程 權(quán)傅華洲

人參二苓湯及其水提醇沉提取物對(duì)H22荷瘤小鼠脾胸腺指數(shù)及外周血細(xì)胞的影響

程 權(quán)1傅華洲2

目的探討人參二苓湯及其水提醇沉提取物對(duì)H22荷瘤小鼠脾胸腺指數(shù)及外周血細(xì)胞的影響。方法將60只健康昆明小鼠分為正常組、荷瘤模型組、陽性對(duì)照組（CTX組）、水提組（RSEL）、總多糖組（PRSEL）、小分子組（SRSEL），每組10只。建立H22荷瘤小鼠模型，造模成功后分別灌服人參二苓湯水提物、總多糖、小分子，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算小鼠脾胸腺指數(shù)，抑瘤率及外周血細(xì)胞的檢測(cè)。結(jié)果人參二苓湯水提物（RSEL）組和總多糖（PRSEL）組抑瘤率分別為37.80% 和50.13%；CTX組為79.62%；CTX組及人參二苓湯水提組和總多糖組平均瘤重分別為（0.7611± 0.1502）g、（2.3231±0.5324）g和（1.8642±0.5740）g，與荷瘤模型組平均瘤重（3.7352±0.4851）g比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），小分子組瘤重與荷瘤組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與水提組比較，總多糖組瘤重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，人參二苓湯總多糖（PRSEL）組能顯著增強(qiáng)荷瘤小鼠脾和胸腺指數(shù)（P＜0.05或P＜0.01），且較人參二苓湯水提物（RSEL）組和小分子（SRSEL）組更為顯著；人參二苓湯總多糖（PRSEL）組能改善荷瘤小鼠晚期白細(xì)胞的過度增高狀態(tài)（P＜0.01），優(yōu)于人參二苓湯水提物組（P＜0.05）。結(jié)論人參二苓湯總多糖（PRSEL）可以明顯延緩荷瘤小鼠晚期類白血病樣反應(yīng)的發(fā)生，維持血細(xì)胞在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，且抑制腫瘤生長作用較明顯，可能與其改善荷瘤小鼠免疫器官功能相關(guān)。

H22荷瘤小鼠；人參二苓湯；總多糖；外周血細(xì)胞

為研究人參二苓湯抗腫瘤作用有效部位及其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過建立H22肝癌移植瘤模型，觀察人參二苓湯及其水提醇沉提取物對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤生長、脾和胸腺指數(shù)以及外周血細(xì)胞的影響，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 SPF級(jí)昆明小鼠60只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)[SYXK（浙）2012-001]。所有小鼠在相同條件下，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 細(xì)胞株 小鼠H22肝癌瘤株，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要藥品及試劑 人參二苓湯藥材由杭州市第一人民醫(yī)院中藥房提供；環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)14081425）；無支原體胎牛血清（杭州四季青生物有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)基1640（杭州吉諾生物有限公司）。

1.4 主要儀器 全自動(dòng)血液分析儀（SYSMEX CORPORPORATION），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申勝科技有限公司），數(shù)控恒溫水浴鍋（上海申勝科技有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司），DLSB-低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），SK2510HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），熒光倒置顯微鏡（日本NIKON公司），SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇州泰安空氣技術(shù)有限公司）。細(xì)胞培養(yǎng)管（THERMO），萬分之一精密電子天平（AR21300haus-Corppine Brook，NT，USA）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 腫瘤模型的制備 取接種腫瘤后7天且生長良好的H22肝癌腹水型荷瘤小鼠，將其頸椎脫臼處死，在無菌條件下抽取乳白色腹水，用生理鹽水稀釋成密度為1×107/mL的H22細(xì)胞懸液。用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)＞95%，以0.2 mL/只接種于昆明小鼠右腋皮下，制備H22肝癌實(shí)體模型[1]。

2.2 分組及給藥

2.2.1 分 組 荷瘤小鼠造模24h后，將動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對(duì)照組（CTX組）、水提組（RSEL）、總多糖組（PRSEL）、小分子組（SRSEL），每組10只。

