方海珍,趙立,朱春原

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山東泰安271018

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東泰安271018

辣椒疫霉RxLR19781效應(yīng)分子原核表達(dá)純化及晶體生長(zhǎng)條件的研選

方海珍1,趙立1,朱春原2*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山東泰安271018

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東泰安271018

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）侵染寄主細(xì)胞常分泌RxLR效應(yīng)蛋白分子，效應(yīng)蛋白對(duì)寄主細(xì)胞具干擾或破壞作用。為了深入開展辣椒疫霉RxLR效應(yīng)蛋白分子功能特性機(jī)制的研究，本文利用PCR技術(shù)分離鑒定了辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR19781，以質(zhì)粒pET28a(+)為表達(dá)載體、大腸桿菌Rosetta（DE3）為宿主，利用IPTG誘導(dǎo)RxLR19781蛋白表達(dá)，通過親和層析、離子交換層析及分子篩層析純化獲得高純度蛋白，借助坐滴法培養(yǎng)優(yōu)化獲得RxLR19781蛋白晶體，X射線衍射獲得2.76?的蛋白晶體數(shù)據(jù)，以便解析RxLR19781蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，有助立足RxLR19781蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)探索效應(yīng)分子RxLR19781功能機(jī)制特性，為構(gòu)建新型病害防控策略和培育持久抗病辣椒品種提供理論研究。

辣椒疫霉菌;RxLR;原核表達(dá);純化;晶體生長(zhǎng)

植物病原卵菌主要包括疫霉菌、霜霉菌及腐霉菌，其中疫霉菌有80多種，多數(shù)為重要植物病原菌，侵染寄主植物引起疫霉病發(fā)生與危害，常給農(nóng)業(yè)、林業(yè)和自然生態(tài)造成毀滅性破壞[1]。早期研究發(fā)現(xiàn)，致病疫霉（Phytophthora infestans）[2]和大豆疫霉（Phytophthora sojae）[3]為毀滅性病菌，常引起馬鈴薯晚疫病或大豆疫病爆發(fā)與流行，嚴(yán)重影響了馬鈴薯和大豆的產(chǎn)量與效益。近10余年研究發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）也是一種重要的植物病原卵菌，能侵染茄科（辣椒、番茄）、葫蘆科（黃瓜、南瓜）及豆類等多種農(nóng)作物，引起多種農(nóng)作物疫霉病的發(fā)生與危害，其中辣椒疫霉病頻繁爆發(fā)與流行常給全世界辣椒生產(chǎn)造成巨大的的經(jīng)濟(jì)損失[4]。此外，辣椒疫霉菌可侵染模式植物擬南芥和本氏煙，由此使辣椒疫霉菌成為研究卵菌與寄主互作的重要模式菌[5]。因此，以辣椒疫霉菌為材料，充分利用生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，深入開展辣椒疫霉菌致病流行機(jī)制研究，為研制作物疫病農(nóng)業(yè)防治技術(shù)、化學(xué)防治技術(shù)和培育抗疫病作物新品種提供理論依據(jù)。

近年來，基于若干植物抗病基因及其病菌無(wú)毒基因定位與克隆推動(dòng)了寄主植物-病原菌識(shí)別機(jī)理的認(rèn)識(shí)與理解[6]。隨著對(duì)植物病原菌無(wú)毒基因作用機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)毒基因編碼的蛋白質(zhì)易被寄主植物相應(yīng)的抗病基因識(shí)別，表現(xiàn)無(wú)毒性能，但當(dāng)寄主植物缺乏相應(yīng)抗病基因，使其不被寄主植物予以識(shí)別，表現(xiàn)為毒性性能。

