白 淼張 燦*安代志張明露史 云鄭文杰劉 洵

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所,北京 100071;2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048;3.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心,天津 300456)

不同種類果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物污染調(diào)查

白 淼,張 燦1,*,安代志1,張明露2,史 云1,鄭文杰3,劉 洵2

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所,北京 100071;2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048;3.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心,天津 300456)

為了解不同種類果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌及其主要代謝產(chǎn)物的污染情況,隨機(jī)選取6種市售果汁(共24份)進(jìn)行調(diào)查。采用固相微萃取(SPME)和氣相色譜(GC)-質(zhì)譜(MS)技術(shù)檢測(cè)果汁中愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚的含量,并利用YSG培養(yǎng)基(pH=3.7)分離果汁中的脂環(huán)酸芽孢桿菌。在24份果汁樣品中,2,6-二溴苯酚檢出率為0%(0/24);愈創(chuàng)木酚檢出率為33.3%(8/24),濃度最高可達(dá)26.9 μg/L;脂環(huán)酸芽孢桿菌檢出率為12.5%(3/24),分離出的3株脂環(huán)酸芽孢桿菌均來(lái)自愈創(chuàng)木酚含量較高的橙汁樣品;在未檢出愈創(chuàng)木酚的16份果汁樣品中均沒(méi)有分離出脂環(huán)酸芽孢桿菌。在所檢測(cè)的24份果汁樣品中,部分橙汁、葡萄汁以及桃汁中檢測(cè)到愈創(chuàng)木酚,但是只在橙汁樣品中分離出了脂環(huán)酸芽孢桿菌,表明橙汁可能更容易在生產(chǎn)過(guò)程中被脂環(huán)酸芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物所污染。

脂環(huán)酸芽孢桿菌,固相微萃取,氣相色譜-質(zhì)譜,代謝產(chǎn)物,菌種鑒定

脂環(huán)酸芽孢桿菌主要分布在高酸的熱環(huán)境、土壤以及某些水果加工產(chǎn)品當(dāng)中,具有嗜酸耐熱、產(chǎn)芽孢、強(qiáng)抗逆性等特征[1-2]。自1984年Cerny等首次從腐敗蘋(píng)果汁中分離出脂環(huán)酸芽孢桿菌后[3],人們又陸續(xù)從橙汁、芒果汁、番茄汁、獼猴桃汁等果汁中發(fā)現(xiàn)該菌[4-7]。近年來(lái),脂環(huán)酸芽孢桿菌造成的果汁腐敗事件在美國(guó)、澳大利亞、日本等地相繼大規(guī)模發(fā)生,引發(fā)人們廣泛關(guān)注[8]。脂環(huán)酸芽孢桿菌在果汁中生長(zhǎng)不會(huì)產(chǎn)生氣體,被污染的產(chǎn)品也無(wú)明顯的脹包或酸敗[9],但是其代謝產(chǎn)物愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚在極低濃度條件下就可對(duì)果汁風(fēng)味產(chǎn)生不良影響,甚至使果汁出現(xiàn)輕微沉淀[10-11]。通常條件下,受到脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的果汁在剛出廠時(shí)很難被檢測(cè)出來(lái),大多是在投放市場(chǎng)后才被發(fā)現(xiàn),從而給果汁生產(chǎn)企業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。目前,國(guó)際貿(mào)易中嚴(yán)格要求每10 mL濃縮果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌數(shù)量不得超過(guò)1個(gè)[13]。我國(guó)部分濃縮果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌數(shù)量嚴(yán)重超標(biāo),產(chǎn)品合格率較低,已成為當(dāng)前困擾果汁生產(chǎn)企業(yè)的技術(shù)難題[14]。

本研究選取6種市售果汁(共24份),采用固相微萃取(SPME)和氣相色譜(GC)-質(zhì)譜(MS)技術(shù)檢測(cè)果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的主要代謝產(chǎn)物(愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚),同時(shí)對(duì)果汁中可能存在的脂環(huán)酸芽孢桿菌進(jìn)行分離,調(diào)查不同種類果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌及其主要代謝產(chǎn)物的污染情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

