董妙音，王曙陽(yáng)*，王雨辰，許富強(qiáng)，李文建，陳積紅，劉敬，胡偉

（1.中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所，甘肅蘭州730000；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100049；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；4.甘肅微生物育種實(shí)驗(yàn)室，甘肅武威733001；5.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

絲狀真菌在纖維素酶合成過程中碳源代謝調(diào)控的研究進(jìn)展

董妙音1,2，王曙陽(yáng)1,5*，王雨辰1,3，許富強(qiáng)1,2，李文建1,4，陳積紅1,4，劉敬1，胡偉1

（1.中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所，甘肅蘭州730000；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100049；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；4.甘肅微生物育種實(shí)驗(yàn)室，甘肅武威733001；5.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

絲狀真菌可以分泌大量纖維素酶并能有效地降解纖維素底物。在纖維素酶的合成過程中，碳源對(duì)產(chǎn)酶微生物有著不可替代的作用，然而對(duì)于微生物碳源響應(yīng)及代謝調(diào)控有關(guān)的機(jī)理仍不是很清楚，從而制約了纖維素酶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，本文綜述了絲狀真菌中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對(duì)纖維素酶合成過程的影響，探討了真菌在纖維素酶表達(dá)過程中對(duì)碳源代謝的調(diào)控，包括對(duì)碳源的響應(yīng)、碳源對(duì)產(chǎn)酶過程的誘導(dǎo)阻遏，并展望了纖維素酶的研究方向。

絲狀真菌；纖維素酶；碳源代謝；調(diào)控

纖維素是自然界中存在的最多的一類可再生生物質(zhì)資源，全世界農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量超過20億t，而其中將近20%以燒荒的形式燒掉，這不僅造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題，對(duì)資源也是一種嚴(yán)重的浪費(fèi)[1-2]。纖維素酶是降解纖維素最有效的生物催化酶，可以使纖維素分解生成葡萄糖的一組酶的總稱，在輕工業(yè)如造紙、食品、飼料、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用正日益廣泛。不僅能夠緩解能源危機(jī)，而且還可以保護(hù)環(huán)境，促進(jìn)全球經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。

分泌纖維素酶的微生物在自然界中分布廣泛，一般用于工業(yè)化生產(chǎn)的主要為絲狀真菌，包括曲霉屬（Aspergillus sp.）、木霉屬（Ttichodermasp.）、青霉屬（Penicillumsp.）等，真菌產(chǎn)纖維素酶的主要特點(diǎn)為酶系全、產(chǎn)量高，并能分泌到細(xì)胞外[3]。

碳源的作用對(duì)于產(chǎn)酶微生物來說不僅是作為重要的能量供應(yīng)，還是生物體代謝的底物，其存在種類和數(shù)量對(duì)產(chǎn)酶過程而言是極其重要的。此外，碳源物質(zhì)還在微生物的許多生理代謝過程中扮演著調(diào)節(jié)因子的角色，而且存在著比較復(fù)雜的碳源感應(yīng)系統(tǒng)，在產(chǎn)纖維素酶的絲狀真菌中更是如此[4]。由于碳源的不同而誘導(dǎo)產(chǎn)生的纖維素酶的產(chǎn)量和種類之間也存在著很大的差異，許多產(chǎn)酶微生物對(duì)不同碳源響應(yīng)的差異可能是在進(jìn)化過程中對(duì)環(huán)境的適應(yīng)所形成的[5]。

真菌纖維素酶合成的誘導(dǎo)調(diào)控是其菌株自身為更好地適應(yīng)周圍環(huán)境、高效的獲取物質(zhì)和能量而進(jìn)行的一系列復(fù)雜有序的生理生化過程，其中所涉及的代謝層次和調(diào)控途徑復(fù)雜多樣，包括外界碳源信號(hào)的感應(yīng)和傳遞、纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平修飾等[6]。為了提高纖維素酶的產(chǎn)量的對(duì)纖維素底物的降解活性，國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者自20世紀(jì)60年代開始做了大量的纖維素酶的研究，對(duì)纖維素酶的生化性能、降解機(jī)制及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子鑒定等做了較為深入的系統(tǒng)研究。但是對(duì)于纖維素類誘導(dǎo)性碳源是如何誘導(dǎo)微生物合成大量的纖維素酶以及微生物是如何對(duì)外界環(huán)境中誘導(dǎo)性碳源進(jìn)行感應(yīng)的，其機(jī)制仍然不清楚。

