李 健,謝 晶,劉 寧,李廷利

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

響應(yīng)面法優(yōu)化短梗五加總皂苷的超聲提取工藝

李 健1,謝 晶1,劉 寧1,李廷利2

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

以短梗五加莖為原料,采用超聲波輔助提取短梗五加中總皂苷。研究料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲功率四個(gè)因素對(duì)短梗五加中總皂苷提取效果的影響,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn),以總皂苷得率為響應(yīng)值,建立回歸模型并由此得出四個(gè)因素最優(yōu)提取工藝組合為:料液比1∶50,乙醇體積分?jǐn)?shù)68%,超聲時(shí)間41 min,超聲功率350 W,此條件下短梗五加總皂苷的得率為1.577%。實(shí)驗(yàn)真實(shí)值與模型預(yù)測(cè)值1.586%基本一致,表明響應(yīng)面中心組合法合理可行,可以優(yōu)化提取短梗五加總皂苷的工藝。

短梗五加,總皂苷,超聲提取,響應(yīng)面法

短梗五加(Acanthopanaxsessiliflorus)又稱無(wú)梗五加,為傘形目五加科五加屬,藥食兩用植物。主要分布于中國(guó)東北、河北、山西、朝鮮及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)[1]?！侗静菥V目》中寫道:“五加治風(fēng)濕痿痹,壯筋骨,其功良深,仙家所述,雖若過情,蓋獎(jiǎng)辭多溢”[2]。

在我國(guó)東北地區(qū),將短梗五加當(dāng)刺五加藥用,未見不良反應(yīng)報(bào)道[3]。短梗五加含有豐富的三萜皂苷類、木脂素類、香豆素類、多糖類、微量元素和氨基酸等多種化合物[4-8]。短梗五加性溫,無(wú)毒,平衡陰陽(yáng),補(bǔ)腎強(qiáng)腰、益氣安神、活血通絡(luò)[9]。

有研究稱,短梗五加可顯著延長(zhǎng)異戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠及大鼠睡眠時(shí)間,改善睡眠質(zhì)量[10]。還有多種食用功效如抗炎鎮(zhèn)痛、提高免疫、抗腫瘤、抗血栓、抗血小板凝集等作用[11-12]。短梗五加作為山野菜食用已有幾千年歷史,既是藥食同源食品,也是新型保健食品的優(yōu)質(zhì)原料。

目前從短梗五加中提取皂苷類物質(zhì)的研究較少,本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取短梗五加總皂苷的方法,在此基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,為工業(yè)上提取短梗五加總皂苷提供方便、快捷并安全有效的方法,為合理利用新資源食品短梗五加提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

短梗五加莖 購(gòu)于遼寧丹東五加高新農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司;人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%) 中國(guó)食品藥品檢定研究院;無(wú)水乙醇(分析純)、冰醋酸 天津市永大化學(xué)試劑廠;高氯酸 天津政成化學(xué)制品有限公司;香草醛 天津市精細(xì)化工研究所。

HC-7P11-5型架盤藥物天平 上海精科科技有限公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海恒科有限公司;UV5100B型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。DEF-500型500 g搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;KQ-500VDED雙頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FA2004B型電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;TDL-4A離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 短梗五加總皂苷的提取 短梗五加根莖,60 ℃烘干,粉碎過45目篩,石油醚脫脂,在一定料液比、乙醇濃度等條件下進(jìn)行超聲提取[13-14],過濾后濾液減壓濃縮,用水飽和正丁醇溶液萃取過夜;分離出正丁醇相,經(jīng)減壓濃縮、真空干燥后得短梗五加總皂苷。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取干燥至恒重的人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,甲醇溶解定容至100 mL,配制成0.1 mg/mL的溶液,即為人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液,在300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,確定人參皂苷Re對(duì)照溶液最大吸收峰。