愈創(chuàng)木酚標(biāo)準(zhǔn)品 加拿大Toronto Research Chemicals公司,純度為99.9%;2,6-二溴苯酚標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Supelco公司,純度為99.9%;測(cè)序試劑BigDye terminator v3.1 美國(guó)Applied Biosystems公司;無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4) 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;BAT固體培養(yǎng)基 使用1 mol/L H2SO4調(diào)節(jié)pH至4.0,青島海博生物技術(shù)有限公司;YSG液體培養(yǎng)基 成分為酵母提取物2.0 g/L,葡萄糖1.0 g/L,可溶性淀粉2.0 g/L,使用1 mol/L H2SO4調(diào)節(jié)pH至3.7[15];LB固體培養(yǎng)基 pH中性,成分為胰蛋白胨10.0 g/L,酵母提取物10.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,瓊脂15.0 g/L[16];果汁樣品 選取的6種(共24份)果汁均為市售常見(jiàn)品牌,每種品牌隨機(jī)抽取的果汁樣品份數(shù)均由不同的生產(chǎn)批次所決定,其中100%橙汁6份(品牌A、B和C,每種品牌各取2份)、100%蘋(píng)果汁6份(品牌A和B,每種品牌各取3份)、100%桃汁2份(品牌A)、100%葡萄汁4份(品牌A)、100%番茄汁4份(品牌A)和7%藍(lán)莓汁飲料2份(品牌D),以上所有果汁均為保質(zhì)期內(nèi)的正常產(chǎn)品。

Agilent 7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和30 m×0.25 mm×0.25 μm HP-5MS色譜柱 美國(guó)Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭、固相微萃取裝置 美國(guó)Supelco公司;ABI PRISM 3730xl測(cè)序儀 美國(guó)Applied Biosystems公司;Lecia EM UC6超薄切片機(jī) 德國(guó)Leica公司;Hitachi H-7650型透射電鏡 日本Hitachi公司;超純水儀 美國(guó)Thermo公司;85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器和THZ-82A水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌主要代謝產(chǎn)物檢測(cè) 根據(jù)前期文獻(xiàn)[17]報(bào)道,果汁中愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚采用SPME進(jìn)行捕集,通過(guò)GC-MS進(jìn)行定性和定量分析。配制愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,二者濃度分別為0.49、0.98、1.95、3.90、7.81、31.25、62.5、125 μg/L和0.42、0.84、1.68、3.36、6.72、26.88、53.8、108 μg/L。取9 mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用液于萃取瓶中,加入1.8 g無(wú)水硫酸鈉,55 ℃萃取35 min后,進(jìn)樣到GC-MS進(jìn)行分析,每個(gè)樣品平行測(cè)定6次,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依照相同方法測(cè)定果汁樣品中愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚含量。GC-MS具體條件參照文獻(xiàn)[17]。

1.2.2 脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離與純化 將果汁樣品在80 ℃恒溫水浴中熱處理13 min,然后迅速冷卻至室溫。處理后的果汁樣品以10%的比例接種到Y(jié)SG液體培養(yǎng)基(pH=3.7),置于水浴恒溫振蕩器(45 ℃、200 r/min)中培養(yǎng)3 d進(jìn)行富集。吸取1 mL培養(yǎng)物,涂布在BAT固體培養(yǎng)基(pH=4.0)表面,置于42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。若長(zhǎng)出可疑菌株,則對(duì)其進(jìn)行純化,在BAT固體培養(yǎng)基(pH=4.0)表面進(jìn)行劃線,置于42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。三次純化后對(duì)可疑菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 脂環(huán)酸芽孢桿菌初步鑒定 對(duì)純化好的可疑菌株進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色[18],觀察其基本形態(tài)特征,同時(shí)進(jìn)行嗜酸耐熱性檢驗(yàn),具體方法參照文獻(xiàn)[19]。