本文綜述了國(guó)內(nèi)外關(guān)于絲狀真菌在產(chǎn)纖維素酶過程中關(guān)于碳源代謝的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控因子的調(diào)控，探討了真菌纖維素酶表達(dá)過程中碳源代謝調(diào)控的研究現(xiàn)狀，包括對(duì)外界環(huán)境中碳源的感應(yīng)、碳源對(duì)產(chǎn)酶過程的誘導(dǎo)阻遏等，以期為纖維素酶生產(chǎn)的進(jìn)一步深入研究、理性改造工業(yè)產(chǎn)酶菌株提供新的參考思路。

1　絲狀真菌纖維素酶在表達(dá)過程中對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

1.1調(diào)控因子對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

在真菌中，纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式復(fù)雜多樣，特別是在調(diào)控因子的作用下高效有序的完成纖維素酶基因的精確表達(dá)。

作為真核的產(chǎn)酶微生物，在纖維素降解酶基因中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾類具有重要作用的調(diào)控元件，包括轉(zhuǎn)錄激活因子（XlnR、Xyr1、AceII等），碳源代謝抑制因子（AceI、CreA/Cre1等）。而研究較多的是轉(zhuǎn)錄激活因子XlnR，最初是在黑曲霉中分離得到的，其DNA結(jié)合序列為5'-GGCTAAA-3'，也是絲狀真菌中發(fā)現(xiàn)的可以同時(shí)調(diào)控木聚糖酶和纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子[7]。有學(xué)者在研究D-木糖對(duì)纖維素酶的誘導(dǎo)效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，D-木糖首先引起XlnR的磷酸化[8]，然后進(jìn)一步調(diào)控D-木糖對(duì)半纖維素酶的誘導(dǎo)表達(dá)。

作為轉(zhuǎn)錄激活因子XlnR的同源蛋白Xyr1，在瑞氏木霉中作為纖維素酶和半纖維素酶基因主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，其缺失可以使所有的誘導(dǎo)物對(duì)纖維素酶和半纖維素酶的誘導(dǎo)表達(dá)喪失活性。Xyr1具有典型的鋅指類結(jié)構(gòu)，它與啟動(dòng)子上的靶序列GGC（T/A）3進(jìn)行結(jié)合而行使功能[9]。AceII也是一個(gè)鋅指類結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠體外結(jié)合cbh1啟動(dòng)子的GGCTAATAA序列[10]。Xyr1與AceII具有相同的結(jié)合位點(diǎn)，所以可以推測(cè)Ace2與Xyr1之間可能存在某種相互作用。CreA是絲狀真菌中普遍存在的介導(dǎo)碳源降解物阻遏的含C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。CreA/Cre1基因的突變會(huì)使菌株喪失葡萄糖阻遏效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在里氏木霉抗葡萄糖阻遏突變株Rut-C30中，Cre1基因基本丟失，只剩一些片段，但是當(dāng)轉(zhuǎn)入全長(zhǎng)Cre1時(shí)，葡萄糖對(duì)纖維素酶表達(dá)的阻遏效應(yīng)又開始恢復(fù)[11]。

在大多數(shù)情況下，真菌內(nèi)存在的這些調(diào)控因子一般都不是單獨(dú)進(jìn)行調(diào)控，而是協(xié)同發(fā)揮作用，而且在進(jìn)行調(diào)控時(shí)，這些調(diào)控因子本身都需要進(jìn)行一些修飾，比如磷酸化、泛素化等而發(fā)揮作用。

2　絲狀真菌在纖維素酶表達(dá)過程中對(duì)碳源的代謝調(diào)控

絲狀真菌纖維素酶的誘導(dǎo)表達(dá)受碳源的嚴(yán)格調(diào)控，這不僅表現(xiàn)在不同碳源的誘導(dǎo)調(diào)控上，即使是同一碳源，對(duì)于不同種類的微生物，其調(diào)控和對(duì)碳源的感應(yīng)機(jī)制也存在著很大區(qū)別。

2.1絲狀真菌對(duì)外界環(huán)境中碳源信號(hào)的響應(yīng)

