吳 偉，張 云，向 福(1.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃州 438000； .湖北理工學院 醫(yī)學院，湖北 黃石 435003； 3.黃岡師范學院 生命科學學院，湖北 黃州 438000)

響應面法優(yōu)化龍葵皂苷類成分的提取工藝

吳 偉1,2，張 云2，向 福1,3*
(1.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃州 438000； 2.湖北理工學院 醫(yī)學院，湖北 黃石 435003； 3.黃岡師范學院 生命科學學院，湖北 黃州 438000)

為了探討龍葵皂苷類成分最佳提取工藝，科學開發(fā)利用大別山區(qū)龍葵資源，采用單因素試驗優(yōu)化乙醇體積分數(shù)、提取時間、提取溫度、料液比和提取次數(shù)等關鍵影響因素，并以龍葵皂苷提取率為響應值設計響應面優(yōu)化試驗優(yōu)化大別山龍葵中皂苷類成分的提取工藝。結果表明，最佳提取條件為：乙醇體積分數(shù)88%，提取時間4.5 h，料液比1∶15(g/mL)，提取溫度70 ℃，提取次數(shù)3次。在此條件下進行3次驗證試驗，龍葵皂苷提取率的平均值為2.489 8%，與回歸方程得出的理論數(shù)值2.505 3%基本相符。

龍葵； 皂苷； 提?。?響應面分析

大別山區(qū)獨特的地理位置和良好的氣候環(huán)境使其自古以來都是藥材資源基地，也是全國的中藥材重點產區(qū)之一。其中，地處大別山區(qū)的羅田縣中藥資源尤其豐富。龍葵為茄科1年生草本植物，在羅田縣分布較為廣泛，其干燥地上部分可入藥，在傳統(tǒng)的中醫(yī)藥中，龍葵主要與其他中藥配伍用于各種腫瘤的治療[1]。據(jù)文獻報道，龍葵合劑對于原發(fā)性肝癌[2-4]、晚期胃癌[5]、肺癌[6-7]等癌癥具有確切的療效。此外，龍葵還用于治療慢性前列腺炎[8-10]、高血壓[11]、支氣管炎[12]、血尿[13-14]、功血和崩漏[15-16]等疾病。龍葵中含有多種藥用成分，例如甾體皂苷類化合物、黃酮類化合物、多糖及維生素等，尤其甾體皂苷類化合物具有較強的抗腫瘤活性，對人體肝細胞株FHCC-98顯示了較強的細胞毒性，是龍葵的主要功效成分之一[17]，具有極高的藥用價值以及開發(fā)潛力。

響應面法是試驗設計、數(shù)理統(tǒng)計和最優(yōu)化技術的一種綜合應用，是數(shù)學方法和統(tǒng)計方法結合的產物，可以用來對所感興趣的響應值受多個變量影響的問題進行建模和分析，從而最終優(yōu)化該響應值[18]。近年來，由于統(tǒng)計學在各個領域的發(fā)展和應用，響應面法的應用領域不斷拓寬，其應用不再局限于化學工業(yè)，在生物醫(yī)藥領域都得以廣泛應用[19]。本研究以總皂苷量為評價指標，采用響應面分析法對龍葵總皂苷的提取工藝進行優(yōu)化，為在大別山區(qū)實現(xiàn)其產業(yè)化及綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料龍葵草采自湖北省羅田縣。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：YP6002電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)、DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海姚氏儀器設備廠)、RE-3000旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)、SF-130C萬能粉碎機(吉首市中誠制藥機械廠)、752SP紫外-可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)、HWS26水浴鍋(上海一恒科技有限公司)。

主要試劑：無水乙醇(分析純，武漢市洪山中南化工試劑有限責任公司)、薯蕷皂苷(色譜純，中國藥品生物制品鑒定所)、香草醛(分析純，湖南湘中地質實驗研究所)、冰醋酸(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)、甲醇(分析純，武漢市洪山中南化工試劑有限責任公司)、高氯酸(分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司)、正丁醇(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)、異丙醇(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 龍葵草的預處理 將采集的新鮮龍葵草洗凈，陰干，粉碎，得龍葵草粉末，儲存于陰涼室溫干燥處，備用。

1.3.2 標準曲線的制備 精密稱取薯蕷皂苷標準品1.00 g，使用甲醇定容于10 mL容量瓶中，制成薯蕷皂苷-甲醇標準液備用。精密吸取60、120、180、240、300、360 μL置于10 mL容量瓶中，水浴蒸干甲醇溶劑，冷卻后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL，振搖溶解后加入高氯酸1.6 mL，搖勻后放入70 ℃水浴15 min，然后流水冷卻，然后使用冰醋酸溶液定容至10 mL，搖勻后放置10 min；相同條件下不加標準品溶液制備空白溶液，于545 nm處測量吸光度，制備標準曲線[20]?；貧w方程為A=0.005 5C+0.009 4，R2=0.994 7。

