黃阜峰

（湖北師范大學(xué)生命科學(xué)院，湖北黃石 435002）

粘果山羊草及其祖先種的染色體原位雜交研究

黃阜峰

（湖北師范大學(xué)生命科學(xué)院，湖北黃石 435002）

利用人工合成的（AAG）5寡集核苷作為探針，對(duì)異原多倍體－粘果山羊草Ae．kotschyi（SKUK）及其祖先種小傘Ae．umbellulata（U）和沙融山羊草Ae．sharonensis（S）的中期染色體進(jìn)行了原位雜交研究。揭示出了粘果山羊草（SKUK）與其祖先種小傘（U）和沙融（S），集中成簇分布的寡集核苷序列在其基因組中的總量和分布位點(diǎn)有著明顯差異。SkUk基因組中集中成簇分布的AAG序列的總量和位點(diǎn)數(shù)量多，分布區(qū)域廣泛，每對(duì)染色體上均有2個(gè)以上的分布位點(diǎn)（多的可達(dá)5），分布于染色體的近著絲粒區(qū)域、長(zhǎng)臂、短臂或端粒。而S或U基因組中集中成簇分布的AAG序列的總量和位點(diǎn)數(shù)量少，分布區(qū)域窄，平均每條染色體不到一個(gè)，主要分布于近著絲粒區(qū)域或短臂，部分染色體沒有。并結(jié)合已有的文獻(xiàn)報(bào)道，探討了AAG序列在粘果山羊草和其祖先種小傘和沙融基因組中的變異與進(jìn)化的關(guān)系。

異源多倍體；粘果山羊草；SSRs；FISH；基因組變異

山羊草屬的多倍體是由少數(shù)幾個(gè)同屬的2倍體物種雜交加倍而形成的異源多倍體，它們的多倍體基因組來源的祖先種譜系基本清楚，且雜交組合多樣，種類豐富［1］。因此是研究多倍體進(jìn)化的很好的材料。新近的研究表明，在多倍體形成過程中，兩個(gè)異質(zhì)的基因組進(jìn)入一個(gè)（僅含有兩親本之一的細(xì)胞質(zhì)）核中，不再單獨(dú)進(jìn)化，而是共同進(jìn)化，且導(dǎo)致基因組的迅速改變和后生改變［2］。這些改變包括在基因組內(nèi)和基因組間的染色體交換、大片段DNA的轉(zhuǎn)移［3］、基因的突變和消除［4］、基因的甲基化沉默［5］。然而對(duì)由重復(fù)序列的改變而引起的山羊草多倍體化后染色體結(jié)構(gòu)的改變研究得很少。

FISH技術(shù)是研究異源多倍體的起源，以及與進(jìn)化相聯(lián)系的染色體結(jié)構(gòu)變化的一個(gè)有用的工具［6］。除類似于轉(zhuǎn)座子，彌散地分布整個(gè)基因組的高度重復(fù)系列不適合作為染色體的標(biāo)記外，rRNA基因，個(gè)別的重復(fù)系列克隆可用于山羊草多倍體的染色體結(jié)構(gòu)的改變的研究［7］。例如：rRNA基因的原位雜交表明山羊草多倍體和它的祖先種在經(jīng)歷的長(zhǎng)時(shí)間的平行進(jìn)化后，在多倍體中5SRNA基因個(gè)數(shù)比期望數(shù)減少，大小發(fā)生變化，以及出現(xiàn)在染色體上的位置也有改變［8］。然而，利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列的原位雜交比較山羊草多倍體和它的祖先中的染色體結(jié)構(gòu)變異及它們的平行進(jìn)化關(guān)系，未見報(bào)道。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSRs）由大約1～6核苷的短的重復(fù)單元組成。據(jù)報(bào)道，少數(shù)SSRs彌散地散布于整個(gè)基因組，是遺傳基因作圖的分子標(biāo)記。而多數(shù)SSRs集聚成簇出現(xiàn)在染色體上，構(gòu)成染色體的高度有序的結(jié)構(gòu)，并具有基因組和染色體組織的特異性。其中的AAG在基因組中成簇出現(xiàn)的概率最大，廣泛分布于著絲粒或染色體中部，是應(yīng)用原位雜交技術(shù)研究染色體結(jié)構(gòu)的有用序列［9］［10］。

粘果山羊草是由小傘和沙融雜交而形成的異源多倍體［1］。本研究擬應(yīng)用人工合成的寡聚核苷，（AAG）5這個(gè)SSR重復(fù)系列作為探針，通過原位雜交著色粘果山羊草及其祖先種小傘和沙融的染色體。選擇用AAG作為探針是因?yàn)樗鼈冊(cè)邴滎惢蚪M中含量豐富，且成簇分布，通過原位雜交能得到圖案豐富的雜交圖譜，提供大量的有關(guān)染色體結(jié)構(gòu)的信息［10］。我們的目標(biāo)是通過原位雜交得到三個(gè)種的FISH圖譜，識(shí)別染色體，了解AAG高度重復(fù)序列在基因組中的分布，比較粘果山羊與祖先種小傘，沙融的染色體結(jié)構(gòu)的差異，進(jìn)而研究基因組的進(jìn)化及與SSRs的關(guān)系。