研究發(fā)現(xiàn)，疫霉菌基因組含大量的RxLRs和CRNs效應(yīng)分子，RxLRs和CRNs是植物病原卵菌含有的兩類胞內(nèi)效應(yīng)因子[7-9]。目前，已分離鑒定的植物病原卵菌無(wú)毒基因多數(shù)歸于RxLR效應(yīng)蛋白家族，這類蛋白家族成員數(shù)量繁多、氨基酸序列變化多樣[6]。RxLR效應(yīng)因子N-端多為保守的RxLR基序，該基序負(fù)責(zé)將效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)于宿主細(xì)胞[10,11]，RxLR基序兩側(cè)的30～60個(gè)氨基酸具明顯的保守性，而C-端區(qū)域氨基酸變異性較大，后來的研究發(fā)現(xiàn)該區(qū)域具一定的W、Y、L保守域[12]。隨著更多的植物病原菌全基因組測(cè)序，將會(huì)有越來越多的效應(yīng)因子被預(yù)測(cè)與鑒定。近年來，植物病原菌效應(yīng)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)解析及其蛋白結(jié)構(gòu)功能生物學(xué)研究已成為分子植物病理學(xué)研究的熱點(diǎn)科學(xué)問題，解析具重要功能特性的效應(yīng)蛋白分子三級(jí)結(jié)構(gòu)，利于探明效應(yīng)分子對(duì)寄主細(xì)胞破壞作用或產(chǎn)生免疫防衛(wèi)反應(yīng)的分子機(jī)制，為病害防控或抗病育種提供理論依據(jù)。

近來，除開展有關(guān)植物病原菌效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)解析其調(diào)控寄主細(xì)胞生理變化及其致病分子機(jī)制的信息積累外，還解析了7個(gè)卵菌RxLR效應(yīng)分子結(jié)構(gòu)，分別是AVR3a4、PexRD2、AVR3a11、PexRD54、ATR1、ATR13和Avh5[13-18]，有關(guān)植物病原卵菌效應(yīng)蛋白分子結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究信息積累較少。

辣椒疫霉菌全基因組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉菌中含350余個(gè)候選RxLR效應(yīng)分子[19]，然而以辣椒疫霉菌RxLR效應(yīng)分子為研究對(duì)象，立足基因遺傳操作技術(shù)和蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，開展RxLR效應(yīng)分子對(duì)于辣椒疫霉菌與寄主互作中發(fā)揮調(diào)控作用的研究積累甚少。本研究從辣椒疫霉SD33菌株中克隆鑒定了1個(gè)辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR19781，基于生物信息學(xué)比對(duì)分析，正確預(yù)測(cè)了RxLR19781結(jié)構(gòu)特征，然后立足基因蛋白表達(dá)純化技術(shù)，獲得了高純度蛋白，借助坐滴法優(yōu)化培養(yǎng)獲得RxLR19781蛋白晶體，經(jīng)X-ray衍射收集了一套2.76?的數(shù)據(jù)，為后續(xù)解析該效應(yīng)分子三維結(jié)構(gòu)及其揭示其致病分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

供試?yán)苯芬呙梗≒.capsici）SD33菌株為材料（實(shí)驗(yàn)室保存）；大腸桿菌菌株（Escherichia coli）Rosetta(DE3)購(gòu)買自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)載體pET-28a(+)為Novagen公司產(chǎn)品。

1.2 辣椒疫霉RxLR效應(yīng)分子基因克隆

1.2.1 引物設(shè)計(jì)根據(jù)RXLR19781基因去信號(hào)肽序列和pET-28a特點(diǎn)，采用NCOI和XHOI酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物RxLR19781-F:5’-CATGCCATGGGCCTGTCGACACAAGCTGAC-3’;RxLR1978 1-R:5’-ATAAGAATGCGGCCGCGTAAGGAAGTCCTTTCTTGT-3’，另在下游引物酶切位點(diǎn)后面去掉目的基因終止密碼子以產(chǎn)生融合his標(biāo)簽融合蛋白，引物由上海鉑尚生物有限公司合成。利用Signa lP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)基因信號(hào)肽及其結(jié)構(gòu)特征。

1.2.2 RxLR19781基因PCR擴(kuò)增利用CTAB法提取SD33菌株總DNA[20]，以SD33總DNA為模板，以RxLR19781-F和RxLR19781-R為引物擴(kuò)增RxLR19781基因開放讀碼框。PCR反應(yīng)體系：50mL，含10x EasyTaq Buffer 5mL，dNTP 4mL，引物(10mmol/L)各1mL，模板DNA 2mL，EasyTaq酶0.5mL，無(wú)菌水36.5mL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min，按94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.3 表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收目的條帶，分別用NcoI和NotI雙酶切，回收PCR產(chǎn)物和pET-28a表達(dá)載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用Solution I連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli菌株（DH5α），通過Kana抗性篩選和菌液PCR鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為19781-pET28a，并送鉑尚公司測(cè)序，將測(cè)定序列與JGI上下游基因組中序列進(jìn)行比對(duì)，并分析融合基因表達(dá)的完整性。