絲狀真菌對(duì)外界碳源的響應(yīng)，是碳源代謝調(diào)控的第一步，也是基礎(chǔ)代謝非常重要的組成部分。合成纖維素降解酶的絲狀真菌只有在纖維素基質(zhì)上生長(zhǎng)時(shí)，才進(jìn)行大量的纖維素酶合成并分泌到胞外。但是，這些微生物是如何感知外界纖維素碳源的存在，固體不溶性的纖維素分子是如何進(jìn)入胞內(nèi)來誘導(dǎo)纖維素酶基因表達(dá)的，其機(jī)理目前還有爭(zhēng)論。

目前人們普遍接收的觀點(diǎn)是由于基礎(chǔ)水平表達(dá)的纖維素酶對(duì)胞外的纖維素類物質(zhì)進(jìn)行初步地水解，生成具有誘導(dǎo)活性的寡糖小分子如纖維二糖，然后這些寡糖分子被一類膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)從而誘導(dǎo)纖維素酶基因的高效表達(dá)，以進(jìn)一步降解外界環(huán)境中的纖維素類底物[12]。這種最初的誘導(dǎo)性寡糖結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Cdt1、Cdt2是在粗糙脈孢菌中分離鑒定得到的。Cdt1和Cdt2都屬于主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS），具有典型的12個(gè)跨膜螺旋，且這兩個(gè)蛋白本身也具有較高的一致性[13]。ZNAMEROSKI E A等[14]在研究中對(duì)Cdt1和Cdt2進(jìn)行了點(diǎn)突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種點(diǎn)突變能有效地減弱對(duì)纖維二糖的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，但是突變株對(duì)胞外纖維二糖的響應(yīng)以及對(duì)纖維的水解活性卻沒有受太大影響，這說明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性可能與信號(hào)傳導(dǎo)方式和產(chǎn)酶的水解能力沒有明顯的相關(guān)性。到目前為止，已經(jīng)從其他菌株中也鑒定得到了這種寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如CdtC、CdtD、CdtG等，而且這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性對(duì)纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄有著重要的作用[15]。ZHANG W X等[16]在里氏木霉中分離得到了一種具有纖維二糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Stp1，發(fā)現(xiàn)Stp1是一個(gè)多功能的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且兼有葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性，緊接著對(duì)Stp1基因進(jìn)行敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Stp1的缺失影響了菌株再以纖維二糖為碳源的生長(zhǎng)狀況，同時(shí)也喪失了纖維二糖對(duì)纖維素酶的誘導(dǎo)作用。在整個(gè)碳源誘導(dǎo)過程中，這些纖維素等誘導(dǎo)物自身或其中間代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物作為真正的誘導(dǎo)物與載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，然后激活并傳遞纖維素酶表達(dá)信號(hào)，最終啟動(dòng)纖維素酶基因的高效表達(dá)[17]。

2.2纖維素酶誘導(dǎo)型碳源的調(diào)控

纖維素降解酶是一類誘導(dǎo)型酶，所以在纖維素酶合成分泌過程中，存在一定的誘導(dǎo)性碳源對(duì)于纖維素酶的高效合成分泌是必需的，同樣，這種碳源的存在也是影響纖維素酶產(chǎn)量和其水解效率的主要因素之一，而且不同的誘導(dǎo)性碳源對(duì)纖維素酶的誘導(dǎo)表達(dá)作用是不同的。當(dāng)外界環(huán)境中存在有纖維素類誘導(dǎo)性碳源時(shí)，這種碳源信號(hào)就會(huì)被產(chǎn)酶微生物所感應(yīng)，進(jìn)而使得細(xì)胞被這種信號(hào)所誘導(dǎo)而啟動(dòng)纖維素酶基因的高效表達(dá)。

纖維二糖是纖維素降解最主要的可溶性產(chǎn)物，研究表明其對(duì)多種真菌纖維素降解酶基因的表達(dá)具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)活性[18]。有學(xué)者研究表明在里氏木霉（Trichoderma reesei）的培養(yǎng)過程中當(dāng)有較低濃度的纖維二糖存在時(shí)，其可以通過一個(gè)載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞內(nèi)誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達(dá)，而且該載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)纖維二糖的轉(zhuǎn)運(yùn)活力要高于胞外β-葡萄糖苷酶對(duì)纖維二糖的降解活性[19]。這說明只有在低濃度的纖維二糖存在時(shí)，才能對(duì)纖維素酶基因的表達(dá)起誘導(dǎo)作用，因?yàn)闈舛容^高時(shí)，還受到胞外β-葡萄糖苷酶活性的影響。所以，纖維二糖對(duì)纖維素酶基因表達(dá)的調(diào)控作用取決于纖維二糖的轉(zhuǎn)運(yùn)活性與水解速度的之間的平衡[20]。