1 材料

1．1 粘果Ae．kotschyi Boiss、小傘Ae．umbellulata Zhuk、沙融山羊草Ae．sharonensis種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所提供。

1．2 探針（AAG）5由Sigma公司合成

2 方法

2．1 制備中期染色體標(biāo)本

種子25℃催芽48h，切取根尖加入0．2%的秋水仙素，4℃處理24h，卡諾氏固定液固定，酶解，火焰干燥法制備中期染色體標(biāo)本。

2．2 原位雜交方法

染色體原位雜交實(shí)驗(yàn)按Li等［11］的方法并略作修改，每一張片子40μL雜交液，內(nèi)含50%的去離子甲酰胺（Sigma），10%的硫酸葡聚糖（Sigma），100ng／μL鮭魚精子ssDNA（Sigma），2× SSC，蓋片用22mm×22mm的蓋玻片，90℃共變性3min，放保濕皿中37℃雜交過夜。

2．3 信號(hào)檢測(cè)

染色體原位雜交信號(hào)的檢測(cè)與洗脫仍然按Li等［11］的方法。雜交后的載玻片用2×SSC在常溫洗10min，37℃洗10min，再用1×PBS常溫洗一次，然后進(jìn)行檢測(cè)。地高辛標(biāo)記的探針第一步反應(yīng)加入羊抗地高辛抗體（anti－di－goxigenin－FITC，Roche），37℃溫育30min后再用1×PBS常溫洗3次，每次5min，第二步信號(hào)放大反應(yīng)加入兔抗羊地高辛偶聯(lián)物（rabbit anti－sheep－FITC，Roche），溫育和洗脫同第一步。

2．4 圖像檢測(cè)及分析

染色體載片使用5μL／mL DAPI（4′，6－diamidino－2－phenylindole）復(fù)染，再加抗淬滅劑，用O－lympus BX60型熒光顯微鏡觀察雜交信號(hào)，Photometrics SenSys CCD1400E攝影裝置和Metamorph4．6．3軟件獲得圖像，Photoshop10．1．1軟件進(jìn)行圖片處理。染色體分析，應(yīng)用AAG探針雜交得到的染色體信號(hào)帶，結(jié)合rRNA基因和重復(fù)序列的原位雜交數(shù)據(jù)，識(shí)別粘果山羊草的二個(gè)基因組（SKUK）的染色體及小傘、沙融的染色體。

圖1 （AAG）5探針熒光原位雜交染色體圖，A粘果山羊草，B沙融山羊草，C小傘山羊草

3 結(jié)果與分析

3．1 原位雜交結(jié)果

利用Dig－dUTP標(biāo)記的工人合成的寡聚核苷（AAG）5探針分別對(duì)粘果山羊草及其祖先種—小傘、沙融山羊草的中期染色體進(jìn)行了熒光原位雜交，同時(shí)利用DAPI著色染色體，藍(lán)色為染色體，綠色的為染色體上的雜交信號(hào)。結(jié)果如（圖1）所示，三個(gè)種的基因組的幾乎所有染色體上均有雜交信號(hào)，明亮大斑點(diǎn)信號(hào)，主要分布在染色體的著絲粘區(qū)域，其次部分染色體的長(zhǎng)短臂中部，也有幾個(gè)出現(xiàn)在染色體的端粒。這與A．Cuadrado研究禾木科植物的SSR高度重復(fù)系列，成片集中分布于染色體的著絲粒的結(jié)果基本一致［9］。也有不一致的地方，如沙融山羊草，除著絲粒大信號(hào)斑處，每條染色體的其它區(qū)域也彌散地分布著眾多的小信號(hào)斑點(diǎn)。

3．2 核型分析

作者應(yīng)用核型分析比較了粘果山羊草及其祖先種——小傘，沙融山羊草SSR分布的特征（圖2）。

圖2 核型圖，上排左沙融山羊草（S基因組），上排右小傘山羊草（U基因組），下排左粘果山羊草（Sk基因組）下排右粘果山羊草（Uk基因組）

粘果山羊草的Sk基因組：①著絲粒部位，5對(duì)染色體的著絲粒有強(qiáng)烈的雜交信號(hào)（SK1，SK2，SK4，SK5，SK7），一對(duì)染色體著絲粒有較強(qiáng)的雜交信號(hào)（SK3），一對(duì)染色體無著絲粒信號(hào)，②染色體長(zhǎng)短臂中部，5對(duì)染色體（SK1LR，SK2L，SK4LR，SK5LR，SK6LR）較強(qiáng)的信號(hào)，2對(duì)染色體具較弱的雜交信號(hào)（SK3LR，SK7L）。③端粒部位，6對(duì)染色體具（SK1L，SK2L，SK3L，SK4L，SK5L，SK6R）較強(qiáng)的信號(hào)。表明SSR序列主要集中分布于著絲粒，其次分布于長(zhǎng)臂中部，也會(huì)出現(xiàn)在端粒。

