朱程芬邱曉曉帥 軍程 涇程 蕾朱長玲

補腎益沖抗衰湯對卵巢儲備功能下降大鼠血清AMH和INHB的影響

朱程芬1邱曉曉1帥 軍2程 涇1程 蕾1朱長玲2

目的觀察補腎益沖抗衰湯對卵巢儲備功能下降模型大鼠血清內(nèi)分泌及抗苗勒管激素（AMH）、抑制素B（INHB）的影響。方法選取40只8周齡雌性SD大鼠，分為正常對照組、模型組、補佳樂組、補腎益沖抗衰湯組，各10只，除正常對照組外，其余各組采用雷公藤多苷片+相應(yīng)藥物制作卵巢儲備功能下降大鼠模型。通過陰道涂片觀察各組大鼠動情周期，光鏡下觀察卵巢組織形態(tài)學(xué)變化，酶聯(lián)免疫法檢測血雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、AMH、INHB水平。結(jié)果補腎益沖抗衰湯能維持大鼠動情周期4～5天，促進卵泡發(fā)育成熟、改善內(nèi)分泌水平，與模型組比較，E2上升[（21.51±1.26）pg/mL比（9.81±1.18）pg/mL，P＜0.05]，F(xiàn)SH下降[（6.57±1.88）mIU/ mL比（9.59±2.17）mIU/mL，P＜0.05]，F(xiàn)SH/LH降低[（2.27±0.44）比（3.36±0.82），P＜0.05]；升高AMH[（114.45±11.11）ng/L比（100.27±9.17）ng/L，P＜0.05]和INHB[（56.91±1.74）ng/L比（26.28±6.19）ng/L，P＜0.05]水平。結(jié)論補腎益沖抗衰湯能夠改善卵巢儲備功能下降（DOR）大鼠性激素水平，升高AMH、INHB水平，并減少閉鎖卵泡，改善大鼠卵巢儲備功能。

大鼠；卵巢儲備功能下降；補腎益沖抗衰湯；抗苗勒管激素；抑制素B

卵巢儲備功能下降（DOR）是近年來新發(fā)現(xiàn)并命名的女性生殖內(nèi)分泌疾病，是指卵巢卵泡池內(nèi)可募集卵泡數(shù)目減少，卵母細胞質(zhì)量下降，導(dǎo)致女性生育能力降低及性激素缺乏。因DOR可進一步發(fā)展為卵巢早衰（POF）,故早期診斷并給予合理的治療，可使卵巢儲備功能得到改善，提高妊娠率，延緩卵巢早衰[1]。近年研究顯示，血清基礎(chǔ)AMH和INHB水平與卵巢儲備功能密切相關(guān)，是目前有價值的預(yù)測DOR指標[2]。中醫(yī)雖無DOR的病名，但根據(jù)癥狀，該病屬中醫(yī)“閉經(jīng)”、“血枯”、“不孕”、“斷經(jīng)前后諸癥”等范疇，病因病機為腎虛夾瘀、火、痰等本虛標實。補腎益沖抗衰湯是程涇教授治療卵巢儲備功能下降的經(jīng)驗方，筆者制作了DOR大鼠模型對比分析該方對卵巢儲備功能下降大鼠血清AMH、INHB等水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性SD大鼠40只，動物許可證號：SYXK（浙2010-0150）體質(zhì)量170～220g，SPF級，8周齡,溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供和飼養(yǎng)。于溫州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心SPF級屏障動物實驗區(qū)飼養(yǎng)。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲水，自由飲食，常規(guī)全價飼料喂養(yǎng)，室溫20～22℃，通過自動換氣裝置調(diào)節(jié)室內(nèi)空氣，人工調(diào)節(jié)熒光照明，每天明暗各12h。

