李愛國 楊連華 徐 剛 冀春梅

(濰坊醫(yī)學(xué)院青州臨床學(xué)院輸血科，山東 濰坊 262500)

miR-27a在老年急性髓系白血病骨髓單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

李愛國 楊連華 徐 剛1冀春梅

(濰坊醫(yī)學(xué)院青州臨床學(xué)院輸血科，山東 濰坊 262500)

目的探討miR-27a在老年急性髓系白血病(AMI)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。方法 選取初治老年AMI患者95例，以行骨髓標(biāo)本檢查的非白血病老年人35例作為對(duì)照組，所有患者采取小劑量MA方案治療，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a表達(dá)。所有患者均隨訪至2016年4月30日，以miR-27a相對(duì)表達(dá)量的P25值為界值，將患者分為低表達(dá)組(n=24)和高表達(dá)組(n=71)，利用Kaplan-Meier法對(duì)miR-27a相對(duì)表達(dá)量對(duì)患者總體生存時(shí)間的影響進(jìn)行分析。結(jié)果 老年AMI患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，且單核系高于非單核系(P<0.05)；老年AMI患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a相對(duì)表達(dá)量與年齡、細(xì)胞遺傳學(xué)、FLT3-ITD基因、NPM1/FLT3-ITD基因、白細(xì)胞(WBC)分組、首療程治療效果和NCCN預(yù)后分組有關(guān)(P<0.05)；Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達(dá)組患者中位總體生存時(shí)間15.6個(gè)月，高表達(dá)組中位總體生存時(shí)間9.3個(gè)月，Log Rank檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.488，P<0.001)。結(jié)論 miR-27a在老年AMI患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)，且與年齡、染色體核型、基因位點(diǎn)突變及患者預(yù)后有關(guān)，有望為老年AMI基因治療及機(jī)制研究提供新的線索。

急性髓系白血??；miR-27a；骨髓單個(gè)核細(xì)胞

急性髓系白血病(AMI)65歲以上人群發(fā)病率顯著增加〔1〕。近年雖然臨床治療AMI技術(shù)不斷進(jìn)步，患者臨床療效顯著提高，但老年患者總體預(yù)后依然較差〔2〕，一方面與老年患者器官代謝功能下降、基礎(chǔ)疾病較多有關(guān)〔3〕，另一方面也與老年AMI疾病本身分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)異常有關(guān)〔4〕。微小RNA(miRNA)作為真核生物中高度保守的短小RNA，廣泛參與機(jī)體生理和病理過程調(diào)控。miRNA可通過發(fā)揮類似抑癌基因或癌基因的功能而參與多種腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展過程中〔5〕。miR-27a作為miRNA重要類型，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，可通過調(diào)控配體蛋白表達(dá)而影響腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力〔6〕。本研究擬對(duì)老年AMI骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a表達(dá)進(jìn)行分析，探討其在老年AMI發(fā)病中的作用及對(duì)患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2008年3月至2013年4月在我院治療的初治老年AMI患者95例，其中，男性57例，女性38例，中位年齡64歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡60～79歲；②均經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)、形態(tài)學(xué)及免疫表型檢查確診；③初診病例，骨髓采集前未接受過任何治療。FAB分型：M0 1例、M1 2例、M2 27例、M3 4例、M4 13例、M5 44例、M6 4例；其中，單核系(M4和M5)57例，非單核系(M0、M1、M2、M3、M6)38例；根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)分組：正常核型51例、復(fù)雜核型24例、染色體單體核型20例。同期選取35例行骨髓標(biāo)本檢查的非白血病老年人作為對(duì)照組，年齡60～80歲，骨髓形態(tài)學(xué)檢查排除血液系統(tǒng)疾病。

1.2 主要試劑和儀器 Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Biomiga公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒均購自大連寶生物公司，miR-27a及內(nèi)參U6引物均由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液購自上海信裕生物公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 治療方案 根據(jù)中國AMI治療指南，采取推薦的小劑量MA方案。對(duì)于血紅蛋白<70 g/L或出現(xiàn)明顯貧血患者，給予懸浮紅細(xì)胞輸注；對(duì)于中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)<0.5×109/L患者，給予皮下注射200 μg·m-2·d-1的G-CSF；對(duì)于血小板(PLT)<20×109/L患者，給予單采血小板。

1.3.2 治療效果評(píng)估 根據(jù)患者誘導(dǎo)緩解治療第26天時(shí)骨髓中幼稚細(xì)胞比例將患者分為：首療程緩解組：幼稚細(xì)胞比例<5%；首療程未緩解組：幼稚細(xì)胞比例≥5%。根據(jù)2013年NCCN關(guān)于AML預(yù)后分組標(biāo)準(zhǔn)〔7〕：預(yù)后良好組6例、預(yù)后中等組66例和預(yù)后不良組28例。