2.2.2 給 藥 按《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》附表“人和動(dòng)物間接體表面積折算表”，計(jì)算出各組給藥劑量，人參二苓湯總多糖組用水提醇沉法提取其中多糖部分，Sevege法去除其中的游離蛋白，獲得人參二苓湯復(fù)方總多糖，水提醇沉上清液為人參二苓湯小分子部分，分別旋干低溫保存?zhèn)溆?，以及水提物的旋干物，最后三組給藥劑量都控制在2.925g/kg，用生理鹽水稀釋灌胃給藥，最后每組每天分別均給藥0.4mL/只。H22荷瘤小鼠造模成功24h后，人參二苓湯各部分組開始灌胃給藥0.4mL/只，陽性對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺（CTX）0.4mL/只（50mg/kg），腹腔注射，隔天給藥，模型對(duì)照組和正常組給予生理鹽水灌胃0.4mL/只，每天1次，連續(xù)給藥14天。

2.3 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 第15天稱取小鼠質(zhì)量，在無菌條件下摘眼球取血于抗凝EP管，檢測(cè)血細(xì)胞含量。解剖死亡小鼠，稱取脾胸腺質(zhì)量，計(jì)算脾胸腺指數(shù)及抑瘤率。器官指數(shù)=器官質(zhì)量/體質(zhì)量×1000（mg/g）；抑瘤率（%）=［（對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重］×100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，采用單因素方差分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響 與模型組比較，RSEL組及PRSEL組對(duì)腫瘤質(zhì)量均具有顯著降低作用（P＜0.01）；與RSEL組比較，PRSEL組小鼠瘤質(zhì)量降低更顯著（P＜0.05），RSEL組和 PRSEL組抑瘤率分別為37.80%，50.13%。見表1。

3.2 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對(duì)H22荷瘤小鼠脾胸腺指數(shù)的影響 與正常組比較，RSEL組、PRSEL組脾臟和胸腺指數(shù)提高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，RSEL組、PRSEL組胸腺指數(shù)增高（P＜0.01），SRSEL組胸腺指數(shù)變化不大（P＞0.05）。與模型組比較，人參二苓湯RSEL組和PRSEL組荷瘤小鼠脾臟指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤

表2 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對(duì)H22荷瘤小鼠脾、胸腺指數(shù)的影響（mg/g，±s）

表2 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對(duì)H22荷瘤小鼠脾、胸腺指數(shù)的影響（mg/g，±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與CTX組比較，▲P＜0.01；CTX：環(huán)磷酰胺；RSEL：人參二苓湯水提；PRSEL：人參二苓湯復(fù)方總多糖；SRSEL：人參二苓湯小分子部分

組別正常組荷瘤模型組CTX組RSEL組PRSEL組SRSEL組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10脾指數(shù)8.11±0.31 8.78±2.43 7.68±2.10 12.04±1.65**△▲13.62±2.02**△▲10.26±1.54△胸腺指數(shù)2.26±0.24 2.45±0.35 1.84±0.33 3.09±0.70*△▲3.66±0.76**△▲2.91±0.62

3.3 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對(duì)H22荷瘤小鼠外周血WBC、PLT數(shù)量的影響 與模型組比較，人參二苓湯總多糖及水提物改善小鼠外周血WBC含量均較為顯著（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組紅細(xì)胞、血小板變化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對(duì)H22荷瘤小鼠外周血WBC、RBC、PLT數(shù)量的影響（±s）

表3 人參二苓湯及其水提醇沉提取物對(duì)H22荷瘤小鼠外周血WBC、RBC、PLT數(shù)量的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01；與RSEL組比較，△P＜0.01；CTX：環(huán)磷酰胺；RSEL：人參二苓湯水提；PRSEL：人參二苓湯復(fù)方總多糖；SRSEL：人參二苓湯小分子部分

組別正常組荷瘤模型組CTX組RSEL組PRSEL組SRSEL組鼠數(shù)10 10 10 10 10 10 WBC（109/L）5.55±1.45 28.86±9.93 8.56±3.43 11.19±6.35** 8.85±3.91**△35.58±7.36 RBC（1012/L）10.23±1.55 6.84±0.54 6.06±1.10 7.45±1.56 7.47±1.92 7.55±0.77 PLT（109/L）1611.25±469.34 1774.60±253.03 1339.83±326.77 1652.25±311.40 1607.44±413.16 2081.60±410.00

4 討 論

相關(guān)研究表明，中藥多糖具有抗病毒以及抗腫瘤等生理活性[2]。目前單味中藥的多糖研究較多，復(fù)合多糖研究正在被關(guān)注。人參二苓湯由生曬參、豬苓、茯苓、薏苡仁、蟬蛻、防風(fēng)、白術(shù)、甘草組成，具有補(bǔ)氣健脾、燥濕利水等功效。前期臨床研究[3-6]該方對(duì)于腫瘤相關(guān)疾病的免疫調(diào)節(jié)療效均較為顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上證實(shí)人參二苓湯復(fù)合多糖改善荷瘤小鼠脾和胸腺的功能，且效果優(yōu)于水提物組及小分子組（P＜0.05）。

