李 蘭 ， 鄭其升 ， 付言峰 ， 肖希龍 ， 侯繼波

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所 ， 江蘇南京210014 ； 2.國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心 ，江蘇南京210014 ； 3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京海淀100193)

幾種膠原樣凝集素的生物學特性及其抗病原微生物的作用

李 蘭1，2， 鄭其升1，2， 付言峰1， 肖希龍3， 侯繼波1，2

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所 ， 江蘇南京210014 ； 2.國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心 ，江蘇南京210014 ； 3.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京海淀100193)

1 膠原樣凝集素概況

膠原樣凝集素屬于脊椎動物C-型凝集素超家族，具有相似的分子結(jié)構(gòu)，每個單體由N末端區(qū)域、膠原樣區(qū)域(CollagenLikeRegion，CLR)、起連接作用的莖區(qū)和碳水化合物識別區(qū)域(Carbo.hydrateRecognitionDomain，CRD)等4個結(jié)構(gòu)域組成[1]，單體之間形成同源三聚體，三聚體單元會進一步組合成為多聚體形式，不同的膠原樣凝集素其三聚體單元數(shù)目是不同的。凝集素自發(fā)現(xiàn)至今逐漸引起各國科學家的關(guān)注，其CRD結(jié)構(gòu)域已成為一個研究熱點，化學家著眼于其糖識別的分子機制，免疫學家則集中于CRD的天然免疫功能，如調(diào)理吞噬、補體激活及炎癥反應(yīng)等[2]，近幾年越來越多的研究證明，凝集素還具有中和病原微生物包括病毒、細菌和真菌的生物學功能[3-6]。

關(guān)于凝集素抗微生物的研究，在人醫(yī)領(lǐng)域研究較多，而在獸醫(yī)領(lǐng)域研究相對較少。大量的臨床和動物模型試驗表明甘露聚糖結(jié)合凝集素(MBL)、肺表面活性蛋白A、D(SP-A、D)或纖維膠凝蛋白(Ficolin)缺乏會增加機體對病原微生物的感染，利用基因敲除的方法構(gòu)建缺失上述膠原凝集素的小鼠模型是研究凝集素在體內(nèi)發(fā)揮作用的有效方法，如缺失1種或2種MBL的小鼠感染金黃色葡萄球菌，以野生型小鼠作為對照，結(jié)果顯示，感染48h，缺失MBL的小鼠全部死亡，而野生型小鼠有60%的存活率[7]，另外基因敲除鼠給予重組表達的人MBL，其存活率與野生型小鼠持平；缺失Ficolin A、Ficolin B和同時缺失兩種Ficolin的小鼠感染肺炎鏈球菌，結(jié)果顯示，其存活率顯著降低[8]，以上充分證明了MBL等凝集素在機體抵御病原微生物的重要作用。

本文將介紹甘露聚糖結(jié)合凝集素、肺表面活性蛋白A、D(SP-A、D)和纖維膠凝蛋白等脊椎動物膠原樣凝集素的中和微生物作用及其可能的作用機制，為抗微生物藥物的研發(fā)提供一種新的思路及方向。

2 中和微生物作用

2.1 MBL 有關(guān)人MBL的研究比較深入，MBL能夠中和流感病毒、胸膜肺炎放線桿菌、埃博拉病毒、HIV、立百病毒等。Kase等[9]于1999年報道了人MBL能夠直接抑制流感病毒的感染，研究采用蝕斑減少試驗評價了用兩種不同方法制備的人MBL中和流感病毒的能力，結(jié)果顯示，從血清中提取的MBL和CHO細胞表達的MBL均能夠顯著降低流感病毒在MDCK細胞上的感染，0.125 μg/mLMBL抑制率達到50%，0.25 μg/mLMBL抑制率達到90%，1.0 μg/mL MBL抑制率甚至達到100%。

哈佛大學醫(yī)學院一研究團隊[7]對MBL抗微生物作用進行了大量的研究，并且重組MBL已經(jīng)被開發(fā)出來且于2006年已經(jīng)通過Ⅰ期臨床試驗，但后來的研究發(fā)現(xiàn)，額外補充的MBL能夠在體內(nèi)引起一種副反應(yīng)，即干擾體內(nèi)血凝系統(tǒng)，臨床試驗被迫停止。近幾年，該研究團隊通過結(jié)構(gòu)改造獲得了一些MBL的衍生物，具有MBL的活性同時不會干擾血凝系統(tǒng)。嵌合重組凝集素4(RCL4)用L-Ficolin的膠原樣區(qū)域代替MBL的膠原樣區(qū)域，而獲得，在抗感染方面(流感病毒、埃博拉病毒和立百病毒)有更優(yōu)越的表現(xiàn)，在體內(nèi)激活凝集素的作用是MBL的10倍以上，同時激活類凝血酶活性的副作用大大減小。

