何艷霞，向詩(shī)非，李澆，何金蕾，張俊榮，袁冬梅，秦翰霄，陳達(dá)麗*，陳建平*

(1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，四川成都610041; 2.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，湖北恩施445000; 3.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，湖北恩施445000)

基于16S rRNA和rpoB基因的分子系統(tǒng)發(fā)育分析在銅綠假單胞菌鑒定中的應(yīng)用

何艷霞1，2，向詩(shī)非3，李澆1，何金蕾1，張俊榮1，袁冬梅1，秦翰霄1，陳達(dá)麗1*，陳建平1*

(1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，四川成都610041; 2.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室，湖北恩施445000; 3.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，湖北恩施445000)

為對(duì)比16S rRNA和rpoB基因分子系統(tǒng)發(fā)育分析與傳統(tǒng)表型分類法對(duì)銅綠假單胞菌的鑒定，評(píng)估16S rRNA和rpoB基因序列分析在銅綠假單胞菌鑒定中的應(yīng)用，用表型分類方法對(duì)臨床自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為銅綠假單胞菌的23株分離株進(jìn)行再鑒定，PCR擴(kuò)增23株分離株16S rRNA和rpoB基因片段，并測(cè)序進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，表型再鑒定結(jié)果與自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果一致。基于兩個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析均顯示分離株p22與不動(dòng)桿菌屬序列聚為一枝，其余22株分離株與銅綠假單胞菌序列聚為一枝。因此p22應(yīng)鑒定為不動(dòng)桿菌，16S rRNA和rpoB基因序列分析均能準(zhǔn)確鑒定銅綠假單胞菌并能較好建立假單胞菌屬內(nèi)種間關(guān)系。

銅綠假單胞菌;16S rRNA;rpoB

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)廣泛分布于自然界，是一種條件致病菌，可感染人體的任何部位和組織，出現(xiàn)局部化膿性炎癥。銅綠假單胞菌也廣泛分布于醫(yī)院環(huán)境，在醫(yī)院感染病例中，由銅綠假單胞菌引起的醫(yī)院感染占據(jù)首位［1］。銅綠假單胞菌耐藥性強(qiáng)，耐藥譜廣，隨著多藥耐藥菌株的出現(xiàn)，尤其是對(duì)7種以上或所有抗生素全部耐藥的泛耐藥株的出現(xiàn)，銅綠假單胞菌常使臨床醫(yī)生陷入無(wú)藥可用的境地。假單胞菌屬自1894年建立以來，其菌種數(shù)目在不斷增加，并且隨分類方法的改善，其分類體系不斷被修正，目前，假單胞菌屬已成為革蘭陰性菌中菌種數(shù)量最多的屬。不同的菌種作用于不同種類的生物，具有不同的致病特性，準(zhǔn)確而快速地鑒定出對(duì)人類有嚴(yán)重危害的銅綠假單胞菌，對(duì)盡早控制銅綠假單胞菌感染及預(yù)防銅綠假單胞菌耐藥株的擴(kuò)散具有非常重要的意義。醫(yī)院常采用瓊脂平板培養(yǎng)法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)，其鑒定系統(tǒng)是基于生化試驗(yàn)做出的鑒定，結(jié)果并不十分可靠［2-3］。近30年來，分子生物學(xué)技術(shù)被越來越多地應(yīng)用于重要病原菌的鑒定。16S rDNA是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA的基因序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因組中，由于其在進(jìn)化過程中高度保守，又具有相對(duì)的獨(dú)特性，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定［4-5］。rpoB基因編碼DNA依賴的RNA聚合酶β亞單位，是一個(gè)高度保守的管家基因，也常被用作細(xì)菌鑒定的標(biāo)示基因和系統(tǒng)發(fā)育分析的位點(diǎn)，在假單胞菌的鑒定中經(jīng)常被用到［6-8］。本研究對(duì)23株銅綠假單胞菌臨床分離株進(jìn)行16S rRNA及rpoB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)比臨床常用的基于生化試驗(yàn)的分類方法，評(píng)估這兩個(gè)基因?qū)﹁b定銅綠假單胞菌的意義，并為臨床鑒定提供指導(dǎo)意見。