1.2 藥品與試劑 雷公藤多苷片（普洛康裕）：10mg/片。補腎益沖抗衰湯（由溫州中山醫(yī)院提供、制備）：由菟絲子、淫羊藿、巴戟天、龜甲、太子參、當歸、熟地枸杞子、鹿角片、牛膝、丹參、靈芝、懷山藥、茺蔚子、知母、黃柏等組成。每毫升含生藥1g。黃體酮膠囊（愛生藥業(yè)）：100mg/粒。補佳樂（拜耳醫(yī)藥）：1mg/片。左歸丸（宛西制藥）：45g/瓶。AMH、INHB ELISA試劑盒：購自R&D公司,批號E-30082；E2酶免試劑盒：美國R&D公司，批號E-30606；LH酶免試劑盒：美國R&D公司，批號E-30621；FSH酶免試劑盒：美國R&D公司，批號E-30595。

1.3 動物分組與給藥 健康雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進行陰道細胞學(xué)涂片，篩選出有正常動情周期的大鼠40只，數(shù)字隨機表法隨機分為正常對照組10只，9時/16時均予生理鹽水；模型組10只，9時予雷公藤多苷片50mg/kg，16時予生理鹽水；補佳樂組10只，9時予雷公藤多苷片50mg/kg，補佳樂0.24mg（/kg·d），第4天加用黃體酮膠囊25mg（/kg· d），兩藥同時停用1天后重復(fù)下個療程；補腎益沖抗衰湯組10只，9時予雷公藤多苷片50mg/kg，補腎益沖抗衰湯48mg/（kg·d）；各組均連續(xù)給藥3周。

1.4 標本制備與指標檢測 （1）用藥結(jié)束后連續(xù)5天陰道涂片：將生理鹽水浸濕的棉簽輕輕插入大鼠陰道內(nèi)旋轉(zhuǎn)后取出、涂片，置于95%乙醇固定20min 后HE染色，光鏡下觀察陰道上皮脫落細胞變化情況，觀察動情周期變化。（2）將處于動情前期或第5天尚未出現(xiàn)明顯動情周期的大鼠快速處死，心臟取血3mL，置于PE管中，3000r/min離心10min，分離血清，-20℃保存，ELISA法檢測性激素FSH、LH、E2及血清AMH、INHB。（3）快速取出雙側(cè)卵巢并剔除脂肪組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。HE染色，光鏡下觀察各級卵泡、黃體、顆粒細胞（GC）、間質(zhì)等變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，用均數(shù)±標準差（±s） 表示。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）、Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者采用Dunnet，sT3檢驗。

2 實驗結(jié)果

2.1 對大鼠動情周期的影響 正常對照組大鼠維持原有的動情周期4～5天。模型組大鼠動情周期在給藥1周后延長為7～8天1次，間情期3～5天。每天1次陰道脫落細胞涂片觀察，不見動情前期。補佳樂組大鼠性周期不規(guī)則，動情前期、動情期稍延長2～5天，或持續(xù)為動情前期、動情期。補腎益沖抗衰湯組大鼠性周期規(guī)則，性周期為4～5天，每天1次陰道脫落細胞涂片觀察到動情前期，動情后期、間情期較模型組縮短約2～3天。

2.2 對大鼠卵巢形態(tài)學(xué)的影響 正常對照組大鼠卵巢體積大，可見各級卵泡，卵泡生長活躍，形態(tài)規(guī)則圓潤，顆粒細胞層次多，卵泡液含量多，卵泡飽滿；黃體發(fā)育好，體積大，黃體細胞豐富；偶見閉鎖卵泡。模型組大鼠卵巢體積萎縮，被皮增厚，色蒼白，各期卵泡數(shù)均明顯減少，趨于閉鎖卵泡較多，顆粒細胞層次少，黃體偏小；間質(zhì)可見炎細胞浸潤及纖維化。補佳樂組、補腎益沖抗衰湯組大鼠卵巢顏色粉紅，血供豐富，體積、卵泡、黃體與正常對照組無明顯差異，可見各級生長卵泡和較多成熟卵泡，卵泡液豐富，黃體成熟，體積較大。