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80 mL于100 mL小燒杯中,水浴揮去溶劑,加入0.2 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液,0.8 mL高氯酸,于60 ℃水浴加熱15 min,取出流水冷卻,加5 mL冰醋酸,搖勻,靜置20 min,以去除人參皂苷的溶液隨行空白,在545 nm處測(cè)吸光值。以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程。

1.2.3 短梗五加總皂苷含量測(cè)定及計(jì)算得率 準(zhǔn)確稱取短梗五加樣品0.5 g于小燒杯中,加入一定濃度乙醇溶液,超聲輔助提取后,將提取液離心,乙醇定容至50 mL。準(zhǔn)確吸取1 mL于100 mL燒杯內(nèi),其余步驟與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法中水浴揮干溶劑項(xiàng)下的相同,用紫外分光光度法測(cè)其吸光值A(chǔ),總皂苷得率計(jì)算見公式(1)。

式(1)

式中:Y-短梗五加總皂苷得率,%;c-皂苷質(zhì)量濃度,mg/mL;N-稀釋倍數(shù);m-短梗五加粉末質(zhì)量,g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 選取料液比、超聲功率、超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)四個(gè)單因素,確定其適宜的范圍,平行實(shí)驗(yàn)三次,取平均值。

1.2.4.1 不同料液比對(duì)總皂苷得率的影響 準(zhǔn)確稱取短梗五加粉0.50 g,料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 mL,在溫度為40 ℃,超聲功率為400 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的條件下超聲30 min。測(cè)定方法同按1.2.3中所述,按公式(1)計(jì)算得率。

1.2.4.2 不同超聲功率對(duì)總皂苷得率的影響 準(zhǔn)確稱取短梗五加粉0.50 g,超聲功率分別為300、350、400、450、500 W,在溫度為40℃、液料比為1∶50,乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的條件下超聲30 min。測(cè)定方法同按1.2.3中所述,按公式(1)計(jì)算得率。

1.2.4.3 不同超聲時(shí)間對(duì)總皂苷得率的影響 準(zhǔn)確稱取短梗五加粉0.50 g,超聲時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min,在溫度為40℃、功率為350 W,料液比為1∶50,乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的條件下。測(cè)定方法同按1.2.3中所述,按公式(1)計(jì)算得率。

1.2.4.4 不同乙醇濃度對(duì)總皂苷得率的影響 準(zhǔn)確稱取短梗五加粉0.50 g,乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%,在溫度為40℃、超聲功率為350 W,料液比為1∶50的條件下超聲40 min。測(cè)定方法同按1.2.3中所述,按公式(1)計(jì)算得率。

1.2.5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最優(yōu)提取條件 綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15],在四因素三水平上,根據(jù)響應(yīng)面結(jié)果確定短梗五加總皂苷的提取工藝,因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003分析數(shù)據(jù),計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖,各提取條件平行測(cè)定3次,p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過Design Expert 7.0.0軟件對(duì)短梗五加總皂苷的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液在545 nm波長(zhǎng)下有最大吸光值,即人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品溶液的λmax=545 nm。詳見圖1。

圖1 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品光譜掃描曲線Fig.1 Standard alcohol solution of ginseng saponin Re

人參皂苷Re含量與其在545 nm波長(zhǎng)下的吸光值之間有較好的線性關(guān)系,見圖2。

圖2 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ginseng saponin Re

當(dāng)人參皂苷Re的濃度為0～0.03 mg/mL范圍時(shí),得到的線性回歸方程為Y=31.82X+0.005(R2=0.9993)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)短梗五加中總皂苷得率的影響 由圖3可知,在料液比為1∶20～1∶50 g/mL之間時(shí),總皂苷得率隨料液比的增加而明顯增大,在1∶50 g/mL處達(dá)到最大值,在料液比為1∶60 g/mL時(shí)提取率反而下降,這可能由于液料比為1∶50 g/mL時(shí)皂苷溶解達(dá)到最大值,但隨著提取液增加皂苷溶解已達(dá)到飽和,其他非皂苷類成分隨之溶出。故增加溶劑用量并不能提高提取率,因此料液比應(yīng)選擇在1∶50 g/mL時(shí)較為合適。