多糖的免疫調(diào)節(jié)作用是通過宿主中介途徑，且大多無細(xì)胞毒性，并不影響正常細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和受體的表達(dá)，同時(shí)刺激機(jī)體的免疫活性細(xì)胞的成熟分化以及繁殖，調(diào)節(jié)荷瘤小鼠失衡的免疫狀態(tài)[7-8]。人參二苓湯總多糖可能通過提高晚期荷瘤小鼠免疫功能來明顯改善白細(xì)胞水平，維持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的血細(xì)胞數(shù)量，延遲類白血病樣反應(yīng)的發(fā)生，從而延長荷瘤小鼠的生存期。人參二苓湯總多糖改善荷瘤小鼠免疫機(jī)制有待更進(jìn)一步的研究和證實(shí)。

［1］吳先闖，杜鋼軍，宋曉勇，等.玉米須多糖對(duì)環(huán)磷酰胺治療H22荷瘤小鼠機(jī)體損傷的減毒增效作用［J］.中藥材，2014，37（10）：1833-1836.

［2］Yan H，Xie YP，Sun SG，et al.Chemical analysis of Astragalus mongholicus polysaccharides and antioxidant activity of the polysaccharides［J］.Carbohyd Polym，2010，82（10）：636-640.

［3］金莉，傅華洲.人參二苓湯防治胃癌化療后不良反應(yīng)及其對(duì)免疫功能的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，21（5）：1182-1184.

［4］傅大治.人參二苓湯聯(lián)合替吉奧膠囊治療晚期胃癌56例臨床觀察［J］.中國中醫(yī)藥科技，2012，19（2）：168-169.

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（收稿：2015-10-26 修回：2015-11-24）

Effects of Renshen Erling Decoction and Its Water Extract from Alcohol Precipitation on Spleen Index and Thymus Index and Peripheral Blood Cells of H22 Tumor-bearing Mice

CHENG Quan1,FU Huazhou21Second Clinical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of TCM, First People's Hospital of Hangzhou,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the Renshen Erling decoction and its water extract from alcohol precipitation on spleen index and thymus index and peripheral blood cells in H22 tumor-mice.MethodsSixty healthy KM mice were randomly divided into 6 groups:control group,tumor-bearing model group,positive control group （CTX group）,Renshen Erling decoction-water extract group（RSEL）,Renshen Erling decoction-total polysaccharide group（PRSEL）,and Renshen Erling decoction-small molecule group（SRSEL）,with 10 mice in each group.H22 tumor-bearing model was established in all group except control group,then mice in each group were treated with the corresponding drugs for 14d.On day 15,mice in each group were sacrificed for calculation of spleen and thymus index and inhibitory rate and counting of peripheral blood cells.ResultsThe inhibitory rate were 37.80%, 50.13%,and 79.62%in RSEL group,PRSEL group and CTX group,respectively;the average tumor weight in CTX group,RSEL group,and PRSEL group were 0.7611±0.1502g,2.3231±0.5324g and 1.8642±0.5740g,respectively, with a significant difference compared to tumor-bearing model group（3.7352±0.4851g,P＜0.01）;no significant difference was found between that of SRSEL group（3.5072±0.278g）and tumor-bearing model group（P＞0.05）;a significant difference was noted between RSEL group and PRSEL group（P＜0.05）.The spleen index and thymus index of PRSEL group were higher than that of tumor-bearing model group（P＜0.05 or P＜0.01）and even higher than thatof RSEL and SRSEL groups.The excessive increase of leucocyte in advanced tumor-bearing mice was inhibited in PRSEL group（P＜0.01）and the inhibition effect was better compared to that in RSEL group（P＜0.05）.ConclusionRenshen Erling decoction-PRSEL can significantly delay the leukemoid reaction of tumor-bearing mice and maintain their blood cells in a relatively stable state.Its effect on inhibiting tumor growth is clear,which may be related to its role in improving the function of immune organs in mice.

H22 tumor-bearing mice;Renshen Erling decoction;total polysaccharide;peripheral blood cells

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013ZA105）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（杭州 310053）；2杭州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科（杭州 310006）

傅華洲，E-mail：fuhuazhou@126.com