2.3 對DOR大鼠血清FSH、FSH/LH、E2的影響（1）血清E2：各組大鼠血清E2較正常對照組明顯降低（P＜0.05）；補佳樂組、補腎益沖抗衰湯組E2較模型組明顯增高（P＜0.05），補佳樂組優(yōu)于補腎益沖抗衰湯組（P＜0.05）。（2）血清FSH：模型組較正常對照組明顯增高（P＜0.05）；補佳樂組、補腎益沖抗衰湯組FSH較模型組明顯降低（P＜0.05），補佳樂組、補腎益沖抗衰湯組間無明顯差異（P＞0.05）。（3）FSH/LH：模型組較正常對照組明顯增高（P＜0.05）；補佳樂組、補腎益沖抗衰湯組FSH/LH比值較模型組明顯降低（P＜0.05），補佳樂組、補腎益沖抗衰湯組間無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清FSH、FSH/LH、E2變化（±s）

表1 各組大鼠血清FSH、FSH/LH、E2變化（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與補佳樂組比較，#P＜0.05；E2：雌二醇；FSH：卵泡刺激素；LH：黃體生成素

組別正常對照組模型組補佳樂組補腎益沖抗衰湯組鼠數(shù)10 10 10 10 E2（pg/mL）46.08±1.69 9.81±1.18* 37.34±1.69*△21.51±1.26*△#FSH（mIU/mL）4.64±2.16 9.59±2.17* 6.89±2.86*△6.57±1.88*△FSH/LH 1.80±0.76 3.36±0.82* 2.14±0.57△2.27±0.44△

2.4 對DOR大鼠血清抗苗勒管激素（AMH）、抑制素B（INHB）的影響 與正常對照組比較，各組大鼠血清AMH均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，補佳樂組、補腎益沖抗衰湯組大鼠血清AMH水平明顯增高（P＜0.05）；與補佳樂組比較，補腎益沖抗衰湯組大鼠血清AMH水平明顯增高（均P＜0.05）。與正常對照組比較，模型組INHB水平明顯降低（P＜0.05）；補佳樂組、補腎益沖抗衰湯組INHB水平明顯高于模型組（P＜0.05）；補佳樂組、補腎益沖抗衰湯組間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠血清抗苗勒管激素、抑制素B水平比較（ng/L±s）

表2 各組大鼠血清抗苗勒管激素、抑制素B水平比較（ng/L±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與補佳樂組比較，#P＜0.05

3 討 論

育齡婦女長期服用雷公藤（tripterygium wilfordii hook.f）可造成卵巢功能減退或衰竭[3]。有研究[4]發(fā)現(xiàn)雷公藤對動物卵巢損害的病理結(jié)果與人類更為一致（卵巢組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)卵巢萎縮，各級卵泡減少，間質(zhì)增加，淋巴細胞浸潤等）。我們采用雷公藤多苷片灌胃制造卵巢儲備功能下降的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠毛發(fā)稀疏，無光澤，動情周期延長；卵巢萎縮，形態(tài)改變，色蒼白，卵巢內(nèi)各期卵泡數(shù)減少，閉鎖卵泡增多；黃體脂肪變性；間質(zhì)纖維化；血清FSH、FSH/ LH增高，E2降低[5-6]。模型大鼠表現(xiàn)出與人類DOR相似的一系列改變。因此可以肯定雷公藤可以制造出與人類病理結(jié)果相近的DOR模型。