1 材料與方法

1.1 材料

23株銅綠假單胞菌分離自2014年3月至6月間湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院和湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院病人痰液、膿液、支氣管肺泡灌洗液等標(biāo)本。菌株在醫(yī)院檢驗(yàn)科經(jīng)分離培養(yǎng)，并經(jīng)全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK 32(BioMerieus，Inc.，MarayI’Etoil，F(xiàn)rance)鑒定為銅綠假單胞菌(可能概率＞99.0%)，所有菌株均具有必需的生化試驗(yàn)特征(結(jié)果見表1)。綠膿桿菌生化鑒定盒購(gòu)自廣東環(huán)凱公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自北京天根公司，2×Taq Master Mix購(gòu)自上海欣百諾公司。PCR引物合成和測(cè)序均由成都擎科公司完成。

表1 所有臨床分離株生化反應(yīng)結(jié)果列表Table 1The list of biochemical characteristics for all clinical isolates

續(xù)表1

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)、再鑒定及DNA提取23個(gè)臨床分離株均分別接種于LB平板、麥康凱平板、血平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，并用綠膿桿菌生化鑒定盒進(jìn)行補(bǔ)充生化鑒定。DNA提取按照試劑盒操作流程進(jìn)行。

1.2.2 PCR擴(kuò)增對(duì)23個(gè)分離株進(jìn)行16S rRNA基因和rpoB基因PCR擴(kuò)增。16S rRNA基因擴(kuò)增選用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')［9］。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括上、下游引物各0.4 μmol/L，模板2 μL，2×Taq Master Mix 25 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延長(zhǎng)2 min，共30個(gè)循環(huán);72℃終末延長(zhǎng)5 min。rpoB基因擴(kuò)增選用上游引物5'-GGCGAAATGGCWGAGAACCA-3'，下游引物5'-GAGTCTTCGAAGTTGTAACC-3'［10］。PCR反應(yīng)體系同前，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s，50℃退火30 s，72℃延長(zhǎng)1 min，共30個(gè)循環(huán);72℃終末延長(zhǎng)5 min。所有PCR產(chǎn)物均通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 基因測(cè)序及分子系統(tǒng)發(fā)育分析按照產(chǎn)品說明書推薦操作，對(duì)23株臨床分離株的16S rRNA基因和rpoB基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，送成都擎科公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)校正后上傳GenBank。將新獲得序列在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，了解在GenBank中與其同源性較高的序列情況。從GenBank下載假單胞菌屬及其他相關(guān)屬16S rRNA基因和rpoB基因參考序列各43條，在表3中列出，Pragiafontium為外類群，與新獲序列進(jìn)行比對(duì)研究。采用軟件CLUSTAL X分別對(duì)16S rRNA基因和rpoB基因序列進(jìn)行多序列匹配排列，采用軟件MEGA 4.0對(duì)排列矩陣進(jìn)行微調(diào)，用MrBayes v3.2進(jìn)行貝葉斯分析，矩陣最優(yōu)數(shù)據(jù)模型通過Modeltest 3.7選擇獲得，貝葉斯分析結(jié)果使用軟件FigTree v1.4.2查看。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌再鑒定

2.1.1 培養(yǎng)特征該23株分離株在LB培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好，菌落扁平、濕潤(rùn)，培養(yǎng)基呈亮綠色。在麥康凱平板上的表現(xiàn)有4種:形成典型的灰綠色具金屬光澤的菌落;圓形凸起的灰白色半透明似大腸埃希菌菌落;光滑凸起成粘液狀的粘液性菌落;中央凸起、邊緣扁平、表面粗糙的粗糙性菌落。在血平板上可見透明溶血環(huán)。

2.1.2 革蘭染色及形態(tài)特征經(jīng)革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，23株銅綠假單胞菌均為革蘭染色陰性，桿菌，長(zhǎng)短不一，單獨(dú)、成雙或短鏈狀排列，無(wú)芽胞，有莢膜。