透射電鏡觀察:取脂環(huán)酸芽孢桿菌菌液置于無(wú)菌離心管中,以6000 r/min離心10 min(離心半徑為9.5 cm),棄去上清液,用無(wú)菌PBS緩沖溶液清洗3次,之后用2.5%戊二醛固定4 h。經(jīng)過(guò)脫水、浸透、固化處理后,制備標(biāo)本。采用Lecia EM UC6超薄切片機(jī)切片(厚50～60 nm),乙酸鈾枸櫞酸鉛染色后在透射電鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 菌種鑒定 提取待測(cè)樣品DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所使用引物為16S引物27F/1492R[20]。擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性5 min后,進(jìn)行95 ℃ 20 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min 30 s的循環(huán)35次,再在72 ℃下延伸10 min,于4 ℃保溫,PCR完成后用1.5%的瓊脂糖膠進(jìn)行切膠回收,回收后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交到GenBank中進(jìn)行BLAST相似性分析,獲取相似性最高的菌株信息。選取這些相關(guān)菌株的序列,通過(guò)ClustalX軟件進(jìn)行全序列對(duì)比,并用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌主要代謝產(chǎn)物分析

2.1.1 SPME-GC-MS方法學(xué)驗(yàn)證 愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1所示。結(jié)果表明,愈創(chuàng)木酚在0.49～1.25×102μg/L和2,6-二溴苯酚在0.42～1.08×102μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.9985和0.9964。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算出愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚的檢測(cè)限分別為0.02 μg/L和0.08 μg/L。愈創(chuàng)木酚(4、24、56 μg/L)和2,6-二溴苯酚(20、58、92 μg/L)在3個(gè)濃度水平下的回收率和精密度分別為82.1%～111.4%和5.2%～6.2%。

表1 果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

注:LOD(Limits of Detection):檢出限;N.I.(Not Isolated):未分離出。

圖1 愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of guaiacol and 2,6-dichlorophenol mixed standard solution

2.1.2 愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚的檢測(cè)結(jié)果 由表1可知,24份果汁樣品中,2,6-二溴苯酚檢出率為0%(0/24);愈創(chuàng)木酚檢出率為33.3%(8/24)。結(jié)果表明不同種類果汁中愈創(chuàng)木酚含量差異較大,6份橙汁樣品中有4份檢出愈創(chuàng)木酚且含量較高,其中A、B品牌橙汁愈創(chuàng)木酚濃度在10.9～26.9 μg/L之間,C品牌橙汁未檢出愈創(chuàng)木酚;2份桃汁樣品中均檢出愈創(chuàng)木酚,含量分別為7.2和9.3 μg/L;4份葡萄汁中有2份檢出愈創(chuàng)木酚,含量分別為5.7和10.3 μg/L。蘋(píng)果汁、番茄汁和藍(lán)莓汁飲料中均未檢出愈創(chuàng)木酚。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的種類和初始濃度、果汁的成分以及貯藏溫度等因素均能對(duì)愈創(chuàng)木酚的合成產(chǎn)生影響[7,21-22],從而影響愈創(chuàng)木酚在果汁中的含量。Jensen認(rèn)為果汁中愈創(chuàng)木酚濃度通常要比鹵酚(2,6-二溴苯酚和2,6-二氯苯酚)高出近1000倍左右[23]。張江波等對(duì)脂環(huán)酸芽孢桿菌的污染能力進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)受到脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的獼猴桃汁中僅檢測(cè)出愈創(chuàng)木酚,并沒(méi)有檢測(cè)到2,6-二溴苯酚[7]。本研究中的24份果汁樣品同樣均未檢出2,6-二溴苯酚,這與前期相關(guān)報(bào)道的結(jié)果相一致。

