照組孢子萌發(fā)率為8.64，處理組為5.88，差異顯著(P<0.05)；培養(yǎng)36 h對照組孢子萌發(fā)率為73.16，處理組為19.67，差異極顯著(P<0.01)。

圖4 芽胞桿菌SNUB19無菌濾液對

a、b為尖孢鐮刀菌SNUF9對照，分別培養(yǎng)6 h、36 h；c、d為尖孢鐮刀菌SNUF9加SNUB19無菌濾液處理，分別培養(yǎng)6 h、36 h。

(2)枯草芽胞桿菌SNUB19對尖孢鐮刀菌SNUF9菌絲生長的影響

圖5是采用平板對峙法觀察枯草芽胞桿菌SNUB19對尖孢鐮刀菌SNUF9的影響，可見尖孢鐮刀菌SNUF9菌落兩端菌絲生長受到抑制，抑菌區(qū)距離達9.62 mm，說明芽胞桿菌SNUB19對尖孢鐮刀菌SNUF9有抑制作用。

圖5　枯草芽胞桿菌SNUB19對尖孢鐮刀菌的拮抗作用

圖6是用載玻片培養(yǎng)定時觀察枯草芽胞桿菌SNUB19無菌濾液對尖孢鐮刀菌SNUF9菌絲生長的影響，SNUF9主要表現(xiàn)為菌絲分支和菌絲數(shù)目明顯減少，菌絲老化，提前形成孢子，另外也發(fā)現(xiàn)少數(shù)菌絲膨大畸變。

圖6 枯草芽胞桿菌SNUB19無菌濾液對

a、b為尖孢鐮刀菌SNUF9對照，分別培養(yǎng)12 h、36 h; c、d為尖孢鐮刀菌SNUF9經(jīng)SNUB19無菌濾液處理，分別培養(yǎng)12 h、36 h。

表3是將枯草芽胞桿菌SNUB19的無菌濾液加入液體培養(yǎng)基進行振蕩培養(yǎng)，觀察尖孢鐮刀菌SNUB19菌絲干重和離心上清液吸光度的變化。結果表明，實驗組的菌絲干重比對照組有明顯下降，離心上清液在260 nm和280 nm處的吸光度比對照組高，這些變化說明枯草芽胞桿菌SNUB19的無菌濾液能使尖孢鐮刀菌SNUF9的菌絲生長受到抑制，使部分菌絲破裂，細胞內物質外流。

2.3枯草芽胞桿菌SNUB19對南方根結線蟲的作用

將南方根結線蟲二齡幼蟲與枯草芽胞桿菌SNUB19的無菌濾液混合，結果發(fā)現(xiàn)，在28 ℃孵育8 h時，幼蟲全部麻痹；孵育24 h，幼蟲全部失去活力，沉于孔底，無法計數(shù)(圖7)。孵育4 h、8 h和16 h南方根結線蟲二齡幼蟲的校正死亡率及方差分析結果分別為：(27.25±1.36)%，(61.84±1.11)%，(91.59±1.01)%，不同時間之間校正死亡率差異極顯著(P<0.01)。

孵育16 h時，二齡幼蟲的校正死亡率大于90%，說明枯草芽胞桿菌SNUB19的無菌濾液對南方根結線蟲二齡幼蟲有較強的殺蟲效應。

表3 枯草芽胞桿菌SNUB19無菌濾液對

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

圖7 枯草芽胞桿菌SNUB19無菌濾液對

a、b、c為南方根結線蟲清水對照組，分別培養(yǎng)4h、8h、16 h； d、e、f為南方根結線蟲經(jīng)SNUB19無菌濾液處理，分別培養(yǎng)4 h、8 h、16 h。

3討論

枯草芽胞桿菌對人和環(huán)境安全，容易培養(yǎng)，生產(chǎn)的生防菌劑在防治土傳真菌病害方面已得到廣泛應用[12]。本實驗室以尖孢鐮刀菌為靶標篩選的枯草芽胞桿菌SNUB16，能產(chǎn)生抗真菌物質，對多種植物病原真菌有很好的防治效果[11]。本研究篩選的絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生菌枯草芽胞桿菌SNUB19對多種植物病原真菌有抑制作用，抗菌譜較廣，同時也豐富了抗植物病原真菌生防菌株的篩選策略。枯草芽胞桿菌SNUB19能抑制尖孢鐮刀菌SNUF9的孢子萌發(fā)、使菌絲分支和菌絲數(shù)目減少，菌絲提前老化，提前形成孢子，少數(shù)菌絲膨大畸變，這些作用可能與絲氨酸蛋白酶作用于新形成的細胞結構成分有密切關系。