AMH由竇前卵泡和小竇卵泡的顆粒細胞分泌，有抑制卵泡生長，防止卵泡過快過早耗盡的作用。當原始卵泡募集進入初級卵泡后，卵泡進入對FSH敏感的竇前卵泡時期，F(xiàn)SH刺激卵泡不斷生長，在AMH基因缺失小鼠中發(fā)現(xiàn)，低FSH水平下AMH基因缺失小鼠比對照組有更多的生長卵泡[7]，說明AMH通過降低卵泡對FSH的敏感性而抑制FSH誘導(dǎo)的卵泡生長，從而控制大量竇前或小竇卵泡繼續(xù)生長為優(yōu)勢卵泡。近年研究者分別觀察了高度刺激和自然周期下的卵泡液，發(fā)現(xiàn)AMH是卵母細胞和卵泡發(fā)育潛能的標記物[8]，并可作為卵巢儲備的定性標記。有研究顯示隨著年齡增加，卵巢激素最早變化的是AMH，在女性出生時，外周血幾乎測不到AMH，性成熟后達最高水平，30歲后開始下降[9]，直至絕經(jīng)期消失。La Marca等[10]研究證明，AMH在整個月經(jīng)周期的波動極小，呈相對穩(wěn)定狀態(tài)。這意味著臨床上可以在月經(jīng)周期的任一時期取血檢測AMH水平，從而取消對不孕患者月經(jīng)周期的限制。因此，AMH可以作為預(yù)測卵巢年齡的標志物，更好地反映卵巢的儲備功能。

INHB由卵巢顆粒細胞分泌，對生殖內(nèi)分泌起調(diào)節(jié)作用，INHB可以反饋抑制垂體合成分泌FSH，并抑制促性腺激素釋放激素對自身受體的調(diào)節(jié)作用，還可以通過自分泌/旁分泌調(diào)節(jié)E2的產(chǎn)生[11]。通過對DOR患者的基因測序也發(fā)現(xiàn)，INHB基因的多態(tài)性與DOR的發(fā)生密切相關(guān)并且血清INHB水平下降是較E2水平下降的一個更早期的事件。因此INHB 和FSH、E2一樣可以反映卵巢的功能狀態(tài)并可能成為反映卵巢功能衰退的更敏感的指標。

中醫(yī)認為，腎虛是卵巢功能減退的主要病因病機，血虛、血瘀為該病的主要環(huán)節(jié)，此外亦包括情志因素、生活因素和體質(zhì)因素等[12]。腎為先天之本，主藏精氣，腎中精氣（陰、陽）的盛衰，主宰著人體的生長發(fā)育及生殖功能的成熟和衰退，故腎中精氣充盛，天癸成熟，月經(jīng)來潮而有子，標志著女性卵巢生殖周期活動的開始；腎中精氣衰退，天癸耗竭，月經(jīng)閉絕，提示女性卵巢生殖功能的結(jié)束。張吟等[13]也認為DOR病機以腎氣不足，腎精虧虛為基礎(chǔ)。肝氣郁結(jié)，血行不暢,或氣血不足，沖任不充，血海空虛，胞宮失養(yǎng)，是該病發(fā)生的重要條件。

