楊德全 ， 鞠厚斌 ， 劉 健 ， 葛菲菲 ， 李 鑫 ， 王 建 ， 楊顯超 ， 鄧 波 ， 葛 杰 ， 周錦萍

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心， 上海閔行201103)

用于病毒高通量測序樣品前處理及核酸擴增方案概述

楊德全 ， 鞠厚斌 ， 劉 健 ， 葛菲菲 ， 李 鑫 ， 王 建 ， 楊顯超 ， 鄧 波 ， 葛 杰 ， 周錦萍

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心， 上海閔行201103)

隨著測序技術(shù)水平的改進，測序通量的不斷提高，高通量測序技術(shù)得到迅猛的發(fā)展與普及，其在病毒學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛。通常，有效的降低宿主細胞和其他微生物基因的干擾并提高病毒核酸的豐度是鑒別病毒的重要前提，分離、擴增、獲取目的基因的序列則是鑒別病毒的關(guān)鍵。然而，臨床上獲得的樣品中病毒含量一般較低，從少量高度復(fù)雜的臨床樣品中發(fā)現(xiàn)目的序列如同“大海撈針”，因此，如何特異性的放大樣品中的病毒含量顯得至關(guān)重要。本文就高通量測序技術(shù)中一些常用的從未經(jīng)培養(yǎng)的原始樣品中獲取病毒核酸序列的技術(shù)方法作一綜述，以期使科研工作者更好的掌握高通量測序技術(shù)在病毒學(xué)中的應(yīng)用。

1 樣品前處理

臨床樣品復(fù)雜多樣，不僅含有大量的宿主基因，還混雜有細菌等其他微生物。它們產(chǎn)生的序列往往“淹沒”了低豐度的病毒序列，因此，樣品前處理非常關(guān)鍵，有必要采取措施減少無關(guān)序列的干擾，同時進一步富集病毒。

1.1 樣品類型 液體類樣品，包括血液、血清、腦脊液、精液等，正常情況下病原菌極少，但會有少量宿主核酸的干擾，尤其是新鮮的樣品，宿主gDNA和rRNA等背景核酸含量較低，可以直接用于建庫測序[1]。

組織類樣品，包括心臟、肝臟、肺臟等組織，由于有大量宿主的核酸干擾，測序前需要去掉宿主gDNA和rRNA等背景核酸。

拭子類樣品，包括咽拭子、鼻拭子、肛拭子等，不但有病原菌，還存在大量正常寄生菌群，核酸背景復(fù)雜。

環(huán)境類樣品，包括糞便、水、土壤等，含有的微生物種類和數(shù)量很多，近些年來，通過病毒宏基因組發(fā)現(xiàn)了大量已知和未知的病毒。

1.2 背景物質(zhì)的去除 由于病毒顆粒遠遠小于細菌和其他細胞，可以通過離心、濾器過濾等物理方法去除樣品中的細胞、細胞碎片及細菌等大顆粒物質(zhì)[2]。

如何有效地去除宿主核酸，提高病毒核酸的豐度是國際上公認的技術(shù)難點和關(guān)鍵點[3]。通常，向樣品中加入核酸酶不但能降解宿主的背景核酸，同時也能降解游離的病原體核酸。由于大部分病毒核酸一般有衣殼包裹，存在于病毒顆粒內(nèi)，可以抵抗核酸酶的作用[1]。因此，可用DNaseⅠ降解游離的宿主gDNA，加入RNase A降解游離的宿主rRNA。

1.3 樣品富集與濃縮 由于病毒顆粒具有一定的密度，可以用超速離心處理樣品[4]，提高病毒的濃度和純度，然后提取病毒核酸。目前，一般多采用截留分子量為 100 kD 的濃縮膜或超濾管對樣品進行濃縮。國內(nèi)外學(xué)者[5-6]在高通量測序時采用該方法均獲得了良好的效果。

具體試驗時，可有選擇的將上述方法結(jié)合使用。Allander T等[4]對呼吸道樣品處理時，將超速離心、過濾和DNaseⅠ消化相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了人細小病毒。研究發(fā)現(xiàn)，離心、過濾、DNase/RNase 酶解三步法對樣品中病毒核酸豐度有顯著提升作用[7]。此外，可運用SYBR金染色法實時監(jiān)測處理樣品中病毒顆粒的數(shù)量[6]。

2 核酸擴增方案

目前，市場上競相推出了針對低濃度樣品的文庫制備試劑盒，但對于更低濃度的樣品，現(xiàn)有的低濃度建庫試劑盒顯得無能為力。因此，如何能夠特異性地放大樣品中的病毒含量，滿足高通量測序需求，變得至關(guān)重要。下面介紹幾種常用于二代測序低濃度樣品的非特異性擴增方法。