2.1.3 生化反應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室再鑒定中，23株臨床分離株具有相同生化反應(yīng)結(jié)果，見表2。該結(jié)果支持醫(yī)院做出的銅綠假單胞菌的鑒定。

表2 所有臨床分離株補(bǔ)充生化反應(yīng)結(jié)果列表Table 2The list of supplementarybiochemical characteristics for all clinical isolates

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 基于16S rRNA基因的分子系統(tǒng)發(fā)育分析23株分離株均擴(kuò)增出約1 500 bp大小的16SrRNA基因片段，測(cè)序獲得的序列存儲(chǔ)于Gen-Bank，其編號(hào)為KU372980～KU373002(見表3)。p22的16S rRNA序列比對(duì)與不動(dòng)桿菌未定種(Acinetobacter sp.)ADP1基因組序列同源性最高(99%)，其次是鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)AC29(98%)，其余22株序列(p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8、p9、p10、p11、p12、p13、p15、p16、p18、p20、p23、p24、p25、p26、p27，以下簡(jiǎn)稱22株)與銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) F22031基因組序列同源性最高(99%或100%)。Modeltest獲得的最優(yōu)數(shù)據(jù)模型為GTR+I+G。對(duì)16S rRNA數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行貝葉斯分析，構(gòu)建的進(jìn)化樹中(圖1)可見所有假單胞菌屬序列以及2個(gè)固氮菌屬序列聚成一枝Clade I，其后驗(yàn)概率(posterior probability)為1.0。22株臨床分離株與銅綠假單胞菌聚成Clade I中的一個(gè)亞枝A，其后驗(yàn)概率為0.95。另一個(gè)分離株p22則與不動(dòng)桿菌屬序列聚成一枝Clade II，后驗(yàn)概率為1.0。

表3 用于16S rRNA和rpoB分析的種、株及GenBank登錄號(hào)Table 3List of analyzed species，strains and the GenBank accession number for 16S rRNA and rpoB

續(xù)表3

圖1 分離菌株與GenBank中相關(guān)菌株的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.116S rRNA phylogenetic tree of Pseudomonas strains from this study and GenBank進(jìn)化樹采用MrBayes v3.2軟件進(jìn)行貝葉斯分析獲得，cut-off值為50%，節(jié)點(diǎn)處為貝葉斯后驗(yàn)概率，下圖同The 50%majority-rule consensus tree inferred from Baysain inference using MrBayes v3.2.Bayesian posterior probabilities were show at nodes，same the follow

圖2 分離菌株與GenBank中相關(guān)菌株的rpoB系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2rpoB phylogenetic tree of Pseudomonas strains from this study and GenBank

2.2.2 基于rpoB基因的分子系統(tǒng)發(fā)育分析23株分離株均擴(kuò)增出約980 bp大小的rpoB基因片段，測(cè)序獲得的序列存儲(chǔ)于GenBank，其編號(hào)為KU373003～KU373025(見表3)。p22的rpoB序列比對(duì)與不動(dòng)桿菌未定種(Acinetobacter sp.) ADP1基因組序列同源性最高(88%)，其次是鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)6411(同源性84%)，其余22株序列與銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)213BR基因組序列同源性最高(99%或100%)。Modeltest獲得的最優(yōu)數(shù)據(jù)模型為TIM+I+G。在rpoB數(shù)據(jù)矩陣構(gòu)建的貝葉斯樹中(圖2)，所有假單胞菌屬序列以及2個(gè)固氮菌屬序列聚成一枝Clade I，其后驗(yàn)概率為1.0。22株分離株與銅綠假單胞菌聚成Clade I中的一個(gè)亞枝A，后驗(yàn)概率(posterior probability)為1.0。另一個(gè)分離株p22則與不動(dòng)桿菌屬序列聚成一枝Clade II，后驗(yàn)概率為0.99。