1.4 RxLR19781基因原核表達(dá)和蛋白純化

1.4.1 重組質(zhì)粒在宿主菌中表達(dá)將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒19781-pET28a轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于5 mL含Kana的LB培養(yǎng)基中，于37℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，然后取1 mL培養(yǎng)液接種于5 mL新鮮的含Kana的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，用終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，持續(xù)振蕩培養(yǎng)3 h。將1 mL培養(yǎng)液12000 r/min離心1 min，棄掉上清，然后加入40mL的5x樣品緩沖液混勻，100℃加熱5 min變性，12000 r/min離心1 min，取20mL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.2 蛋白表達(dá)條件優(yōu)化在37℃條件下，將含19781-pET28a重組質(zhì)粒的Rosetta(DE3)培養(yǎng)至OD600約為0.6，分別用終濃度為0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9和1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)3 h后取樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳測(cè)定重組蛋白表達(dá)量，確定最佳表達(dá)條件，樣品制備方法同1.4.1.

1.4.3 目的蛋白的大量表達(dá)將含有重組質(zhì)粒19781-pET28a的宿主菌于37℃下振蕩培養(yǎng)5 h，然后按1:100接種至1 L含Kana的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，按上述最佳優(yōu)化條件表達(dá)，冷卻至16℃，添加IPTG至最適濃度，培養(yǎng)20 h，8000 r/min離心5 min收集菌體用于蛋白純化。

1.4.4 融合蛋白的純化將菌體重懸于50 mL裂解緩沖液（20 mmol/L Tris-Hcl pH8.5，150 mmol/L Nacl）中，加入10%甘油和0.5%吐溫-20，超聲破碎細(xì)胞，4℃14000 r/min離心30 min后，去除細(xì)胞碎片。將上清液轉(zhuǎn)至一個(gè)燒杯中掛柱。鎳柱預(yù)先用bufferA(20 mmol/L Tris-Hcl pH8.5，150 mmol/L Nacl，40 mmol/L咪唑)平衡，掛完柱后，用400 mL bufferA洗雜蛋白，再用buffer B(20 mmol/L Tris-Hcl pH8.5，150 mmol/L Nacl，200 mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白，然后用10KD截留量濃縮管，濃縮至50 mL以內(nèi)。離子交換柱預(yù)先用buffer C(20 mmol/L Tris-Hcl pH8.5，150 mmol/L Nacl)和buffer D(20 mmol/L Tris-Hcl pH8.5，600 mmol/L Nacl)平衡，濃縮的蛋白上樣，收集主要目標(biāo)蛋白峰，將收集的蛋白繼續(xù)濃縮至1 mL以內(nèi)，分子篩預(yù)先用buffer C平衡，將再次濃縮的蛋白上樣，收集主要目標(biāo)峰蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)純度，并將蛋白用液氮保存于-80℃下保存，以備培養(yǎng)晶體使用。

1.5 蛋白晶體培養(yǎng)

蛋白晶體生長(zhǎng)條件篩選，采用坐滴氣象擴(kuò)散法，初次篩選采用Hampton Research Crystal ScreenⅠ、Crystal ScreenⅡ、Salt RxTM1、PEG/lon Screen TM、PEG/lon 2 Screen TM、Index TM和Natrix TM蛋白晶體生長(zhǎng)試劑盒進(jìn)行蛋白晶體篩選。采用48孔培養(yǎng)板，池液180mL，蛋白液和池液以1:1比例混合，用膠帶密封，置于16℃晶體培養(yǎng)箱，1周后于顯微鏡下觀察晶體生長(zhǎng)情況，挑取已有的目的蛋白晶體，用液氮凍存，進(jìn)行初步的X射線衍射分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒疫霉RxLR19781基因克隆及基因序列結(jié)構(gòu)分析