補腎益沖抗衰湯臨床主要用于腎虛、氣血不足、沖任失養(yǎng)之月經(jīng)稀少、閉經(jīng)、不孕者，即因DOR引起的月經(jīng)失調(diào)等內(nèi)分泌紊亂疾病，有補腎陰腎陽，調(diào)沖任，養(yǎng)血化瘀之功效，方中巴戟天、菟絲子、淫羊藿、鹿角片溫補腎陽是為君藥；臣知母、黃柏滋腎陰、瀉腎火；佐熟地、枸杞子補腎養(yǎng)陰；龜板、鹿角片等血肉有情之品，陰陽共補，意在陰中求陽，陽中求陰，補腎調(diào)沖抑亢；更用靈芝補氣血，抗衰老，山藥、太子參健脾（胃）補腎，意在養(yǎng)心益腎補后天而益先天；當歸、丹參、牛膝、茺蔚子活血和血調(diào)經(jīng)。以上各藥合用，使腎氣腎精充盈，沖任氣血調(diào)和，臟腑平衡則月經(jīng)如期而至，精卵結(jié)合，孕育成胎。有學(xué)者對單味中藥進行深入研究發(fā)現(xiàn)菟絲子、枸杞子等具有雌激素樣活性[14-15]，能促進下丘腦—垂體促性腺功能，提高垂體對促性腺激素釋放激素的反應(yīng)性，增強卵巢功能，改善神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)，具有誘發(fā)排卵作用。藉此推測補腎益沖抗衰湯不僅在宏觀整體上進行辨證調(diào)節(jié)，也使微觀局部功能得以改善。進而闡釋了本實驗中模型大鼠服用補腎益沖抗衰湯后卵巢組織中卵泡數(shù)目增多、血AMH、INHB水平升高、FSH、LH、E2得到改善的原因。卵泡數(shù)目增多，竇卵泡和竇前卵泡分泌AMH增多，降低了卵泡對FSH的敏感性，減少卵泡的過早耗盡；成熟卵泡增多，顆粒細胞分泌INHB增多，INHB反饋抑制垂體合成分泌FSH，增加E2合成，抑制促性腺激素釋放激素對自身受體的調(diào)節(jié)作用，保護卵巢功能，提高卵巢的儲備功能。本研究結(jié)果為臨床治療卵巢儲備功能下降提供了理論依據(jù)和新思路。

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（收稿：2015-10-08 修回：2016-01-11）

Influence of Bushen Yichong Kangshuai Decoction on AMH and INHB of Rats with Diminished OvarianReverse

ZHU Chengfen1,QIU Xiaoxiao1,SHUAI Jun2,CHENG Jing1,CHENG Lei1,ZHU Changling2. 1 Department of Infertility,Wenzhou Zhongshan Hospital,Wenzhou 325000,China;2 Department of Gynecology&Obstetrics,the First Affiliated Hospital of Ningbo University,Ningbo 315000,China

ObjectiveTo observe the influence of Bushen Yichong Kangshuai Decoction（BSYCKSD）on endocrine and anti-Mullerian（AMH）and inhibin B（INHB）expressions of diminished ovarian reserve model rats.MethodsEight-week old 40 healthy female rats as the research object were divided into normal control group, model group,prognova group,BSYCKSD group,with 10 rats in each group.Except for normal control group,tripterygium wilfordii and corresponding medicinewere used to set up diminished ovarian reserve model in rats.The estrous cycle was determined through the observation of vaginal smear.The morphological changes of ovarian tissue was observed by light microscopic.ELISA method was for measuring serum estradiol（E2）,follicle stimulating hormone （FSH）,luteinizing hormone（LH）,AMH and INHB.ResultsIn BSYCKSD group,the estrous cycle of rats lasted 4 to 5d,the development of mature follicles was promoted,and the endocrine levelswas improved compared with model group（E2：21.51±1.26pg/mL vs 9.81±1.18pg/mL;FSH：6.57±1.88mIU/mL vs 9.59±2.17mIU/mL;FSH/LH：2.27±0.44 vs 3.36±0.82;all P＜0.05）and the levels of AMH（114.45±11.11 ng/L vs 100.27±9.17ng/L，P＜0.05）and INHB（56.91±1.74ng/L vs 26.28±6.19ng/L，P＜0.05）were increased.ConclusionBSYCKSD can improve sex hormone levels in rats with diminished ovarian reserve,increase the level of AMH and INHB,and reduce the follicular atresia,resulting in enhancing the reserve function of ovary.

rats;diminished ovarian reserve;Bushen Yichong Kangshuai Decoction;anti-Mullerian;inhibin B

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No.2011ZB143）；浙江省溫州市醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究項目（No.2011B053）；浙江省溫州市鹿城區(qū)科技計劃項目（No.Y12003）

1浙江省溫州中山醫(yī)院不孕不育科（溫州325000）；2寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（寧波 315000）

朱長玲，Tel：18858033268；E-mail：1208302530@qq.com