3 討論

傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定主要依靠對(duì)細(xì)菌表型特征的觀察，如菌落形態(tài)、染色后鏡下形態(tài)、生化特征等。自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)是將傳統(tǒng)的生化鑒定試劑微型化，制成干燥的微型鑒定試劑板條，采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)原理的編碼鑒定方法，結(jié)合現(xiàn)代電子技術(shù)而形成的一種鑒定方法［11］。其應(yīng)用簡(jiǎn)便、快速，但鑒定系統(tǒng)的準(zhǔn)確性受到系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)覆蓋范圍的影響，由于微生物分類在不斷變化，使得一些鑒定系統(tǒng)在使用一段時(shí)間后與新的分類系統(tǒng)逐漸發(fā)生偏差，準(zhǔn)確率下降。相近屬的細(xì)菌其生化特征亦較相似，這同樣影響鑒定的準(zhǔn)確率。來自接受抗生素治療病人的分離株，其生化特性可能有所改變，鑒定結(jié)果也可能被影響［11］。

16S rRNA和rpoB基因已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分子分類及鑒定研究?；?6S rRNA的分析被普遍認(rèn)為能鑒定細(xì)菌至屬水平，而不能解決近緣種之間的分類問題［12-13］。rpoB基因表現(xiàn)出比16S rRNA更大的優(yōu)越性。Marianelli等［14］通過對(duì)布魯氏菌rpoB基因的研究，認(rèn)為rpoB基因能用于鑒定所有的布魯氏菌種及大部分的生物變種。Mollet等［15］通過對(duì)腸桿菌科14個(gè)種的細(xì)菌的16S rRNA和rpoB基因的研究，認(rèn)為rpoB基因部分序列能準(zhǔn)確鑒定腸道細(xì)菌。Adékambi等［16］認(rèn)為，rpoB基因測(cè)序能準(zhǔn)確反映細(xì)菌的G+C%含量，DNA-DNA雜交水平及平均核苷酸同源性(2個(gè)菌株共享的全基因組序列的比例)，能在種和亞種水平解決細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，可作為一個(gè)強(qiáng)有力的臨床微生物鑒定工具。16S rRNA和rpoB基因分析的這種差異可能是因?yàn)?6S rRNA基因分子結(jié)構(gòu)高度保守且在許多細(xì)菌基因組中有多個(gè)拷貝［17］，因而確定其序列的準(zhǔn)確性降低，而管家基因rpoB則只具有單一拷貝［18］，且不同菌株rpoB基因變異程度明顯高于16S rRNA［15］。

本研究中，23株臨床分離株被自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為銅綠假單胞菌，在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行再鑒定時(shí)，該23株菌在培養(yǎng)特性、形態(tài)特征、生化特征等方面均符合銅綠假單胞菌的特點(diǎn)，與臨床鑒定結(jié)果相一致。但經(jīng)進(jìn)一步的基因分析，分離株p22分析結(jié)果明顯不同于臨床鑒定結(jié)果，其與不動(dòng)桿菌屬更為接近。

p22的16S rRNA和rpoB基因序列在Gen-Bank中進(jìn)行Blast比對(duì)時(shí)，其同源性最高的序列為不動(dòng)桿菌，且在16S rRNA和rpoB數(shù)據(jù)矩陣構(gòu)建的貝葉斯樹中，p22均與不動(dòng)桿菌屬序列聚成一枝，而其余22株分離株則均與銅綠假單胞菌序列聚成一枝。在2棵貝葉斯樹中，p22均未有高的后驗(yàn)概率支持與某種不動(dòng)桿菌聚為一枝，且Clade II枝中各單倍型相距較遠(yuǎn)(分析結(jié)果未在資料中顯示)，無(wú)法構(gòu)建有意義的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖以確認(rèn)p22與該枝中各種的親緣遠(yuǎn)近關(guān)系。由此，p22鑒定為不動(dòng)桿菌(種未定)更為準(zhǔn)確。