2.2 果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離與鑒定

2.2.1 果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的分離與初步鑒定 由于果汁樣品中脂環(huán)酸芽孢桿菌的活菌數(shù)量很少,直接涂布到BAT固體培養(yǎng)基(pH=4.0)上難以確保能分離到,因此本研究從每個(gè)果汁樣品中吸取一定量的果汁加入到酸性的YSG液體培養(yǎng)基(pH=3.7)中進(jìn)行富集培養(yǎng)。在檢測(cè)的24份果汁樣品中,從3份橙汁樣品里面分出了可疑菌株,分別記作A2、B1和B2,其中愈創(chuàng)木酚的含量分別為26.4、10.9和15.7 μg/L(見(jiàn)表1)。3株菌株的菌落呈乳白或微黃色、圓形、邊緣整齊、中心突起、直徑為0.5～3.0 mm,革蘭氏染色為陽(yáng)性,產(chǎn)芽孢,細(xì)胞呈桿狀,以上均符合脂環(huán)酸芽孢桿菌的一般特征[24]。3株菌株經(jīng)熱處理后,仍有菌落生長(zhǎng);在LB固體培養(yǎng)基(pH中性)上不生長(zhǎng),說(shuō)明3株菌株均為嗜酸耐熱菌。透射電鏡結(jié)果表明(圖2),3株菌株的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為直或近直的桿狀,菌體寬為0.35～1.1 μm、長(zhǎng)為2～6.3 μm,產(chǎn)芽孢,芽孢為端生或次端生的橢圓形,有些會(huì)使?fàn)I養(yǎng)細(xì)胞膨大,均與脂環(huán)酸芽孢桿菌一般形態(tài)特征一致[24]。

圖2 透射電鏡(15000×)Fig.2 TEM images of three isolated strains(15000×)注:a為分離菌株A2;b為分離菌株B1;c為分離菌株B2。

2.2.2 菌種鑒定結(jié)果及污染情況分析 對(duì)3株分離菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank中進(jìn)行BLAST相似性分析,然后將所測(cè)得的序列與已知的脂環(huán)酸芽孢桿菌菌屬不同種的全序列進(jìn)行比對(duì),整理得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示。菌株A2與AlicyclobacillusacidocaldariusAB059672的相似性為98%,菌株B1和B2與AlicyclobacillusacidocaldariusAB059663的相似性為99%,說(shuō)明分離菌株A2、B1和B2均屬于Alicyclobacillusspp.。

圖3 基于Alicyclobacillus相關(guān)菌種及分離所得菌種16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Construction of the phylogenetic tree based on the sequences of 16S rDNA of the isolated strains and Alicyclobacillus

所檢測(cè)的24份果汁樣品中共分出3株脂環(huán)酸芽孢桿菌,檢出率12.5%(3/24)。3份陽(yáng)性樣品均為橙汁,其中愈創(chuàng)木酚的含量分別為26.4、15.7和10.9 μg/L。部分葡萄汁和桃汁中雖然也檢測(cè)到了愈創(chuàng)木酚,但是并未發(fā)現(xiàn)脂環(huán)酸芽孢桿菌。未檢出愈創(chuàng)木酚的16份果汁樣品中均未分離出脂環(huán)酸芽孢桿菌。從果汁種類上來(lái)看,橙汁與其它5種果汁(蘋(píng)果汁、桃汁、葡萄汁、番茄汁和藍(lán)莓汁飲料)相比,更容易在生產(chǎn)過(guò)程中被脂環(huán)酸芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物所污染。橙汁較其它幾種果汁而言pH較低且營(yíng)養(yǎng)成分豐富,其中的主要營(yíng)養(yǎng)成分如檸檬酸、蔗糖、礦質(zhì)元素(鈣、鎂和鉀元素)等在一定濃度范圍內(nèi)均可促進(jìn)脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長(zhǎng)[25]。Parish報(bào)道,佛羅里達(dá)州有超過(guò)三分之一(591/1575)的橙汁樣品受到脂環(huán)酸芽孢桿菌的污染[26]。因此,橙汁生產(chǎn)企業(yè)更應(yīng)從原料挑選、加工過(guò)程及滅菌技術(shù)等生產(chǎn)環(huán)節(jié)上進(jìn)行更嚴(yán)格的監(jiān)督與控制,降低產(chǎn)品被脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。