辣椒疫霉RxLR19781基因序列分析如（圖1），該基因全長(zhǎng)366 bp，編碼121個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為13.8KD。生物信息學(xué)分析表明，該基因氨基酸序列信號(hào)肽長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸，其后為保守的RxLR-dEER序列。以基因組DNA為模板，用引物RxLR19781-F和RxLR19781-R擴(kuò)增該基因去信號(hào)肽部分編碼區(qū)序列，電泳檢測(cè)結(jié)果（圖2），表明擴(kuò)增產(chǎn)物為303 bp，與基因組中RxLR19781基因去信號(hào)肽部分大小一致。

2.2 RxLR19781蛋白表達(dá)

將PCR產(chǎn)物回收，用Nco I和Not I雙酶切并克隆到原核表達(dá)載體pET-28a，陽(yáng)性克隆命名為19781-pET28a。以RxLR19781-F和RxLR19781-R為引物，用含有19781-pET28a重組質(zhì)粒菌落PCR擴(kuò)增約303 bp的特異性條帶（圖3），進(jìn)行測(cè)序鑒定。利用DNAman軟件進(jìn)行序列比對(duì)，表明測(cè)序結(jié)果正確，原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

重組質(zhì)粒19781-pET28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3），通過對(duì)不同誘導(dǎo)劑濃度等表達(dá)條件優(yōu)化，結(jié)果顯示在16℃條件下，經(jīng)0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)宿主菌于11 KD處有大量蛋白表達(dá)（圖4）。

圖1 辣椒疫霉效應(yīng)分子RxLR19781氨基酸序列Fig.1 Amino-acid sequence of Phytophthora capsici effector RxLR19781

圖2 RxLR19781基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of RxLR19781

圖3 菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒Fig.3 PCR analysis of recombinant plasmid 19781-pET28a

2.2 RxLR19781融合蛋白純化及SDS-PAGE檢測(cè)

RxLR19781融合蛋白大量表達(dá)后收集菌體，按方法1.4.4進(jìn)行鎳柱親和層析，各個(gè)階段分別取樣并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)（圖5）。蛋白經(jīng)層析柱Q柱層析后形成1個(gè)峰（圖6），經(jīng)層析柱Superdex 200 Increase 10/300 GL層析后形成一個(gè)單峰（圖7），收集單峰蛋白并濃縮至10 mg/mL，用于檢測(cè)和晶體優(yōu)化生長(zhǎng)。離子柱和分子篩層析后，分部收集的蛋白用SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示蛋白分子量為13 KD（圖8），與理論分子量基本一致，其純度為95%。

圖4 重組蛋白19781-His在Rosetta（DE3）中的表達(dá)Fig.4 SDS-PAGE analysis for the expression of 19781-His in Rosetta(DE3)

圖5 RxLR19781蛋白經(jīng)鎳柱純化后的SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGE of the purification of the protein RxLR19781 using the Ni-column

圖6 RxLR19781蛋白離子交換層析純化Fig.6 Purification of RxLR19781protein with Ion exchange exclusion chromatography

圖7 RxLR19781蛋白分子篩層析純化 chromatography Fig.7 Purification of RxLR19781 by size

圖8 RxLR19781蛋白經(jīng)Q柱、分子篩純化后的SDS-PAGE電泳Fig.8 SDS-PAGE of the purification of the protein RxLR19781 using the Q column and size exclusion chromatography

2.3 RxLR19781蛋白晶體篩選及衍射數(shù)據(jù)收集

收集分子篩層析洗脫獲得的目的蛋白，濃縮并進(jìn)行晶體初篩，采用坐滴法16℃生長(zhǎng)1周后，可觀察到晶體生長(zhǎng)（圖9），晶體生長(zhǎng)條件：0.03 M Citric acid，0.07 M BIS-TRIS propane/pH 7.6，20% PEG3350。然后將晶體送上海同步輻射光源進(jìn)行了X衍射及數(shù)據(jù)收集和初步處理（圖10）。目前由于還缺乏該蛋白晶體的相位信息，后續(xù)正在試圖進(jìn)行該蛋白的硒代衍生物制備，以期獲得衍射效果好的硒代蛋白晶體，并有望最終解析其三維結(jié)構(gòu)。