此外，槐糖也是一種很重要的誘導(dǎo)碳源，可誘導(dǎo)里氏木霉纖維素酶基因的大量表達(dá)?；碧潜徽J(rèn)為是將纖維素水解產(chǎn)物經(jīng)過一些內(nèi)切葡聚糖酶經(jīng)過轉(zhuǎn)糖基作用而形成的產(chǎn)物[21-22]。但是，有研究發(fā)現(xiàn)，槐糖的這種碳源誘導(dǎo)效應(yīng)對(duì)產(chǎn)酶菌株具有一定的特異性，如在黑曲霉（Aspergillus niger）中槐糖中并不能起誘導(dǎo)作用[23]，可能是由于黑曲霉（A.niger）較高的β-葡萄糖苷酶水解活性。但是在粗糙脈孢菌（N.crassa）即使將主要的β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行敲除，槐糖仍然不能誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達(dá)[24]。

在纖維素酶的誘導(dǎo)表達(dá)過程中，有些非纖維素來源的碳源也可以很好的誘導(dǎo)纖維素酶的高效表達(dá)，如乳糖。FANG X等[25]以乳糖作為誘導(dǎo)碳源進(jìn)行產(chǎn)酶研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)加入1%的乳糖后，纖維素酶表達(dá)能力大大提升。當(dāng)微生物生長(zhǎng)比較緩慢時(shí)，在培養(yǎng)基中添加半乳糖也可以誘導(dǎo)纖維素酶基因的表達(dá)[26]，添加乳糖對(duì)纖維素酶的誘導(dǎo)機(jī)制已經(jīng)經(jīng)歷了很長(zhǎng)一段時(shí)間的研究，包括乳糖的代謝途徑、胞內(nèi)乳糖的代謝組分析等，雖然發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)可能與纖維素酶誘導(dǎo)相關(guān)的寡聚糖，但是仍然沒有清楚的揭示乳糖對(duì)纖維素酶的誘導(dǎo)機(jī)制[27]。

2.3纖維素酶碳源代謝阻遏的調(diào)控

每一種纖維素酶的合成分泌受其作用的碳源代謝終產(chǎn)物的調(diào)控，當(dāng)碳源代謝的終產(chǎn)物累積達(dá)到一定的閾值時(shí)，細(xì)胞將會(huì)停止纖維素酶的繼續(xù)合成，而這種在纖維素酶合成過程中的碳源代謝終產(chǎn)物主要是葡萄糖[28]。葡萄糖作為公認(rèn)的在纖維素酶基因表達(dá)過程中抑制性的碳源，細(xì)胞優(yōu)先利用葡萄糖代謝產(chǎn)生的能量用于菌株的生長(zhǎng)繁殖而非用于纖維素酶誘導(dǎo)產(chǎn)生途徑。ILMEN M等[29]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)產(chǎn)酶微生物生長(zhǎng)在非誘導(dǎo)性碳源的培養(yǎng)基上時(shí)，利用印記雜交（Northern blotting）雜交里氏木霉（T.reesei）的RNA，但是并沒有檢測(cè)出cbh1的信號(hào)存在，但是當(dāng)葡萄糖耗盡時(shí)，在培養(yǎng)物中可以檢測(cè)到纖維素酶基因的表達(dá)。由此可見，在里氏木霉纖維素酶基因的表達(dá)過程中存在著復(fù)雜精細(xì)的碳源抑制調(diào)控機(jī)制。而大多數(shù)絲狀真菌纖維素酶合成過程中，這種碳源的優(yōu)先代謝阻遏作用就是通過一種阻遏蛋白Crel來實(shí)現(xiàn)的[30]。除此之外，在絲狀真菌中還發(fā)現(xiàn)幾類參與碳代謝阻遏蛋白Crel的同源蛋白，并且在里氏木霉和曲霉（Aspergillus）中可調(diào)控許多纖維素和半纖維素酶基因表達(dá)[31]。