絲氨酸蛋白酶的應用非常廣泛，目前在抗根結線蟲方面，主要集中在基于宏基因組學(Metagenomic) 的絲氨酸蛋白酶基因的克隆、表達和抗線蟲活性研究，這代表了當前的研究方向[13-15]。由于工程菌的安全認證嚴格且時間較長，而根結線蟲的危害日益嚴重，加之化學防治對土壤和農(nóng)產(chǎn)品的殘留受到人們的關注，篩選對人和環(huán)境安全的抗根結線蟲微生物用于生物防治，是一項非常迫切的工作。淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)是目前防治根結線蟲的重要生防真菌[16]，該菌能產(chǎn)生幾丁質酶和絲氨酸蛋白酶,并通過這兩種酶的作用破壞根結線蟲的卵殼,菌絲侵入蟲卵并在卵內寄生。本實驗室曾篩選到產(chǎn)幾丁質酶的枯草芽胞桿菌2-3-2，對南方根結線蟲有較強的殺蟲作用[17]，產(chǎn)絲氨酸蛋白酶的枯草芽胞桿菌SNUB19不僅對南方根結線蟲2齡幼蟲有較強的殺蟲活性，在抗蟲實驗中，也發(fā)現(xiàn)該菌株能降低南方根結線蟲蟲卵的孵化率。枯草芽胞桿菌2-3-2和枯草芽胞桿菌SNUB19同時使用有無協(xié)同作用，還有待研究。

已有的研究表明，土傳真菌病害與根結線蟲危害常常同時發(fā)生且相互影響導致危害加重[18]。產(chǎn)絲氨酸蛋白酶的枯草芽胞桿菌SNUB19，對多種植物病原真菌有抑制作用，同時對南方根結線蟲也有較強的殺蟲活性，顯示該菌株有重要的應用前景。

4結論

從多年連作大棚栽培的番茄根際土壤中分離獲得的芽胞桿菌(Bacillussp.)SNUB19，能產(chǎn)生堿性蛋白酶，該酶以絲氨酸蛋白酶的特殊底物BApNA為底物時，受特異性抑制劑PMSF的抑制率高達91.2%，確認SNUB19為絲氨酸蛋白酶產(chǎn)生菌。通過形態(tài)學觀察、生理生化實驗和16s rDNA序列分析，SNUB19鑒定為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。SNUB19的發(fā)酵上清液對玉米大斑病菌PF3、番茄灰霉病菌PF4、葡萄炭疽病菌PF5和辣椒炭疽病菌PF6等植物病原真菌有顯著的抑制作用，可抑制尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)、菌絲生長，對南方根結線蟲2齡幼蟲也有較強的殺蟲效應。枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)SNUB19是一株具有抗植物病原真菌和殺根結線蟲雙重功效的生防菌株，有重要的應用價值。

致謝：本文抗線蟲實驗在中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所完成，茆振川老師和凌鍵老師給予熱情幫助和指導，特表示感謝！

參考文獻：

[1] TARIQ M,MUHAMMAD A H,MUHAMMAD Z K, et al.Evaluation of resistance to root-knot nematode(Meloidogyne incognita)in okra cultivars[J].Crop Protection, 2014,56:25-30.

[2] 席先梅，張慶萍，白全江.內蒙古設施蔬菜根結線蟲發(fā)生及危害與防治策略[J].內蒙古農(nóng)業(yè)科技,2011,6:82-83.

[3] 李世清，廖世東，高衛(wèi)東.我國農(nóng)林園藝作物土傳病害發(fā)生和防治現(xiàn)狀及對策分析[J].中國生物防治學報,2011,27(4):433-440.

[4] HANSEUNG J,GUNCHUN P, KYUNGMI K, et al.Novel alkaline protease from the polycheta,Periserrulaleucophryna:purification and characterization[J].Process Biochemistry,2001,36:893-900.