2.1 不依賴序列的單引物擴增 (Sequence independent single primer amplification,SISPA) SISPA技術(shù)于1991年建立，其方法需要在DNA模板鈍末端連接一非對稱引物，經(jīng)若干循環(huán)的變性、退火和延伸后，模板的數(shù)量得到擴增，后經(jīng)克隆、測序、分析得到基因序列[8]。國內(nèi)外研究者[4,9-10]采用SISPA技術(shù)測定了未知DNA及RNA病毒的序列。國外學(xué)者們應(yīng)用DNase-SISPA從臨床樣品中鑒定出牛和人的新病毒[4,9,11]。Djikeng A等[2]在此基礎(chǔ)上進行了改進，將RNase酶處理加入到SISPA技術(shù)的程序中，以清除背景RNA的污染。針對部分有poly (A)尾的病毒，在反轉(zhuǎn)錄過程中采用帶標簽序列的隨機引物(FR26RV-N:5-'GCCGGAGCTCTGCAGATATCNNNNNN-3')及連接 polyT 的引物(FR40RV-T:5-'GC GGAGCTCTGC AGATATCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')以增加-3’端的覆蓋率。

隨著二代測序的普及，經(jīng)過SISPA獲得的擴增子可以直接深度測序。利用DNase SISPA-NGS技術(shù)從比利時牛腦組織和組織培養(yǎng)物中鑒定出不同于2011年首次在德國流行的施馬倫貝格病毒[12]。有學(xué)者用SISPA結(jié)合二代測序技術(shù)，對一個病毒的單斑或低至10 pg的DNA模板進行測序，獲得了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，直接用于病毒基因組全長的從頭拼接[13]。

2.2 VIDISCA技術(shù)(Virus discovery cDNA-amplified fragment length polymorphism,VIDISCA) VIDISCA技術(shù)，是一種基于cDNA擴增片段長度多態(tài)性的方法，是SISPA的一種衍生方法，利用該方法于2004年成功獲得了一種新的人冠狀病毒HCoV-NL63[11]核酸。與SISPA不同的是，先用兩種不同的限制性內(nèi)切酶切割DNA，與之對應(yīng)的兩種adaptor相連接，后與adaptor序列互補的兩個引物進行第一輪PCR擴增；第二輪擴增時，將第一輪兩個引物的-3’端分別向前延伸一個堿基(A或T或G或C)，這樣就會產(chǎn)生16種引物組合，大大提高VIDISCA的敏感性。此后，應(yīng)用該技術(shù)成功的鑒定出人雙?？刹《?型[14]和5型、6型[15]。經(jīng)過VIDISCA技術(shù)獲得的擴增子也可以直接深度測序。近幾年，利用VIDISCA-454技術(shù)，在人[16]和動物[17]身上發(fā)現(xiàn)了許多新病毒。

2.3 隨機PCR (random-PCR,rPCR) rPCR關(guān)鍵在于其特殊的引物設(shè)計，在隨機引物的5-’端加上一段通用序列，內(nèi)含一個限制性酶切位點便于后續(xù)的克隆，用此引物進行第一輪擴增，第二輪引物則使用與通用序列互補的引物。與SISPA不同的是，不用連接接頭，這種方法可提高反應(yīng)的效率，因此比SISPA更高效。rPCR可用于檢測DNA或RNA病毒。2004年發(fā)現(xiàn)了新型冠狀病毒HCoV-NL[18]；Kapoor A[19]利用這種方法發(fā)現(xiàn)了博卡病毒2型。將rPCR與二代測序技術(shù)相結(jié)合，Bodewes R[20]等鑒定出犬博卡病毒2型。

2.4 多重置換擴增(Multiple displacement amplification,MDA) MDA是一種等溫擴增技術(shù)，利用隨機的6堿基引物在多位點和模板鏈結(jié)合，接著利用phi29DNA聚合酶很強的模板結(jié)合和置換能力實現(xiàn)對全基因組的擴增。該技術(shù)可擴增一些極低含量的樣品，也可用于擴增不同環(huán)境樣品中的病原體，如人類糞便中的病毒[21]。MDA 法是目前公認應(yīng)用最廣泛的全基因組擴增方法，操作簡單，對實驗儀器要求低，且使用非預(yù)變性的模板時也可取得良好的效果。目前針對該方法開發(fā)的產(chǎn)品較為成熟，具有代表性的為Qiagen 公司的REPLI-g 系列全擴增試劑盒和GE 公司的GenomiPhi系列全擴增試劑盒。

上述擴增方法均不依賴于病毒的核酸序列信息，且可對低濃度樣品高效放大，因此，在病毒核酸信息未知的情況下，可對臨床樣品進行高通量測序。由于上述很多方法的擴增產(chǎn)物并不是原始樣品中所有組成部分的等比例放大，或多或少會產(chǎn)生一些偏倚，應(yīng)避免過度擴增，盡量保持樣品中核酸的多樣性。上述方法各有自己的優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)樣品的具體情況及實驗中遇到的問題進行調(diào)整、優(yōu)化或聯(lián)合應(yīng)用。

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2016-05-03

上海市市級農(nóng)口系統(tǒng)青年人才成長計劃項目[滬農(nóng)青字(2015)第 2-6號]

楊德全(1983-)，男，獸醫(yī)師，碩士，主要從事動物病毒病防控工作，E-mail:dequan_yang@126.com

周錦萍，E-mail:shzjpvet@163.com

S855.3

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文章編號：0529-6005(2016)12-0115-02