在本研究中，基于16S rRNA和rpoB的貝葉斯樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)高度相似，22株分離株序列及下載的5個(gè)銅綠假單胞菌序列被高的后驗(yàn)概率支持聚為一枝，且假單胞菌屬內(nèi)種間關(guān)系清晰，表明16S rRNA和rpoB基因在假單胞菌屬系統(tǒng)發(fā)育研究中均能較準(zhǔn)確反映種間關(guān)系。在此，rpoB基因并未表現(xiàn)出對(duì)16S rRNA的明顯優(yōu)勢(shì)，這可能是假單胞菌屬內(nèi)最近為種間關(guān)系，而rpoB基因在親緣關(guān)系更近的菌株鑒定中優(yōu)勢(shì)更為突出有關(guān)［16］。

zen等［19］曾用基于基因組序列的3種方法研究棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)與假單胞菌屬的關(guān)系，結(jié)果均顯示棕色固氮菌與假單胞菌屬高度相似，表明固氮菌實(shí)際應(yīng)屬于假單胞菌。本研究基于16S rRNA和rpoB的貝葉斯樹中，2個(gè)固氮菌序列均與假單胞菌屬序列聚為一枝，再一次肯定了zen等的研究。

本研究對(duì)臨床分離的23個(gè)菌株用傳統(tǒng)表型分類方法和DNA測(cè)序分析進(jìn)行了再鑒定，傳統(tǒng)表型分類方法鑒定23株均為銅綠假單胞菌，16S rRNA和rpoB基因序列分析鑒定22株分離株為銅綠假單胞菌，分離株p22應(yīng)為不動(dòng)桿菌。16S rRNA和rpoB基因能準(zhǔn)確鑒定銅綠假單胞菌臨床分離株，并能較準(zhǔn)確建立假單胞菌屬種間關(guān)系。

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Molecular Phylogeny Analysis Based on 16S rRNA and rpoB Sequences for Identification of Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa

HE Yan-xia1，2，XIANG Shi-fei3，LI Jiao1，HE Jin-lei1，ZHANG Jun-rong1，YUAN Dong-mei1，QIN Han-xiao1，CHEN Da-li1，CHEN Jian-ping1
(1.Teach.＆Res.Div..of Parasitol.，W.China Schl.of Basic＆Forensic Med.，Sichuan Uni.，Chengdu 610041;2.Teach.＆Res.Div.of Parasitol.，Coll.of Med.，Hubei coll.for Minority Nationalities，3.Affil.Minda Hosp.，Hubei Uni.for National＇s，Enshi 445000)

16S rRNA and rpoB gene sequence analysis to identify of Pseudomonas aeruginosa was compared with conventional phenotypic methods to evaluate the application of 16S rRNA and rpoB sequence analysis to identify P.aeruginosa;23 isolated strains that were re-characterized with phenotypic classification method that was identified as P.aeruginosa by clinical automatic microbial identification system.16S rRNA and rpoB gene fragments were amplified with PCR and sequenced for molecular phylogenic analysis.The results showed that the re-characterized results were consistent with those characterized with automatic microbial identification system.Using Bayesian phylogenetic analyses based on 16S rRNA and rpoB genes，22 isolates are characterized as P.aeruginosa，whereas one isolate，p22，was classified as Acinetobacter sp.p22 should be identified as Acinetobacter sp.16S rRNA and rpoB genes can accurate identify P.aeruginosa and could fairly establish the interspecific relation within the genus of Pseudomonas.

Pseudomonas aeruginosa;16S rRNA;rpoB

Q939.11+2

A

1005－7021(2016)04－0027－09

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.005

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572240，81171607，J1103604);四川大學(xué)與瀘州市合作項(xiàng)目(2013CDLZ-S16)

何艷霞女，講師，博士研究生。研究方向?yàn)榉肿硬≡飳W(xué)。E-mail:49300492@qq.com

*通訊作者。陳達(dá)麗女，副教授，博士。研究方向?yàn)椴≡b定及分子系統(tǒng)發(fā)育。E-mail:cdl1978119@sina.com陳建平男，教授，博士，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)榉肿硬≡飳W(xué)。E-mail:jpchen007@163.com

2016-01-07;

2016-06-19