陳 鑫

(沈陽市第一人民醫(yī)院(沈陽市腦科醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)六科，遼寧 沈陽 110041)

姜黃素對阿爾茨海默病小鼠學習記憶能力及海馬細胞的影響

陳 鑫

(沈陽市第一人民醫(yī)院(沈陽市腦科醫(yī)院)神經(jīng)內(nèi)六科，遼寧 沈陽 110041)

目的 探討姜黃素對阿爾茨海默病(AD)小鼠學習記憶能力的改善作用及作用機制。方法 將48只C57BL/6小鼠隨機分為模型組、實驗組、假手術(shù)組和正常對照組，每組12只。脂多糖誘導建立AD炎癥模型，利用八臂迷宮刺激器進行被動回避反應和信號方位辨別反應測試，觀察小鼠學習記憶能力及信號方位辨別能力的改變；觀察腦內(nèi)海馬組織切片神經(jīng)元細胞的形態(tài)改變。結(jié)果 實驗組小鼠學習能力和記憶保持率均顯著優(yōu)于模型組(P<0.01)；海馬區(qū)神經(jīng)元細胞數(shù)量也顯著增多，形態(tài)明顯改善，接近正常對照組和假手術(shù)組。結(jié)論 姜黃素可改善AD小鼠的學習記憶能力，其機制可能與姜黃素抗炎癥、抗氧化、減少神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)。

阿爾茨海默?。唤S素；衰老；學習；記憶

阿爾茨海默病(AD)發(fā)病機制復雜，涉及多種因素，現(xiàn)有的單靶點藥物僅能改善AD癥狀，而不能真正地起到延緩疾病的作用〔1〕。姜黃素可以抑制炎癥反應、抗氧化、抗類風濕〔2〕，改善AD病人的認知功能，因此，近年來姜黃素及相關(guān)提取物逐漸應用于神經(jīng)退行性疾病的治療〔3〕。本文進一步研究姜黃素對AD小鼠學習和記憶能力及信號辨別學習能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器 脂多糖(LPS)、姜黃素均為美國sigma公司產(chǎn)品。ZH-3000型八臂迷宮刺激器、ZH-藍星B型腦立體定位儀、ZH-RXZ型柔性露骨鉆均為淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。60只SPF級C57BL/6小鼠，2～3月齡，體質(zhì)量20～25 g，由中國醫(yī)科大學動物實驗室提供。

1.2 AD動物模型的建立及分組 48只C57BL/6小鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(20～30 mg/kg)。根據(jù)腦立體定位儀，選定小鼠黑質(zhì)致密部注射LPS 5 μg，1 μg/min建立AD模型〔4〕；利用八臂迷宮刺激器對小鼠進行被動回避反應能力和辨別學習能力的測試，篩選出AD模型小鼠。12只小鼠定位后在黑質(zhì)致密部注射相同劑量生理鹽水設(shè)為假手術(shù)組；12只造模成功的小鼠腹腔注射姜黃素50 mg/kg，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，連續(xù)7 d，設(shè)為實驗組；模型組不再進行任何干預。另取12只未進行造模的小鼠設(shè)為正常對照組，不進行任何干預。

1.3 學習和記憶能力的測試 采用八臂迷宮刺激器進行暗環(huán)境被動回避反應測試，八臂迷宮刺激器的八臂等長，均為47.5 cm，隔離區(qū)的直徑為46.5 cm，底面均布有直徑0.3 cm、間距1.2 cm的鋁柵；在每臂頂端裝一個15 w燈。將小鼠放入用黑布遮蓋做的1～8臂區(qū)，適應后1臂放置燈光(安全區(qū))，由于小鼠已習慣暗適應，會自動進入2～8臂區(qū)；此時打開2～8臂區(qū)和的電源鍵通以交流電(0.3 mA，50 Hz)〔5〕，小鼠受電擊會自動逃回1臂。根據(jù)分析小鼠躲避策略即進入安全區(qū)的次數(shù)、時間、正確次數(shù)、錯誤次數(shù)、路線等參數(shù)可以反映出實驗動物的空間記憶能力。每天訓練20次，每次間隔20 s，觀察各組小鼠停止訓練后1 w的記憶保持力。然后停止訓練，1 w后再繼續(xù)。