2.2 SP-A、D 現(xiàn)有研究顯示SP-A、D能夠中和流感病毒，能夠與不同亞型的流感病毒結(jié)合，且SP-D抗流感病毒作用表現(xiàn)的更優(yōu)越[5，10-11]。Marine等[5]研究了豬SP-D作為一種抗流感病毒藥物的潛在應(yīng)用價值，血凝抑制試驗評價了包括H1N1、H3N2、H5N1等在內(nèi)的30株流感病毒與豬SP-D的作用，結(jié)果顯示，SP-D以不同的親和力與不同亞型的流感病毒結(jié)合，進一步研究顯示，豬SP-D能夠抑制流感A病毒(IAV)感染MDCK細胞，具有中和IAV的作用；Benne等[12]發(fā)現(xiàn)，人SP-A能夠直接作用于H1N1和H3N2亞型流感病毒；張峰等[4]研究發(fā)現(xiàn)，HEK 293T細胞表達的重組豬SP-A蛋白能夠與PRRSV進行結(jié)合，且能夠降低在Marc-145細胞和豬肺泡巨噬細胞的感染，表明豬SP-A具有抗PRRSV的活性；另有研究顯示，SP-A能夠抵抗1型單純皰疹病毒、肺炎肺囊蟲、真菌煙曲霉分生孢子、呼吸道合胞體病毒、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌、大腸桿菌J5、結(jié)核分枝桿菌、肺炎鏈球菌、A族和B族鏈球菌等的感染；SP-D也有相似的抗微生物譜。

2.3 Ficolin Ficolin對病原微生物的直接作用也有報道，Keirstead等[3]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)icolin及重組Ficolin能夠與PRRSV結(jié)合，并且采用蝕斑減少試驗比較了從豬血清中提取的Ficolin及在細胞中表達的Ficolin中和PRRSV的作用，結(jié)果顯示，兩者都能夠中和PRRSV，不過前者作用更強，還進一步發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)icolin能夠與沙門菌和胸膜肺炎放線桿菌結(jié)合；Michalski等于2015年首次證實，人H-Ficolin能夠抵抗蜂房哈夫尼菌的感染；還有研究顯示，人L-Ficolin能夠與A型流感病毒結(jié)合，進而抑制其進入MDCK細胞，發(fā)揮直接抗病毒作用，另外Ficolin還能夠與大腸桿菌、沙門菌、福氏志賀菌、粘質(zhì)沙雷菌和銅綠假單胞菌等等革蘭陰性菌結(jié)合，且能夠與金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鏈球菌革蘭陽性菌結(jié)合。

3 抗微生物作用機制

多個研究結(jié)果表明，凝集素是通過阻斷病毒的吸附或細菌等粘附而發(fā)揮作用的，尤其關(guān)于抗病毒的作用機制研究較多。Keyaerts等[6]發(fā)現(xiàn)HHA，一種來源于植物的甘露糖凝集素，主要作用于病毒的吸附階段，當病毒與細胞在4 ℃孵育時，病毒僅發(fā)生吸附作用而不能內(nèi)化進細胞，HHA的EC50為 2.5 μg/mL，但當病毒與細胞在37 ℃孵育時，病毒即發(fā)生吸附作用又能內(nèi)化進入細胞，此時HHA的EC50為5.2 μg/mL；另有Marine等[5]人的研究成果顯示，重組表達的SP-D能夠100%阻斷H1N1和H3N2的吸附，但該研究并沒有進一步研究SP-D對病毒內(nèi)化的影響，也許認為SP-D能夠完全阻斷病毒的吸附，再進行病毒內(nèi)化試驗已經(jīng)沒有意義；還有很多文獻報道了通過阻斷HIV和HCV進入靶細胞而發(fā)生抗病毒作用的多種凝集素，如來源于哺乳動物的MBL、DC-SIGN、SP-D等、來源于原核生物的Scytovirin、來源于海洋珊瑚的Gerardia savaglia、種類豐富的植物凝集素HHA和GNA、來源于無脊椎動物的Chaetopterus variopedatus[13]。

大量研究資料顯示，微生物表面糖基在病毒吸附的過程中發(fā)揮重要作用。如HIV的gp120和gp40糖蛋白[14]、HCV的E1和E2糖蛋白[15]、IAV的HA和NA糖蛋白[14]、SARS-CoV的S和ACE2糖蛋白等[14，16]。SP-A可與呼吸道合胞病毒表面的F(融合)糖蛋白結(jié)合，從而抑制F蛋白的融合功能，進而抑制病毒入侵[17]其次：Marine研究結(jié)果證明，SP-D能夠和流感病，毒表面的HA相互作用，阻止病毒附著到靶細胞而發(fā)揮病毒中和的作用[5]；此外，一些來源不同的凝集素如SP-D、植物凝集素已被證實可以與HIV表面的糖蛋白gp120和gp40結(jié)合，與凝集素結(jié)合后的HIV可能由于空間位阻的原因不能與受體蛋白CD4CXCR4或CCR5結(jié)合，從而阻斷HIV進入靶細胞而降低感染率[1，18]，綜上所述，凝集素很可能通過與病原微生物表面的糖蛋白中的一種或幾種結(jié)合，抑制了病毒靶細胞上的受體的識別及結(jié)合，從而阻斷了病毒的吸附過程。

4 結(jié)語

以微生物入侵作為作用靶點的抗微生物藥物有其獨特的優(yōu)勢，不僅可以阻斷健康細胞的感染，還能阻斷感染細胞向健康細胞傳播病毒的途徑[13]，所以凝集素在人醫(yī)領(lǐng)域已被列為抗HIV的潛在藥物。同時與普通病毒入侵抑制劑相比，凝集素還能夠通過自身受體阻止HIV病毒向樹突狀細胞及巨噬細胞的傳播[19-20]，進一步降低HIV在機體內(nèi)的傳播機會，因此凝集素作為一類新型抗微生物藥物越來越受到藥物開發(fā)者的青睞。

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2016-4-19

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(2013-03046)

李蘭(1983-)，女，博士生，主要從事新獸藥研究工作，E-mail：lanli99@foxmail.com

肖希龍，E-mail：xiaoxl@cau.edu.cn；侯繼波，E-mail：houjibo@jaas.ac.cn

S852.65

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0529-6005(2016)11-0076-03