圖3 料液比對(duì)短梗五加總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on the yield of total saponin

2.2.2 超聲功率對(duì)短梗五加總皂苷得率的影響 由圖4可知,在超聲功率為300～350 W之間時(shí),總皂苷得率隨著超聲功率的增加而逐漸增大,在350W處達(dá)到最大值,在超聲功率350 W之后隨超聲功率增加得率反而下降。這可能由于隨著超聲功率增加,提取溫度隨之上升,由超聲功率引發(fā)的機(jī)械剪切力的增大及瞬間高溫會(huì)破壞皂苷類物質(zhì)結(jié)構(gòu)。因此提取時(shí)最適超聲功率為350 W。

圖4 超聲功率對(duì)短梗五加總皂苷得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on the yield of total saponin

2.2.3 超聲時(shí)間對(duì)短梗五加總皂苷得率的影響 由圖5可知,在超聲時(shí)間為20～40 min之間時(shí),總皂苷得率隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大,在40 min處達(dá)到最大值,在超聲時(shí)間40 min后隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)得率反而下降。這可能由于長(zhǎng)時(shí)間超聲波處理,非皂苷類物質(zhì)溶出增加和已溶出的皂苷發(fā)生分解,故適宜的超聲時(shí)間為40 min。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)短梗五加總皂苷得率的影響Fig.5 Effects of ultrasonic time on the yield of total saponin

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)短梗五加總皂苷得率的影響Fig.6 Effects of ethanol concentration on the yield of total saponin

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)短梗五加總皂苷得率的影響 圖6可知,在乙醇體

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸方程系數(shù)及顯著性檢測(cè)

注:*:p<0.05,差異顯著;**:p<0.01,差異極顯著。積分?jǐn)?shù)為50%～70%之間時(shí),總皂苷得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而明顯增大,在70%處達(dá)到最大值,后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而下降。這是由于隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大抑制乙醇向物料滲透,影響皂苷浸出,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)皂苷最大程度地溶出,故選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.3 響應(yīng)面法分析設(shè)計(jì)

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 應(yīng)用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),選擇料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲功率為考察因素,以總皂苷得率為響應(yīng)值,優(yōu)化最佳工藝參數(shù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

由上述響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果和回歸模型的方差分析得到因素交互作用的響應(yīng)曲面圖。以總皂苷得率為響應(yīng)值,提取工藝各因素經(jīng)二次回歸擬合后,得到回歸方程為:皂苷得率=1.220-0.012A+0.010B+0.002833C+0.004917D+0.001750AB+0.016AC+0.073AD+0.016BC-0.022BD-0.001000CD-0.21A2-0.23B2-0.25C2-0.22D2

由圖7可以看出,乙醇體積分?jǐn)?shù)保持在70%時(shí),總皂苷得率隨料液比增加而增加,當(dāng)料液比為1∶50時(shí),總皂苷得率最大,隨料液比繼續(xù)增加得率開始降低。圖8可以看出,由超聲功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用的等高線可知,沿乙醇體積分?jǐn)?shù)軸向等高線比沿超聲功率軸向密集,且等高線呈橢圓形,說明兩因素交互作用較強(qiáng),影響顯著[16]。圖9可以看出,乙醇體積分?jǐn)?shù)曲面較超聲時(shí)間曲面陡峭,說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)響應(yīng)值的影響比超聲時(shí)間影響顯著,隨著超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加響應(yīng)值先增大后減小。圖10可以看出,由超聲功率和料液比交互作用的等高線可知,沿料液比軸向等高線比沿超聲功率軸向密集,且等高線呈橢圓形,說明兩因素交互作用較強(qiáng),影響顯著。圖11可以看出,超聲時(shí)間和料液比交互作用的響應(yīng)曲面圖均較陡峭,由二者等高線可以看出沿料液比軸向等高線更密集,說明料液比對(duì)響應(yīng)值的影響比超聲時(shí)間影響顯著。圖12可以看出,超聲功率與超聲時(shí)間交互作用的響應(yīng)曲面圖,沿超聲時(shí)間軸向等高線比沿超聲功率軸向更密集,說明超聲時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響比超聲功率影響顯著。通過此種方法也可以看出B(乙醇體積分?jǐn)?shù))>A(料液比)>C(超聲時(shí)間)>D(超聲功率),與回歸分析結(jié)果一致。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface figures of material to liquid ratio and ethanol concentration