1.3.3 龍葵皂苷類成分的測定 將龍葵草干燥研磨過篩后，精密稱取龍葵草粉末1.00 g，置于具塞錐形瓶中，加入適量的石油醚處理1 h，過濾，濾渣揮干溶劑。按一定的料液比加入乙醇，在一定溫度和時間下提取，將濾渣再次在相同的條件下提取。合并濾液，減壓濃縮得到粗品。再加鹽酸溶液混懸，用正丁醇萃取，合并有機相，揮去正丁醇，甲醇定容后即可測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算出各條件下皂苷類化合物含量，并換算出皂苷類成分的提取率。

1.3.4 龍葵皂苷類成分提取單因素試驗

1.3.4.1 乙醇體積分數(shù)對皂苷提取率的影響 精密稱取龍葵草粉末1.00 g，控制提取溫度為70 ℃，提取時間為4 h，提取料液比為1∶15(g/mL,下同)，提取次數(shù)為4次，研究乙醇體積分數(shù)70%、80%、90%、100%對龍葵草中皂苷類成分提取率的影響。

1.3.4.2 提取時間對皂苷提取率的影響 精密稱取龍葵草粉末1.00 g，控制乙醇體積分數(shù)為90%，提取料液比為1∶15，提取溫度為70 ℃，提取次數(shù)為4次，研究提取時間2、4、6、8 h對龍葵草中皂苷類成分提取率的影響。

1.3.4.3 提取溫度對皂苷提取率的影響 精密稱取龍葵草粉末1.00 g，控制乙醇體積分數(shù)為90%，提取時間為4 h，料液比為1∶15，提取次數(shù)為4次，研究提取溫度30、50、70、90 ℃對龍葵草中皂苷類成分提取率的影響。

1.3.4.4 料液比對皂苷提取率的影響 精密稱取龍葵草粉末1.00 g，控制乙醇體積分數(shù)為90%，提取時間為4 h，提取溫度為70 ℃，提取次數(shù)為4次，研究提取料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25對龍葵草中皂苷類成分提取率的影響。

1.3.4.5 提取次數(shù)對皂苷提取率的影響 精密稱取龍葵草粉末1.00 g，控制乙醇體積分數(shù)為90%，提取時間為4 h，提取溫度為70 ℃，料液比為1∶15，研究提取次數(shù)1、2、3、4次對龍葵草中皂苷類成分提取率的影響。

1.3.5 龍葵皂苷類成分提取響應面分析試驗 為了進一步探討乙醇提取龍葵皂苷的工藝條件，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，綜合考慮后，以乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比3個因素為自變量，分別用X1、X2、X3表示，并以1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，以皂苷提取率為響應值Y，響應面設計因素和水平如表1所示。

表1 龍葵皂苷類成分提取響應面設計因素和水平

2 結果與分析

2.1 龍葵皂苷類成分提取單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對皂苷類成分提取率的影響 由圖1可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，提取液中皂苷類成分的提取率增大；當乙醇體積分數(shù)增大到90%時，皂苷類成分的提取率最大；再增大乙醇體積分數(shù)，皂苷類成分的提取率下降。因此，選擇乙醇體積分數(shù)90%為宜。

圖1 乙醇體積分數(shù)對龍葵皂苷類成分提取率的影響

2.1.2 提取時間對皂苷類成分提取率的影響 由圖2可知，提取液中皂苷類成分的提取率隨提取時間的變化而不同。當提取時間達到4 h后，提取率最高。如再增加提取時間，則龍葵草中干擾成分增加，提取效率降低。因此，選擇最佳提取時間為4 h。

圖2 提取時間對龍葵皂苷類成分提取率的影響

2.1.3 提取溫度對皂苷類成分提取率的影響 如圖3所示，溫度對龍葵草中皂苷類成分提取率有較明顯的影響。在常溫下，龍葵草中皂苷類成分的溶出較慢；當溫度逐漸增大時，皂苷類成分的溶出加快；當溫度上升到70 ℃后，提取液中皂苷類成分的提取率減少，可能與高溫下皂苷類成分的分解加快有關。因此，選擇提取溫度70 ℃為宜。

圖3 溫度對龍葵皂苷類成分提取率的影響

2.1.4 料液比對皂苷類成分提取率的影響 由圖4可以看出，料液比達到1∶15時，龍葵草中皂苷類成分已基本溶出，再增大提取液用量會增加溶劑與能量的浪費。當料液比達到1∶20時，提取液中皂苷類成分的含量反而下降，可能與提取液中雜質含量相對增加有關，也可能是龍葵草中的雜質成分競爭性溶出不利于龍葵草中皂苷類成分提取[21]。因此，選擇提取料液比1∶15為宜。

圖4 料液比對龍葵皂苷類成分提取率的影響

2.1.5 提取次數(shù)對皂苷類成分提取率的影響 如圖5所示，隨著提取次數(shù)的增加，皂苷類成分的提取率逐漸增加，當提取次數(shù)為4次時，提取液中皂苷類成分的含量較3次時增加幅度較小，綜合考慮，選擇提取3次為宜。