圖9 RxLR19781蛋白晶體Fig.9 The crystals of the protein RxLR19781

圖10 RxLR19781晶體X射線衍射圖Fig.10 X-ray diffraction of the RxLR19781 crystals

3 討論

本研究選取了辣椒疫霉全基因組1個(gè)RxLR效應(yīng)蛋白分子，該基因在辣椒疫霉全基因組中序列號(hào)為19781，由此將其命名為RxLR19781。本研究從參試?yán)苯芬呙咕鶶D33克隆鑒定了RxLR19781基因，然后進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，獲得高純度蛋白，晶體優(yōu)化培養(yǎng)，獲得高質(zhì)量的晶體，綜合分析本研究實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，目的蛋白純度大于90%以上，適宜進(jìn)行晶體篩選，并利于成功獲得蛋白晶體。本研究結(jié)果對(duì)后續(xù)開展硒代蛋白晶體培養(yǎng)，以及X射線衍射分析提供了可靠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)準(zhǔn)備。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的晶體優(yōu)化和硒代培養(yǎng)，有望解析其全長(zhǎng)三維結(jié)構(gòu)，預(yù)期利于立足RxLR19781蛋白三維結(jié)構(gòu)，深入探討辣椒疫霉效應(yīng)分子蛋白與辣椒寄主互作的分子機(jī)制，從而為設(shè)計(jì)植物抗疫病策略奠定理論基礎(chǔ)。

盡管辣椒疫霉常危害茄科、葫蘆科等多種作物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失，并且已有若干相關(guān)研究積累，但目前對(duì)其致病分子機(jī)制了解甚少。普遍認(rèn)為，在侵染過程中，疫霉通過表達(dá)一系列的效應(yīng)分子（如CRN、RxLR等）對(duì)寄主防衛(wèi)機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，以成功侵染和定殖[21]，但目前關(guān)于這些效應(yīng)分子的表達(dá)模式、功能和作用機(jī)制的研究尚待深入。

近年來卵菌RxLR效應(yīng)蛋白與植物互作機(jī)理研究，已逐漸成為分子植物病理學(xué)研究熱點(diǎn)科學(xué)問題，通過解析RxLR蛋白三維結(jié)構(gòu)，立足蛋白三維結(jié)構(gòu)特性，深入開展其功能機(jī)制研究，預(yù)期有望探明辣椒疫霉與植物互作的分子機(jī)制。因此，針對(duì)性的開展卵菌效應(yīng)蛋白表達(dá)、純化，獲得高純度蛋白及其晶體培養(yǎng)，獲得高較高質(zhì)量的晶體，為真正意義上解析其三級(jí)結(jié)構(gòu)提供重要的技術(shù)準(zhǔn)備，預(yù)期結(jié)果對(duì)于深入開展效應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)具有重要的意義。

[1]Dou DL,Kale SD,Wang XL,et al.Conserved C-Terminal Motifs Required for Avirulence and Suppression of Cell Death by Phytophthora sojae effectorAvr1b[J].Plant Cell,2008,20:1118-1133

[2]Ristaino JB,Groves CT,Parra GR.PCR amplification of the Irish potato famine pathogen from historic specimens[J]. Nature,2001,411(6838):695-697

[3]Tyler BM.Genetics and genomics of the oomycete host interface[J].Trends in Genetics,2001,17(11):611-614

[4]Lamour KH,Stam R,Jupe J,et al.The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici[J].Molecular plant Pathology,2012,13(4):329-337

[5]Wang Y,Bouwmeester K,Van de Mortel JE,et al.A novel Arabidopsis-oomycete pathosystem:differential interactions with Phytophthora capisici reveal a role for camalexin,indole glucosinolates and salicylic acid in defence[J].Plant Cell and Environment,2013,36(6):1192-1203

[6]顧彪.植物病原卵菌和真菌效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012

[7]Tyler BM,Tripathy S,Zhang XM,et al.Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis[J].Science,2006,313:1261–1266

[8]Haas BJ,Kamoun S,Zody MC,et al.Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans[J].Nature,2009,461:393-398

[9]Lamour KH,Mudge J,Gobena D,et al.Genome sequencing and mapping reveal loss of heterozygosity as a mechanism for rapid adaptation in the vegetable pathogen Phytophthora capsici[J].Mol Plant Microbe Interact,2012,25:1350-1360