[5] 袁洪水，張紅麗，辛欣,等.BacillussubtilisZ-3菌株纖溶酶的分離純化研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報，2010,33(6):63-68.

[6] FERNANDO W G D, NAKKEERAN S, ZHANG Y, et al. Biologicalcontrol of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary by Pseudo-monasand Bacillus species on canola petals[J].Crop Protection, 2007, 26:100-107.

[7] GEREMIA R A, GOLDMAN G H, JACOBS D, et al. Molecular characterization of the proteinase-encoding gene, Prb1, related to mycoparasitism byTrichodermaharzianum[J].Molecular Microbiology, 1993, 8: 603-613.

[8] 沈萍,范秀容,李廣武.微生物學實驗[M].3版.北京:高等教育出版社,1999:214-215.

[9] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京: 科學出版社, 2001: 353-398.

[10] BUCHANAN R E，GIBBENS N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組,譯.北京：科學出版社，1984:729-756.

[11] 陶樹興，徐珊娜，徐珊,等.枯草芽胞桿菌SNUB16的抗真菌作用研究[J].植物保護，2010,36(5):70-75.

[12] 李晶,楊謙.生防枯草芽胞桿菌的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2008,36(1):106-111,132.

[13] 蘆曉飛.西藏米拉山高寒草甸土壤微生物多樣性研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2009:77-87.

[14] FLORES A, CHET I,HERRERA E A. Improved biocontrol activity ofTrichodermaharzianumby over-expression of the proteinase-encoding gene Prb1[J]. Current Genetics, 1997, 31: 30~37.

[15] ZHAO M L,MO M H, ZHANG K Q. Characterization of a neutral serine proteaseand its full-length cDNA from the nematode-trapping fungusArthrobotrysoligospora[J]. Mycologia, 2004, 96:16-22.

[16] 王波,李紅梅,王碧,等.淡紫擬青霉與放線菌代謝物復配對南方根結線蟲的防治[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報,2009,32(1):55-60.

[17] 陶樹興，張娟妮，郭賢,等.枯草芽胞桿菌2-3-2的抗線蟲作用和產(chǎn)酶條件與酶特性[J].陜西師范大學學報(自然科學版)，2013,41(3)：45-49.

[18] 李世東，繆作青，高衛(wèi)東. 我國農(nóng)林園藝作物土傳病害發(fā)生和防治現(xiàn)狀及對策分析[J].中國生物防治學報,2011,27(4):433-440.

〔責任編輯王勇〕

第一作者：李武斌，男，講師，博士研究生，主要研究方向為人文與城市地理。E-mail:liwubin2000@sina.com

Identification and biocontrol effect of a novel bacillus with producing serine protease

TANG Na1, TAO Shuxing1*, LIANG Jian1, FENG Xiaolei1,

HU Yinhong2， XU Zhenzhen1， XIONG Ping1

(1 School of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi′an 710119, Shaanxi, China；

2 Weinan Delong Biotech Co., Ltd.，Weinan 714000， Shaanxi, China )

Abstract:In order to select bacteria with producing serine protease for biological control, BApNA, the particular substrate of serine protease and selective inhibitor PMSF were used to confirm serine protease productivity. Morphological characteristics, physiological, biochemical characteristics and 16s rDNA comparison analysis were used for strain identification. Antagonistic method, inhibition zone method and liquid shake culture were introduced to observe the resistant effect of the bacteria on plant pathogenic fungi. 96-well plate assay was used to observe the resistant effect the bacteria on nematodes. SNUB19, a bacillus with producing serine protease was screened in the experiment and was identified as Bacillus subtilis. The fermentation broth of this strain is significantly resistant to plant pathogenic fungi and is relatively fatal to Meloidogyne incognita.

Keywords:serine protease; bacillus; strain classification; plant pathogenic fungi; Meloidogyne incognita

通信作者：*薛東前，男，教授，博士生導師。E-mail::xuedq@snnu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金 (41171142)；科技基礎性工作專項(2014FY210100)

收稿日期：2015-05-05

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2016.01.411

文章編號：1672-4291(2016)01-0087-09

中圖分類號：Q939.96

文獻標志碼：A