所檢測(cè)的24份果汁樣品中,脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢出率為12.5%(3/24),其主要代謝產(chǎn)物愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚的檢出率分別為33.3%(8/24)和0%(0/24)。其中,愈創(chuàng)木酚的檢出率(33.3%)要高于脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢出率(12.5%),這可能是由于果汁在生產(chǎn)過(guò)程中曾遭受過(guò)脂環(huán)酸芽孢桿菌的污染,然而脂環(huán)酸芽孢桿菌卻在后續(xù)的加工生產(chǎn)以及運(yùn)輸儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)中失活,但是仍然可以檢測(cè)出殘留在果汁樣品中的愈創(chuàng)木酚。

3 結(jié)論

本研究采用SPME-GC-MS分析果汁中脂環(huán)酸芽孢桿菌的主要代謝產(chǎn)物(愈創(chuàng)木酚和2,6-二溴苯酚),同時(shí)對(duì)果汁中可能存在的脂環(huán)酸芽孢桿菌進(jìn)行分離。結(jié)果表明,所檢測(cè)的24份果汁樣品中共分出3株脂環(huán)酸芽孢桿菌,檢出率12.5%(3/24),2,6-二溴苯酚檢出率為0%(0/24),愈創(chuàng)木酚檢出率為33.3%(8/24)。其中,所檢測(cè)的6份橙汁中有4份檢出含量較高的愈創(chuàng)木酚,濃度在10.9～26.9 μg/L之間,分離出的3株脂環(huán)酸芽孢桿菌全部來(lái)自這4份愈創(chuàng)木酚含量較高的橙汁樣品。在未檢出愈創(chuàng)木酚的果汁樣品中均未分離到脂環(huán)酸芽孢桿菌。在所檢測(cè)的24份樣品中,部分橙汁、葡萄汁和桃汁也檢測(cè)到愈創(chuàng)木酚,但是并未分離到脂環(huán)酸芽孢桿菌,只在橙汁樣品中分離出該菌,表明橙汁可能更容易在生產(chǎn)過(guò)程中被脂環(huán)酸芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物所污染。果汁生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)日常監(jiān)管,采取相應(yīng)措施,有效控制生產(chǎn)過(guò)程中的脂環(huán)酸芽孢桿菌,避免產(chǎn)品受到污染。

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A survey ofAlicyclobacillusand its metabolite product spoilage in various juice

BAI Miao1,ZHANG Can1,*,AN Dai-zhi1,ZHANG Ming-lu2,SHI Yun1,ZHENG Wen-jie3,LIU Xun2

(1.Institute of Disease Control and Prevention,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,China; 2.School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 3.Plant & Foodstuffs Inspection Center,Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Tianjin 300456,China)

To investigate the pollution ofAlicyclobacillusand its major metabolite in different types of fruit juices,six types of commercial juice products(24 samples)were examined in this study. The concentration of guaiacol and 2,6-dibromophenol in these juice were detected using solid phase microextraction(SPME)and gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS),and theAlicyclobacillusin juice were isolated by using acidified YSG medium(pH=3.7). The results showed that the detectable rate of 2,6-dibromophenol was 0%(0/24),the detectable rate of guaiacol was 33.3%(8/24)and the highest concentration of guaiacol reached 26.9 μg/L. Positive rate ofAlicyclobacillusin these 24 juice products arrived at 12.5%(3/24). ThreeAlicyclobacillusstrains were isolated from the orange juice products with high concentration of guaiacol contamination. The 16 juice samples which guaiacol concentration below the limits of detection,have no identication ofAlicyclobacillus. Guaiacol contamination were detected in part of the orange juice,grape juice and peach juice samples,and theAlicyclobacilluswere isolated only in orange juice. The orange juice might be contaminated byAlicyclobacillusand its major metabolite.

Alicyclobacillus;solid phase microextraction(spme);gas chromatography-mass spectrometry(gc-ms);metabolic product;strains identification

2016-04-11

白淼(1990-)，女，本科，實(shí)驗(yàn)員，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究，E-mail：baimiaobtbu@163.com。

*通訊作者:張燦(1975-)，博士，助理研究員，E-mail：zhangcancqu@163.com。

國(guó)家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)-質(zhì)檢(201310146)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000