[10]Dou DL,Kale SD,Wang X,et al.RXLRmediated entry of Phytophthora sojae effector Avr1b into soybean cells does not require pathogen-encoded machinery[J].Plant Cell,2008,20:1930-1947

[11]Whisson SC,Boevink PC,Moleleki L,et al.A translocation signal for delivery of oomycete effector proteins into host plant cells[J].Nature,2007,450:115-118

[12]Win J,Morgan W,Bos J,et al.Adaptive evolution has targeted the C terminal domain of the RxLR effectors of plant pathogenic Oomycetes[J].Plant Cell,2007(19):2349-2369

[13]Boutemy LS,King SR,Win J,et al.Structures of Phytophthora RXLR Effector Proteins:a conserved but adaptable fold underpins functional diversity[J].J Biol Chem 2011,286:35834-35842

[14]Yaeno T,Li H,Chaparro-Garcia A,et al.Phosphatidy linositol monophosphate-binding interface in the oomycete RXLR effector AVR3a is required for its stability in host cells to modulate plant immunity[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2011,108:14682-14687

[15]Maqbool A,Hughes RK,Dagdas YF,et al.Abbas Maqbool Structural Basis of HostAutophagy-related Protein 8(ATG8) Binding by the Irish Potato Famine Pathogen Effector Protein PexRD54[J].J Biol Chem,2016,291(38):20270-20282

[16]Chou S,Krasileva KV,Holton JM,et al.Hyaloperonospora arabidopsidis ATR1 effector is a repeat protein with distributed recognition surfaces[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108:13323-13328

[17]Leonelli L,Pelton J,Schoeffler A,et al.Structural elucidation and functional characterization of the Hyaloperonospora arabidopsidis effector protein ATR13[J].PLoS Pathog,2011,7:e1002428

[18]Sun FR,Kale SD,Azurmendi HF,et al.Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry[J].Mol.Plant-Microbe Interact,2013,26(3):330-344

[19]Lamour KH,Mudge J,Gobena D,et al.Genome sequencing and mapping reveal loss of heterozygosity as a mechanism for rapid adaptation in the vegetable pathogen Phytophthora capsici[J].Mol.Plant-Microbe Interact,2012,25:1350-1360

[20]Feng BZ,Li PQ.Molecular characterization and functional analysis of Nep1-like protein-encoding gene from Phytophthora capsici[J].Genetics and Molecular Research,2013,12(2):1468-1478

[21]Kamoun S.A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes[J].Annual Review of Phytopathology, 2006,44:41-60

Study on the Expression,Purification and Crystal Growth of RxLR19781 from Phytophthora capsici

FANG Hai-zhen1,ZHAO Li1,ZHU Chun-yuan2*
1.College of Plant Protection/Shandong Agricultural University,Taian 271018,China
2.College of Life Sciences/Shandong Agricultural University,Taian 271018,China

Phytophthora capsici secrete large amounts of RxLR effectors to interfere with host plant cell physiology. However,their functions and molecular mechanisms in the interactions of oomycetes with host plants remain obscure.To understand the roles of these RxLR effectors in the interactions between P.capsici and its host plants,the gene RxLR19781 was cloned into pET-28a and expressed with IPTG in Rosetta(DE3).The target protein was purified through using a three-steps purification strategy including nicked affinity,Ion exchange chromatography(IEC)and size exclusion chromatography(SEC).The high purify protein and well-diffracted crystals were obtained,which laid a foundation for the analysis of the structure.The crystals were obtained by sitting drop method and we obtained 2.7 6? diffraction data using X-ray.Elucidation of the structure of oomycete and fungal effector proteins and their roles in disease development will offer novel opportunities to understand how the pathogens manipulate host cells to establish a parasitic relationship and how to develop durable disease control measures.

Phytophthora capsici;RxLR;expression;purification;crystal growth

S436.418.1+2

A

1000-2324(2016)06-0801-06

2016-05-11

2016-08-20

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(31500121);山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(BS2015SW009)

方海珍(1992-),女,在讀碩士研究生,研究方向:植物病原真菌學(xué)和真菌資源利用.E-mail:934955400@qq.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:zhuchunyuan@sdau.edu.cn