1.3.3 病例隨訪 所有患者均隨訪至2016年4月30日方式包括電話、查閱門診記錄及住院記錄等，未出現(xiàn)失訪病例。

1.3.4 標(biāo)本采集及處理 所有患者均于初診行化療治療前無菌操作下留取骨髓標(biāo)本3 ml，對(duì)照組采用相同方法留取骨髓標(biāo)本，用肝素抗凝，利用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液對(duì)骨髓中單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離，保存于-80℃冰箱以備檢。

1.3.5 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a表達(dá) 取骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本，加入細(xì)胞裂解液裂解，用Trizol總RNA提取試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行提取，并用全波長酶標(biāo)儀檢測總RNA純度，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板鏈cDNA，以cDNA為模板行PCR。引物序列分別為：miR-27a引物：上游：5′-TTCACAGTGGCTAAG-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物：上游：5′-TCAGTTGCTGTTCTGGGTG-3′，下游：5′-CGGTTGGCTGGAAAGGAG-3′。PCR反應(yīng)條件：94℃ 60 s，92℃ 45 s，56℃ 30 s，74℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行38次循環(huán)。每個(gè)樣品均設(shè)置三個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a 168相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a相對(duì)表達(dá)量的P25值為界值，利用Kaplan-Meier法對(duì)miR-27a相對(duì)表達(dá)量對(duì)患者總體生存時(shí)間的影響進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 老年AMI患者和對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a表達(dá)比較 老年AMI患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，且高于非單核系(P<0.05)，見表1。

2.2 老年AMI患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 老年AMI患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a相對(duì)表達(dá)量與性別無關(guān)，而與年齡、細(xì)胞遺傳學(xué)、FLT3-ITD基因、NPM1/FLT3-ITD基因、WBC分組、首療程治療效果和NCCN預(yù)后有關(guān)(P<0.05)，見表2。

組別nmiR?27a相對(duì)表達(dá)量老年AMI患者951 48±0 191)非單核系571 37±0 121)單核系381 68±0 141)2)對(duì)照組351 07±0 11F值234 679P值<0 001

與對(duì)照組相比:1)P<0.05；與非單核系相比:2)P<0.05

指標(biāo)miR?27a表達(dá)量t或F值P值性別 男1 49±0 210 7920 618 女1 46±0 18年齡(歲) ≥701 64±0 1717 664<0 001 <701 33±0 15細(xì)胞遺傳學(xué)正常核型1 29±0 1615 739<0 001復(fù)雜核型1 68±0 131)染色體單體核型1 71±0 151)FLT3?ITD基因陽性1 69±0 1813 867<0 001陰性1 31±0 14NPM1/FLT3?ITD基因NPM1+/FLT3?ITD-1 30±0 1119 743<0 001NPM1?FLT3?ITD-1 79±0 16WBC分組(×109/L)≥1001 74±0 2018 281<0 001<1001 34±0 15首療程治療效果緩解組1 27±0 1421 642<0 001未緩解組1 77±0 16NCCN預(yù)后分組預(yù)后良好組1 21±0 132)3)39 573<0 001預(yù)后中等組1 39±0 152)預(yù)后不良組1 73±0 17

與正常核型比較：1)P<0.05；與預(yù)后不良組比較：2)P<0.05；與預(yù)后中等組比較：3)P<0.05

2.3 老年AMI患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a表達(dá)對(duì)患者總體生存時(shí)間的影響 以骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a相對(duì)表達(dá)量的P25值為界值，將患者分為低表達(dá)組(n=24)和高表達(dá)組(n=71)，Kaplan-Meier生存分析顯示，低表達(dá)組患者中位總體生存時(shí)間15.6個(gè)月，高表達(dá)組中位總體生存時(shí)間9.3個(gè)月，Log Rank檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.488，P<0.001)。

3 討 論

AMI作為成人最為常見的白血病，是正常髓系細(xì)胞分化發(fā)育中不同階段造血祖細(xì)胞惡化而來。雖然近年來臨床上治療AMI的手段不斷完善，但老年AMI患者總體預(yù)后并未得到改善，相比于年輕患者，其緩解率、無病生存率及總體生存率均較低〔8〕。究其原因，除了與老年患者自身體質(zhì)條件有關(guān)，越來越多的研究指向分子生物學(xué)異常和細(xì)胞遺傳學(xué)對(duì)患者預(yù)后的影響。miRNA作為廣泛參與機(jī)體生理、病理過程的穩(wěn)定存在于機(jī)體內(nèi)的高度保守的短小RNA，在細(xì)胞分化、增殖、凋亡、遷移等過程中發(fā)揮重要作用，又可發(fā)揮抑癌或促癌基因的功能而參與惡性腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展過程中〔9〕。有研究指出〔10〕，特異的miRNA表達(dá)譜與AMI細(xì)胞遺傳學(xué)及患者預(yù)后關(guān)系密切。miR-27a作為miRNA類型之一，參與了多種惡性腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過程〔11〕，且與兒童急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)〔12〕、白血病耐藥〔13〕等有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，老年AMI患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，說明miR-27a在老年AMI骨髓單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)，可能參與了發(fā)病過程，且單核系高于非單核系，進(jìn)一步提示miA-27a在老年AMI患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)與骨髓細(xì)胞形態(tài)有關(guān)。