3　展望

進(jìn)入21世紀(jì)，纖維素酶的研究將會(huì)有著巨大的市場(chǎng)潛力和工業(yè)前景，木質(zhì)纖維素作為地球上儲(chǔ)量豐富的可再生資源，將其轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖類，進(jìn)一步發(fā)酵生產(chǎn)乙醇等能源物質(zhì)或者其他化學(xué)產(chǎn)品已成為全球研究的熱點(diǎn)。但目前的研究還存在很多難題，主要表現(xiàn)在關(guān)于纖維素酶的誘導(dǎo)物和誘導(dǎo)機(jī)理的研究仍然沒有得出確切的結(jié)論；發(fā)酵所用的菌株生產(chǎn)效率低；酶系統(tǒng)中各組分的比例不均衡；下游分離工作繁瑣，導(dǎo)致纖維素酶的生產(chǎn)成本提高等，這極大地影響了纖維素酶在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

為更深入地研究絲狀真菌在纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)過程中對(duì)外界碳源的代謝調(diào)控機(jī)制，在將來的研究中，應(yīng)該充分運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)、分子生物學(xué)和基因工程等先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)，對(duì)纖維素酶誘導(dǎo)過程中所涉及的基因、調(diào)控因子及代謝通路進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，對(duì)基因調(diào)控模式進(jìn)行探索[32]，并逐步建立絲狀真菌在纖維素酶誘導(dǎo)合成過程中的調(diào)控模型，將有助于從分子水平上揭示絲狀真菌在產(chǎn)酶過程中對(duì)碳源代謝的調(diào)控機(jī)理，為進(jìn)一步發(fā)展纖維素酶產(chǎn)業(yè)提供強(qiáng)有力的理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

了解碳源代謝調(diào)控機(jī)制，可以利用遺傳改造手段設(shè)計(jì)和改造產(chǎn)纖維素酶的高產(chǎn)菌株。此外，還能有效地控制誘導(dǎo)碳源，這不僅能夠提高纖維素酶的產(chǎn)量，而且還能增加纖維素酶對(duì)纖維素底物的水解效率，還可有效地減緩代謝終產(chǎn)物對(duì)纖維素酶生產(chǎn)過程中的阻遏，滿足纖維素酶在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中的需求。隨著科技的進(jìn)步以及人們對(duì)纖維素酶研究的深入，相信在不久的將來，纖維素酶的應(yīng)用范圍會(huì)更加廣泛，對(duì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展發(fā)揮重要的積極作用。

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Research process of filamentous fungi on carbon source metabolism regulations during cellulase synthesis

DONG Miaoyin1,2,WANG Shuyang1,5*,WANG Yuchen1,3,XU Fuqiang1,2,LI Wenjian1,4,CHEN Jihong1,4,LIU Jing1,HU Wei1
(1.Institute of Modern Physics,Chinese Academy of Science,Lanzhou 730000,China; 2.College of life Science,University of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China; 3.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 700070,China; 4.Gansu Engineering Laboratory of Radiation Induced Mutation Breeding,Wuwei 733001,China; 5.School of Basic Medical Sciences,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China)

Filamentous fungi can secrete a large number of cellulase and can effectively degrade cellulose substrates.In the process of the cellulase synthesis,carbon sources play an irreplaceable role on enzyme-producing microorganism.But the mechanism of microbial carbon source response and metabolism regulation still not clear,which restricts the development of cellulase industry.Therefore,the effects of transcriptional regulation factors in filamentous fungi on cellulase synthesis were summarized,the fungi on carbon source metabolic regulation(including the carbon sources response and the abduction and repression of carbon sources on enzyme production process)in the process of the cellulase expression was discussed, and the research fields of cellulase were prospected.

filamentous fungi;cellulase;carbon source metabolism;regulations

Q939.97

0254-5071（2016）10-0001-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.001

2016-05-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.11305225）；中國(guó)科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃項(xiàng)目（KFJ-EW-STS-086）；西藏草業(yè)專項(xiàng)（Y106460XZO）

董妙音（1992-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镙椪沼N。

王曙陽(yáng)（1974-），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)檩椛渖飳W(xué)。