馮長梅楊 柳劉俊芬韓珂珂

肺炎支原體的實(shí)驗(yàn)室診斷

馮長梅1楊 柳1劉俊芬2韓珂珂1

肺炎支原體所引起的支原體肺炎臨床癥狀不典型，臨床診斷中實(shí)驗(yàn)室檢查對于確診具有重要意義。本文擬通過對以往資料的總結(jié)，分別就肺炎支原體的微生物檢驗(yàn)、免疫檢驗(yàn)和分子生物學(xué)檢驗(yàn)等方面比較肺炎支原體的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，以期為臨床早期、快速篩查病因，明確診斷提供幫助。

肺炎；支原體；實(shí)驗(yàn)室診斷

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是介于細(xì)菌和病毒之間，能獨(dú)立生活的最小微生物，隸屬于支原體屬（Mycoplasma），常與肺炎衣原體并稱。支原體沒有細(xì)胞壁，只有細(xì)胞膜，呈多形性，能利用葡萄糖和精氨酸作為能源，革蘭染色陰性，但不易著色，培養(yǎng)中呈典型“油煎蛋”樣菌落，菌落大小為15～300 μm［1］。肺炎支原體主要侵犯呼吸道，粘附于氣管、支氣管和細(xì)支氣管的上皮細(xì)胞上，有三分之一左右感染者可導(dǎo)致肺炎，近年來有報(bào)道稱6歲以下兒童支原體肺炎發(fā)病率有增高趨勢［2］。

兒童感染MP后臨床癥狀缺乏特異性，且由于MP的生物學(xué)特性使得實(shí)驗(yàn)室檢查在支原體肺炎疾病的診斷中發(fā)揮重要作用。本文總結(jié)了肺炎支原體在微生物檢驗(yàn)、免疫檢驗(yàn)和分子生物學(xué)檢驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室檢測方法在臨床應(yīng)用的特點(diǎn)，以期為臨床在支原體肺炎的實(shí)驗(yàn)室診斷中提供一點(diǎn)思路。

1　肺炎支原體的微生物檢驗(yàn)

MP典型的生長需要21 d或更長的時(shí)間，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)至少需要2 周，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用較多的為快速培養(yǎng)鑒定。此方法是以無菌棉拭子于患兒口腔等位置進(jìn)行采樣，然后將棉拭子置于肺炎支原體培養(yǎng)基中，也可采集痰液標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，依據(jù)培養(yǎng)基顏色的變化，確定是否有MP的生長。實(shí)驗(yàn)原理是將培養(yǎng)與生化反應(yīng)相結(jié)合，即利用MP分解葡萄糖產(chǎn)酸的能力使溶液pH值降低而變色，通過觀察培養(yǎng)基顏色的變化達(dá)到快速培養(yǎng)的目的；一些試劑廠家還將快速培養(yǎng)基與抗生素包被的試驗(yàn)板相結(jié)合進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，可明顯縮短報(bào)告發(fā)放的時(shí)間。此方法的局限性為當(dāng)患者標(biāo)本中同時(shí)存在能夠分解葡萄糖產(chǎn)酸的雜菌或存在對培養(yǎng)基中抗生素耐藥的細(xì)菌時(shí)會出現(xiàn)假陽性，故臨床應(yīng)用中不適合混合感染和長時(shí)間應(yīng)用抗生素的患者。趙洪波［3］等人以酶聯(lián)免疫吸附法（ELSLA）測定血中的MP-IgM抗體作為參照，將微生物快速培養(yǎng)法與之進(jìn)行比較獲得良好相關(guān)性，其檢測率在4～7歲患兒尤為突出。

2　肺炎支原體的免疫學(xué)檢驗(yàn)

人體感染MP后最早可在發(fā)病1周左右出現(xiàn)特異性IgM抗體，可持續(xù)存在3～6個(gè)月［4］。特異性抗體的檢測目前仍是臨床應(yīng)用最為廣泛的檢測方法。免疫學(xué)檢驗(yàn)在支原體感染診斷中可分為兩大方面：

2.1快速血清學(xué)檢測

主要檢測IgM類抗體，可分為膠體金免疫層析技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)兩大類。應(yīng)用膠體金包被的鼠抗人-IgM定性的檢測血清或血漿樣本中支原體IgM抗體為膠體金快速檢測的基本原理，臨床上由于其快速、簡便、成本低廉而應(yīng)用廣泛，但普遍存在特異性尚可，敏感性不高的特點(diǎn)，即只有患者體內(nèi)抗體濃度達(dá)到其最低檢測限時(shí)方可檢出，故在早期感染和混合感染時(shí)也存在檢出率不高的現(xiàn)象；更由于其無法量化，在臨床的應(yīng)用中受到限制。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)以MP特異性抗體作為目標(biāo)抗體的檢測技術(shù)，較膠體金檢測技術(shù)而言提高了實(shí)驗(yàn)室檢測特異性，但卻存在操作繁瑣復(fù)雜，干擾因素較多的特點(diǎn)，甚至不能排除其他IgM抗體與特異性抗體的結(jié)合而產(chǎn)生的干擾現(xiàn)象。王孟燕［5］等人的研究中表明，以微生物快速培養(yǎng)方法作為對照，快速血清學(xué)檢驗(yàn)在一些地區(qū)的應(yīng)用中陽性檢出率增高，但也有人建議將兩種方法聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行檢測［6］。