本研究顯示，年齡、染色體核型、基因位點(diǎn)突變及WBC數(shù)是影響患者預(yù)后的重要因素〔14〕，提示可能與患者預(yù)后有關(guān)，且與AMI患者染色體核型及基因突變有關(guān)，但具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步明確，我們推測，可能是miR-27a在異常調(diào)控髓系細(xì)胞分化發(fā)育中，異常增殖、分化的造血祖細(xì)胞加劇了染色體核型及基因突變的發(fā)生。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-27a可能與患者治療效果及預(yù)后有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a在構(gòu)建的阿霉素耐藥Raji細(xì)胞株中呈高表達(dá)〔15〕。結(jié)合本研究，我們推測，可能是miR-27a參與了老年AMI患者耐化療藥物的發(fā)生而影響患者預(yù)后，老年AMI患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中miR-27a表達(dá)量與患者預(yù)后密切相關(guān)。

1 Wouters BJ，Delwel R.Epigenetics and approaches to targeted epigenetic therapy in acute myeloid leukemia〔J〕.Blood，2016；127(1)：42-52.

2 趙邢力，劉凱奇，林 冬，等.老年急性髓系白血病染色體核型和基因突變特征分析〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2015；23(2)：300-5.

3 Xu J，Chen T，Liu Y，etal.Easily manageable prognostic factors in 152 Chinese elderly acute myeloid leukemia patients：a single-center retrospective study〔J〕.J Biomed Res，2014；28(5)：396-405.

4 Wakita S，Yamaguchi H，Ueki T，etal.Complex molecular genetic abnormalities involving three or more genetic mutations are important prognostic factors for acute myeloid leukemia〔J〕.Leukemia，2016；30(3)：545-54.

5 Li P，Liu H，Wang Z，etal.MicroRNAs in laryngeal cancer：implications for diagnosis，prognosis and therapy〔J〕.Am J Transl Res，2016；8(5)：1935-44.

6 王慧玲，侯寶華，區(qū)金銳.胰腺癌細(xì)胞中miR-27a靶基因的確定及其意義〔J〕.中華胰腺病雜志，2015；15(2)：127-8.

7 Hao S，Shao Z.HOTAIR is upregulated in acute myeloid leukemia and that indicates a poor prognosis〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2015；8(6)：7223-8.

8 Serve H，Krug U，Wagner R，etal.Sorafenib in combination with intensive chemotherapy in elderly patients with acute myeloid leukemia：results from a randomized，placebo-controlled trial〔J〕.J Clin Oncol，2013；31(25)：3110-8.

9 Tutar Y.miRNA and cancer；computational and experimental approaches〔J〕.Curr Pharm Biotechnol，2014；15(5)：429-35.

10 蘇 淼.微小RNA在伴遺傳學(xué)異常的急性白血病中的研究進(jìn)展〔J〕.白血病·淋巴瘤，2014；23(10)：632-5.

11 Sun Y，Yang X，Liu M，etal.B4GALT3 up-regulation by miR-27a contributes to the oncogenic activity in human cervical cancer cells〔J〕.Cancer Lett，2016；375(2)：284-92.

12 程玉才，黃禮彬，王麗娜，等.miRNA表達(dá)譜改變與兒童急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)發(fā)的相關(guān)性〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2014；35(5)：717-22.

13 燕 華，李 衛(wèi).柔紅霉素對(duì)HL-60敏感細(xì)胞miRNA-21等5種miRNA表達(dá)的影響〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2014；43(33)：4450-3.

14 王 婧，江 濱，江 倩，等.老年急性髓系白血病小劑量MA與CAG方案誘導(dǎo)治療療效比較及預(yù)后影響因素分析〔J〕.中華血液學(xué)雜志，2016；37(3)：194-200.

15 鄭榮立，姜玉杰，王 欣.阿霉素耐藥Raji細(xì)胞株的建立與Prohibitin及微小RNA-27a的表達(dá)情況分析〔J〕.中華血液學(xué)雜志，2015；36(4)：326-30.

〔2015-12-09修回〕

(編輯 李相軍)

遼寧省自然科學(xué)基金(2013021039)

冀春梅(1964-)，女，副主任檢驗(yàn)科，主要從事臨床生化研究。

李愛國(1970-),男,主管檢驗(yàn)師，主要從事血液檢驗(yàn)、輸血研究。

R7

A

1005-9202(2016)24-6153-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.051

1.中國醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院