1.4 方位辨別能力的測試 隨機選取八臂迷宮刺激器某一臂為安全區(qū)，無電通光，其余2～8臂區(qū)通以交流電(0.3 mA,50 Hz)，但不通光。將小鼠放入安全區(qū)開始測試，10 s后無規(guī)則隨機變換安全區(qū)，小鼠受電擊后會尋找無電但通光的安全區(qū)，根據(jù)分析小鼠躲避策略測試小鼠辨燈及安全方位能力。每天訓練20次，每次間隔30 s，觀察各組小鼠訓練1 w后正確反映能力，然后停止訓練，1 w后再繼續(xù)。正確反應率(正確率=正確反應次數(shù)/20×100%)。

1.5 腦內(nèi)海馬組織切片神經(jīng)元細胞觀察 行為學觀察后，各組小鼠脫頸處死，10%的甲醛溶液心臟滴注固定，取腦組織并分離海馬，將海馬用沙布包好置于10%的甲醛溶液固定24 h后，脫水固定包埋制成石蠟塊，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察并照相。

1.6 海馬細胞存活率和凋亡率檢測 MTT法檢測海馬神經(jīng)細胞存活率，采用酶標儀檢測，嚴格按照說明書操作，在490 mm波長下測各孔的吸光度值(OD)；海馬神經(jīng)細胞凋亡率按照Annexin V-FITC凋亡試劑盒說明書操作，6 h以內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0軟件行方差分析(F檢驗)。

2 結(jié) 果

2.1 AD模型的篩選 48只AD模型小鼠根據(jù)八臂迷宮刺激器進行被動回避反應能力和辨別學習能力的測試，低于正常小鼠，且出現(xiàn)行動遲緩、少動、豎毛、尾部強直等異常行為，判定造模成功。各組小鼠均未發(fā)生脫失。

2.2 AD小鼠學習和記憶力的改變 實驗組學習完成所需訓練次數(shù)和停止訓練后進洞潛伏期均有顯著改善(P<0.01)，但與正常對照組比較仍有顯著差異(P<0.05)。見表1。

2.3 AD小鼠方位辨別學習能力的改變 隨著訓練時間的增加，各組小鼠正確反應率均緩慢上升，其中實驗組顯著好于模型組，與正常對照組和假手術(shù)組相近，1 w左右達到高峰，之后開始下降，模型組下降最為顯著。見圖1。

2.4 小鼠腦海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)學變化 正常對照組顯微鏡下可見胞體輪廓清晰，海馬神經(jīng)元突起較大，而模型組海馬元細胞的突起變小，細胞有不同程度的損傷，胞質(zhì)減少，核仁不清晰。實驗組鏡下細胞突觸雖然略小于正常對照組作文手術(shù)組，但基本接近正常形態(tài)，神經(jīng)元數(shù)量顯著多于模型組。見圖2。

組別學習完成所需訓練次數(shù)(次)停止訓練后進洞潛伏期(min)正常對照組6 25±1 331)10 82±2 621)模型組11 53±2 716 25±1 321)假手術(shù)組6 57±1 141)9 86±1 831)實驗組7 81±2 981)2)8 78±92 541)2)F值18 63216 507

與模型組比較:1)P<0.01；與正常對照組比較:2)P<0.01；下表同

圖1 各組小鼠信號方位辨別能力的測試

圖2 各組小鼠腦海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)學觀察(HE染色，×100)

2.5 各組小鼠腦海神經(jīng)細胞存活和凋亡的比較 與其他三組比較，模型組小鼠海馬細胞存活率顯著降低，而細胞凋亡率顯著增高(P<0.01)；而實驗組兩項指標顯著好于模型組，與假手術(shù)組接近，但與正常對照組還存在一定差異(P<0.05)。見表2。

組別細胞存活率細胞凋亡率正常對照組90 25±1 371)10 05±0 221)模型組61 34±1 3319 57±1 02假手術(shù)組87 01±1 251)12 12±0 341)實驗組83 13±1 291)2)15 50±0 571)2)F值21 78419 415