粘果山羊草的Uk基因組：①著絲粒部位，4對(duì)染色體有強(qiáng)烈的信號(hào)（UK2，UK3，UK4，UK5），1對(duì)染色體較強(qiáng)的信號(hào)（UK7），2對(duì)染色體較弱的信號(hào)，②染色體長(zhǎng)短臂中部，3對(duì)染色體具有強(qiáng)烈信號(hào)（UK3R，UK4LR，UK5LR），4對(duì)具有較強(qiáng)或弱的信號(hào)（UK1L，UK2LR，UK6L，UK7L）。③端粒部位，5對(duì)染色體具端粒信號(hào)都較弱（UK1L，UK2LR，UK3L，UK5L，UK6L，UK7LR）。表明所有染色體的著絲粒，中部，端粒部位，都具有成片集中分布的SSR序列，但集中程度，拷貝數(shù)量有所不同。

沙融山羊草的S基因組：①著絲粒部位，1對(duì)染色體具明亮信號(hào)（S2），3對(duì)染色體具有較弱信號(hào)（S1，S3，S6），其它未見信號(hào)。②染色體長(zhǎng)短臂中部，僅4對(duì)染色體見到較弱的信號(hào)（S1R，S2LR，S4LR，S7R）。③端粒部位，未見端粒信號(hào)。表明在整個(gè)S基因組有成片集中分布的SSRs序列，但數(shù)量較少，位點(diǎn)也少。

小傘山羊草的U基因組：①著絲粒部位，3對(duì)染色體具有較強(qiáng)信號(hào)（U2，U4，U5），4對(duì)染色體具有較弱信號(hào)（U1，U3，U6，U7），②染色體長(zhǎng)短臂中部，2對(duì)染色體具有較強(qiáng)信號(hào)（U3L，U5R），③端粒部位，2對(duì)染色體具有較強(qiáng)信號(hào)（U3L，U4L）。表明U基因組，具有較豐富的SSRs序列，出現(xiàn)的位點(diǎn)也較多。

4 討論

植物基因組中存在著大量的豐富的AAG基序的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，關(guān)于這一點(diǎn)是沒有疑問的。然而關(guān)于三核苷基序的簡(jiǎn)單重復(fù)序列在基因組中的分布存在著分歧。據(jù)已測(cè)序的物種的序列對(duì)比和其它物種的EST數(shù)據(jù)，三核苷基序的簡(jiǎn)單重復(fù)序列以200－300bp的長(zhǎng)度主要隨機(jī)地散布于基因組的編碼區(qū)。然而，從我們研究的三個(gè)山羊草物種小傘、沙融、粘果的染色體的FISH結(jié)果來看，三個(gè)山羊草物種的染色體上有著豐富的，大量的、多態(tài)的、大的信號(hào)斑。而植物FISH技術(shù)要求目標(biāo)片段的長(zhǎng)度在10kb左右［12］，才會(huì)有可探測(cè)到的雜交信號(hào)。據(jù)此推斷這些區(qū)域中有大量的長(zhǎng)的串連重復(fù)的AAG序列，或者染色體的三維結(jié)構(gòu)上集中排列了大量的AAG序列。揭示了一些長(zhǎng)的、大的AGG重復(fù)序列非隨機(jī)地分布于特定區(qū)域，表現(xiàn)出基因組的特異性。這個(gè)結(jié)果與研究大麥、小麥得到的結(jié)果是一致的［10］，而與EST的結(jié)果相反。

小傘、沙融的AAG原位雜交信號(hào)主要分布于近著絲粒區(qū)域，粘果的原位雜交信號(hào)分布于近著絲粒／著絲?；蜷L(zhǎng)短臂中間，或近端粒／端粒。與小傘、沙融、粘果山羊草染色體的C－帶或N－帶的分布區(qū)域部分重疊［13］，揭示AAG與異染色質(zhì)有關(guān)。

粘果山羊草是由小傘和沙融山羊草雜交后多倍化而形成的一個(gè)異源四倍體物種。FISH結(jié)果表明S、U基因組和SkUk基因組的雜交信號(hào)的大小、數(shù)量及在染色體上的分布圖案存在著廣泛的差異，揭示出粘果山羊草與它的祖先種小傘和沙融、山羊草基因組的進(jìn)化是不同步的。