2.2免疫熒光檢測

免疫熒光檢測技術(shù)也稱為熒光抗體技術(shù)，其基本原理是采用熒光素標(biāo)記抗抗體與標(biāo)本中抗體相結(jié)合，洗滌去除游離熒光二抗后，于熒光顯微鏡下觀察抗原抗體復(fù)合物的形成進(jìn)行定性和滴度的測定。此項(xiàng)檢測技術(shù)可分為直接法和間法兩種，間接免疫熒光技術(shù)相比直接法敏感性可提高5～10倍，應(yīng)用在MP檢測中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。首先，相較于膠體金和酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)而言，熒光免疫技術(shù)的檢測靈敏度更高；其次，在間接法檢測特異性IgM抗體之前，采用免疫吸附的方法去除非特異性IgM抗體和IgG抗體可有效的防止樣本中IgM類類風(fēng)濕因子引起的假陽性，更可防止特異性IgG與IgM競爭結(jié)合而引起的假陰性，這一特點(diǎn)使其應(yīng)用在MP感染早期、混合感染、免疫功能尚未發(fā)育完全的兒童和大量使用抗生素及免疫缺陷的患者尤為重要；此外，熒光免疫檢測還可同時(shí)檢測MP的特異性IgG抗體，區(qū)別首次感染和既往感染。一些試劑廠家更將其他病原體的檢測整合入生物薄片中，可一次檢測多種病毒和細(xì)菌，能夠快速篩查病原體，明確病因。何秀娟［7］等人應(yīng)用間接免疫熒光檢測分析了2014年～2016年度北京地區(qū)2 730患者的標(biāo)本，獲得良好效果，我們的團(tuán)隊(duì)也應(yīng)用此檢測方法就本地區(qū)小兒下呼吸道感染進(jìn)行病因?qū)W篩查，并與炎癥因子的檢測同時(shí)進(jìn)行，以期為本地區(qū)兒科診療做出貢獻(xiàn)。

3　肺炎支原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)

近年來迅速發(fā)展起來的實(shí)時(shí)熒光PCR（RT-PCR）方法是廣泛應(yīng)用于核酸的檢測一項(xiàng)新興檢驗(yàn)技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)將熒光標(biāo)記的探針與計(jì)算機(jī)分析軟件相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了定量的目的。肺炎支原體的PCR檢測主要適用于患者的痰液標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本，檢測下限為1 000拷貝量。相較于MP的微生物檢驗(yàn)和免疫檢驗(yàn)而言，RTPCR方法具有較高的靈敏度和特異性，在各年齡組的患兒中略有差異，毛李征［8］等人的報(bào)道中顯示1～6歲及6歲以上患兒的靈敏度和準(zhǔn)確率要高于1歲之內(nèi)的患兒。但MP的RT-PCR檢測方法也存在不能區(qū)分?jǐn)y帶者和感染者的弊端，虞靜芳［9］等人建議結(jié)合MP的拷貝數(shù)進(jìn)行區(qū)分，可使其發(fā)揮更好的臨床價(jià)值。

綜上所述，肺炎支原體感染的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)及方法眾多，臨床醫(yī)生可根據(jù)患者的臨床特點(diǎn)進(jìn)行選擇，必要的情況下可多種方法聯(lián)合應(yīng)用達(dá)到早期診斷和針對性治療的目的，這一點(diǎn)在針對兒科患者的診治中尤為重要。

［1］李明遠(yuǎn)，徐志凱.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：112-113.

［2］柯莉芹，王鳳美，李銀潔，等.兒童肺炎支原體肺炎流行病學(xué)特征［J］.中國當(dāng)代兒科雜志，2013，15（1）：33-36.

［3］趙洪波，李國鋒，薛璟.快速血清學(xué)檢驗(yàn)和微生物快速培養(yǎng)檢測診斷小兒肺炎支原體感染的價(jià)值分析［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，37（19）：2405-2406.

［4］Hutagalung AH，Novick PJ.Role of Rab GTPases in mem-brane traffic and cell physiology［J］.Physiol Rev，2011，91（1）：l19-l49.

［5］王孟燕，雷雪明.快速血清學(xué)檢驗(yàn)和微生物快速培養(yǎng)檢測對小兒肺炎支原體感染診斷的臨床價(jià)值分析［J］.臨床醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐，2016，1（14）：59.

［6］王艷敏.小兒肺炎支原體感染行快速血清學(xué)檢驗(yàn)與微生物培養(yǎng)檢測的價(jià)值比較［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2015，9（19）：29-30.

［7］何秀娟，李全亭，王紅，等.2730例呼吸道病原體譜抗體IgM檢測結(jié)果分析［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，26（15）：2246-2248.

［8］王晶，甘軼文，毛李征，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR在兒童肺炎支原體感染中的診斷價(jià)值［J］.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2015，19（15）：91-93.

［9］虞靜芳.定量熒光PCR在肺炎支原體肺炎診斷中的應(yīng)用［J］.中國醫(yī)藥指南，2015，13（5）：70-71.

Review About Laboratory Diagnosis of Mycoplasma Pneumonia

FENG Changmei1YANG Liu1LIU Junfen2HAN Keke11 Clinical Laboratory Department，Northern Hospital in Baotou，Baotou Inner Mongolia 014030，China，2 Pediatrics Department

Mycoplasma pneumoniae which caused mycoplasma pneumoniae pneumonia（MPP）of clinical symptoms are not typical，so laboratory tests for diagnosis is of great significance in clinical diagnosis.This article through the previous data，for laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae from the aspects of microbiological examination，immunological test and molecular biological test，hoping for clinical early，rapid screening for the cause of the disease to provide help.

Mycoplasma，Pneumonia，Laboratory diagnosis

R725.6

A

1674-9316（2016）20-0166-02

10.3969/j.issn.1674-9316.2016.20.104

1 內(nèi)蒙古包頭市北方醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 包頭 014030；2兒科