3 討 論

過量β淀粉樣蛋白(Aβ)(又稱老年斑)的生成、聚集和沉積能引起一系列的神經(jīng)毒性。Aβ被看成是AD三大病因之一和主要作用機制；另外，還有神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)、神經(jīng)元丟失，累及的皮層動脈和小動脈出現(xiàn)血管淀粉樣變性。該病發(fā)病機制十分復雜,目前尚無有效治療措施。有研究認為免疫炎癥機制參與了AD病理的發(fā)生發(fā)展過程。臨床很多證據(jù)也表明神經(jīng)炎癥對神經(jīng)退行性疾病病理機制具有刺激作用。因此，抗炎治療策略以及抗炎癥藥物對癥治療可能是將來AD的一種治療方法〔6〕。

近年來，姜黃素的抗炎癥、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、促凋亡等藥理作用已在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中得到證實,姜黃素可抗AD的形成、免疫調(diào)節(jié)、促進神經(jīng)修復、調(diào)節(jié)自噬的機制，可以在多個環(huán)節(jié)起調(diào)節(jié)作用，特別是在基因及信號通路轉(zhuǎn)導多重水平中的作用已經(jīng)成為研究熱點〔7〕。臨床研究顯示姜黃素具有活性高、毒副作用小的特點，是防治老年癡呆的理想藥物。楊宇等〔8〕觀察姜黃素治療后AD炎癥及神經(jīng)元的變化，轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)較多凋亡的神經(jīng)元，而在野生型小鼠中幾乎未見凋亡神經(jīng)元；姜黃素治療組小鼠中見到少量散在的凋亡神經(jīng)元，轉(zhuǎn)基因小鼠中Bax的表達明顯高于野生型小鼠和姜黃素治療組小鼠,而Bcl-2的表達量顯著低于其余兩組(P<0.05)，說明姜黃素治療AD小鼠可以改善小鼠的認知功能，并且有效地減少炎癥因子的產(chǎn)生、減少神經(jīng)元的凋亡。李厚忠等〔9〕觀察姜黃素對AD模型小鼠海馬組織中丙二醛(MDA)濃度、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-Px)活性的影響，以及觀察海馬區(qū)病理組織，結(jié)果顯示姜黃素可抑制自由基生成并加強其清除而發(fā)揮強大的抗氧化保護作用，保護生物大分子免遭自由基的毒性作用，從而保護機體組織器官。同時，姜黃素可以改善AD模型小鼠海馬功能異常和病理組織學改變。

本實驗通過小鼠被動回避反應和信號方位辨別試驗，證明姜黃素改善了小鼠AD的炎癥狀態(tài)，并進一步顯示對AD海馬細胞有一定的保護作用，機制可能是通過抗氧化應激、抗凋亡等機制發(fā)揮保護作用。

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3 Monroy A,Lithgow GJ,Alavez S.Curcumin and neurodegenerative diseases〔J〕.Biofactors,2013;39(1):122-32.

4 Ringman JM,Frautschy SA,Cole GM,etal.A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease〔J〕.Curr Alzheimer Res,2005;2(2):131-6.

5 Lee WH,Loo CY,Bebawy M,etal.Curcumin and its derivatives:their application in neuropharmacology and neuroscience in the 21st century〔J〕.Curr Neuropharmacol,2013;11(4):338-78.

6 于 嵩,王占友.姜黃素對帕金森病及阿爾茨海默病神經(jīng)元保護作用的實驗研究〔D〕.沈陽：中國醫(yī)科大學,2010.

7 Caesar I,Jonson M,Nilsson KP,etal.Curcumin promotes a-beta fibrillation and reduces neurotoxicity in transgenic drosophila〔J〕.PLoS One,2012;(2):e31424.

8 楊 宇,梁梅冰,賈 真,等.姜黃素在阿爾茨海默病中對炎癥以及神經(jīng)元的保護機制研究〔J〕.武漢大學學報:醫(yī)學版,2015；36(3):332-6.

9 李厚忠,張羽飛.姜黃素對阿爾茨海默病模型小鼠抗氧化系統(tǒng)的影響〔J〕.中醫(yī)藥學報,2014;42(5):34-6.

〔2016-08-31修回〕

(編輯 袁左鳴)

陳 鑫(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科相關(guān)疾病的診斷與治療研究。

R749

A

1005-9202(2016)24-6056-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.004