圖5 提取次數(shù)對龍葵皂苷類成分提取率的影響

2.2 龍葵皂苷類成分提取響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面試驗結果 利用Design-Expert V8.0.6.1中Box-Behnken模型，按照表1中的因素水平進行試驗。將因素X1作(X1-90)/5變換；因素X2作(X2-4)/1變換；因素X3作(X3-15)/5變換，將因素水平變換為其編碼值。響應面試驗結果見表2。

利用Design-Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到皂苷提取率(Y)與乙醇體積分數(shù)(X1)、提取時間(X2)和料液比(X3)的二次多項回歸方程：

表2 龍葵皂苷類成分提取響應面優(yōu)化試驗結果

表3 響應曲面二次回歸方程模型方差分析

注：* 表示顯著(P< 0.05)；**表示極顯著(P<0.001)。

2.2.3 響應曲面的分析 由圖6可知，提取時間對龍葵草中皂苷類成分提取率的影響最為顯著，曲線變化幅度較大；其次是料液比和乙醇體積分數(shù)，曲線變化幅度平緩，這與方差分析的的結果一致。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[22]。由圖6中等高線可以看出，乙醇體積分數(shù)和提取時間之間的交互作用較顯著，表現(xiàn)為等高線呈橢圓形。相比較而言，乙醇體積分數(shù)和反應時間之間的交互作用較小，表現(xiàn)為等高線呈近圓形。

2.2.4 最佳提取工藝條件的確定及驗證 利用Design-Expert軟件中Box-Behnken模型，在回歸方程基礎上計算得出理論可獲得龍葵草中皂苷類成分提取率的最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)為88.29%、提取時間為4.57 h、提取料液比為1∶14.69，在此條件下，龍葵草中皂苷類成分的提取率理論上可達到2.505 3%。

圖6 乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比交互作用對皂苷類成分提取率影響的響應曲面和等高線

為了檢驗試驗結果與理論情況是否一致，在乙醇體積分數(shù)88%、提取時間4.5 h、提取料液比1∶15、提取溫度70 ℃、提取次數(shù)為3次的試驗條件下重復3次 試驗，龍葵草中皂苷類成分提取率的平均值為2.489 8%，與回歸方程得出的理論值比較接近，說明采用響應面法優(yōu)化得到的皂苷提取條件可靠。

3 結論

本研究中建立了一個以龍葵草皂苷類成分提取率為目標值，以乙醇體積分數(shù)、提取時間和料液比為因子的數(shù)學模型。方差分析結果表明該模型擬合度較好。通過Design-Expert軟件對回歸方程進行優(yōu)化計算，得到最佳提取工藝條件：乙醇體積分數(shù)88%、提取時間4.5 h、料液比1∶15?；貧w模型可較好地預測龍葵皂苷的提取率，為充分利用中藥龍葵資源提供了依據(jù)。為了驗證實驗結果的準確性，采用上述最佳提取條件進行3次驗證試驗，并得到的平均提取率為2.489 8%，與預測值2.505 3%基本相符，說明響應面優(yōu)化法對龍葵皂苷提取條件的優(yōu)化是可行的。該研究結果也為在大別山區(qū)實現(xiàn)龍葵皂苷產業(yè)化及綜合利用提供了理論依據(jù)。

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Optimum Extraction Process of Saponins fromSolanumnigrumL.by Response Surface Methodology

WU Wei1,2,ZHANG Yun2,XIANG Fu1,3*
(1.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains,Huangzhou 438000,China; 2.Medical College,Hubei Polytechnic University,Huangshi 435003,China; 3.College of Life Sciences,Huanggang Normal University,Huangzhou 438000,China)

In order to investigate the extraction technology of saponins fromSolanumnigrumL.in Dabie Mountains,the effect of key factors,such as ethanol concentration,extraction time,temperature,solid-liquid ratio and extraction times on the yield of saponins were studied based on single factor test,and the extraction technology was further optimized by response surface optimization test.Results showed that the optimal extraction conditions were ethanol concentration of 88%,extraction time of 4.5 h,solid-liquid ratio of 1∶15(g/mL),extraction temperature of 70 ℃,and extraction times of 3.Under these conditions,the extraction rate of saponins was 2.489 8%,which approached the theoretical value of 2.505 3%.

SolanumnigrumL.; saponins; extraction; response surface methodology

2016-03-14

大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心創(chuàng)新團隊項目(2015TD07); 礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復湖北省重點實驗室開放基金項目(2012105); 湖北省教育廳指導性項目(B2014023)

吳 偉(1979-)，男，湖北咸寧人，副教授，博士，主要從事生物技術藥物研究。E-mail:woowe97417@126.com

*通訊作者：向 福(1977-)，男，湖北利川人，副教授，博士，主要從事天然植物資源利用研究。E-mail:lc_xiangfu@163.com

S567.23+9

A

1004-3268(2016)09-0153-06