比較S、U和SK、UK基因組的雜交圖案可以看出，S基因組除2S染色體有一個(gè)明亮的著絲粒信號(hào)斑外，其它染色體有一個(gè)較暗、較小的（或偶有兩信號(hào)）分布染色的近著絲粒／著絲?；蚨瘫凵稀Ｈ欢鳶K基因組，每條染色體都有多條（最多達(dá)5條）明亮的信號(hào)，分布于近著絲粒／著絲?；蜷L(zhǎng)短臂中間，或近端粒／端粒。這一結(jié)果揭示了粘果山羊草（SK和Uk）基因組的成簇的串聯(lián)的長(zhǎng)的AAG相對(duì)于祖先種－沙融山羊草U基因組和小傘的U基因組的分布區(qū)域擴(kuò)大，出現(xiàn)了眾多新的分布位點(diǎn)。暗示SK和UK基因組都被大量的修改，這與SK的18－26srDNA的研究結(jié)果相一致，而與Uk的結(jié)果相反［13］。

同樣，比較粘果山羊草和它的祖先種小傘和沙融的雜交信號(hào)的數(shù)量和信號(hào)斑點(diǎn)的大小，發(fā)現(xiàn)，粘果山羊草的S基因組的大的雜交信號(hào)明顯比沙融的S基因組要多。多數(shù)斑點(diǎn)也較大，這揭示了粘果山羊草基因組（SkUk）集中成簇連綿分布的三核苷基序的SSR的數(shù)量比其祖先種小傘U和沙融S明顯要多很多。這似乎指向異源多倍體經(jīng)歷了雜交加倍初期的基因組的劇烈變化和后生變化，三核苷基序的SSR在基因組中被大量的擴(kuò)增。

我們還能發(fā)現(xiàn)一個(gè)有意思的現(xiàn)象就是用AAG探針與沙融山羊草與中期染色體雜交，發(fā)現(xiàn)除觀察到少數(shù)幾個(gè)大的信號(hào)斑外，還觀察到了為數(shù)眾多的小的且清晰可見的信號(hào)斑點(diǎn)，散布于所有染色體的長(zhǎng)、短臂上，而在S基因組中沒有觀察到。揭示出存在于S基因組的較小的成簇分布的AAG序列在SK基因中消失了。

新近研究人工合成的沙融×小傘的結(jié)果證實(shí)，多倍體的基因組是非加性的，存在著DNA序列轉(zhuǎn)移，消除和COPY數(shù)量的變化，同時(shí)研究者也發(fā)現(xiàn)那些人工合成的異源多倍體在基因組組成上與自然生成的異源多倍體較為相似，而發(fā)生基因組整合的方向也是一致的［4］。我們的研究結(jié)果也佐證了這一觀點(diǎn)，粘果山羊草（SK、UK）的信號(hào)斑點(diǎn)大，且較明亮，以及AAG與沙融雜交的彌散分布于整個(gè)基因組的小的信號(hào)斑點(diǎn)，在Sk基因組的雜交中消失。揭示出自然形成的異源多倍體的一些DNA序列消除。而且在SK、UK中大的雜交信號(hào)斑點(diǎn)的數(shù)量增多，位置的多態(tài)性增加，同樣揭示了序列的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)增。

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FISH study of chromosome for Ae．kotschyi and its ancestral species HUANG Fu－feng

（College of Life Sciences，Hubei Normal University，Huangshi 435002，China）

In this paper，the use of a synthetic oligonucleotides of the（AAG）5Set nucleoside as probes for allopolyploid－Ae．kotschyi（SKUK）and its ancestral species－Ae．umbellulata rundlet（U）and Ae．sharonensis sand melt goat grass（S）of metaphase chromosomes in situ hybridization studies．Reveals Ae．kotschyi（SKUK）and its ancestral species umbrella（U）and sand melt（S），focused on two oligonucleotide sets nucleotide sequences clustered distribution of the total amount and distribution sites in its genome in a significant difference．SkUkgenome more concentrated in clusters and the total number of sites distributed AAG sequences，widely distributed areas，each chromosome pair has two more distribution sites，（and more up to 5），located in chromosome near the centromere region，long arm，short arm or telomeres．While the total number of sites and S or U genome centralized cluster distribution AAG sequences less narrow distribution area，an average of less than one per chromosome，（not part of the chromosome），mainly in the area near the centromere or short arm．And combined with the existing literature on the relationship between the evolution of the genome sequence of SSR were discussed．

allopolyploid；Ae．kotschyi；SSRs；FISH；genome evolution

Q－343

A

1009－2714（2016）04－0006－05

10．3969／j．issn．1009－2714．2016．04．002

2016—04—20

黃阜峰（1962— ），男，副教授，主要研究方向?yàn)榧?xì)胞遺傳學(xué)．