圖8 超聲功率與乙醇體積分?jǐn)?shù)的響應(yīng)曲面圖Fig.8 Response surface figures of ultrasonic power and ethanol concentration

圖9 超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface figures of ultrasonic time and ethanol concentration

圖10 超聲功率與料液比的響應(yīng)曲面圖Fig.10 Response surface figures of ultrasonic power and material to liquid ratio

圖11 超聲時(shí)間與料液比的響應(yīng)曲面圖Fig.11 Response surface figures of ultrasonic time and material to liquid ratio

圖12 超聲功率與超聲時(shí)間的響應(yīng)曲面圖Fig.12 Response surface figures of ultrasonic power and ultrasonic time

通過軟件分析確定最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為67.96%,料液比為1∶50.69 g/mL,超聲功率為346.10 W,超聲時(shí)間為40.84 min,該條件下短梗五加總皂苷得率理論值1.586%。根據(jù)實(shí)際操作情況將提取條件改為乙醇體積分?jǐn)?shù)為68%,料液比為1∶50 g/mL,超聲功率為350 W,超聲時(shí)間為41 min,在此條件下平行3次進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。得總皂苷平均得率為1.577%,與預(yù)測(cè)值偏差不大,且測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定,說明響應(yīng)面模型與實(shí)際情況擬合良好。因此,該結(jié)果合理可靠。

3 結(jié)論

采用超聲輔助有機(jī)溶劑提取短梗五加總皂苷,通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法分析優(yōu)化短梗五加總皂苷的最佳提取工藝參數(shù),得出最佳提取工藝為乙醇濃度為68%,料液比為1∶50 g/mL,超聲功率為350 W,超聲時(shí)間為41 min,此時(shí)短梗五加總皂苷的提取率為1.577%。同時(shí)超聲波輔助提取法省時(shí)、低能耗、成本低、效果好,工藝簡(jiǎn)單,易于商業(yè)化生產(chǎn),為更好開發(fā)利用短梗五加總皂苷提供參考和依據(jù)。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction of total saponin fromAcanthopanaxsessiliflorususing response surface methodology

LI Jian1,XIE Jing1,LIU Ning1,LI Ting-li2

(1.College of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China; 2.College of Pharmacy,Heilongjiang University Of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

The root stem ofAcanthopanaxsessiliflorus(Rupr. et Maxim.)Seem was used as the raw material,ultrasonic assisted extraction of total saponins fromAcanthopanaxsessiliflorus. The effect of material-to-liquid ratio,ethanol concentration,ultrasonic time,ultrasonic power on the extraction result of the total saponin ofAcanthopanaxsessilifloruswas studied. On the basis of single factor experiment,Box-Behnken Design is applied to build a regression model,with the yield rate of total saponin as response value. Establish regression model and according to this,the optimal extraction combination was follows:material-to-liquid ratio 1∶50,ethanol concentration 68%,ultrasonic time 41 min,ultrasonic power 350 W. In this condition,the yield of the total saponin is 1.577%. The true value of the experiment accords with the predictive value of the model was 1.586%,show that response surface center combination method is reasonable and feasible,which can optimize the extraction process of total saponins fromAcanthopanaxsessiliflorus.

Acanthopanaxsessiliflorus;total saponin;ultrasonic extraction;response surface methodology

2016-05-20

李健(1956-),男,學(xué)士,教授,研究方向:食品科學(xué),E-mail:lijian4852147@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81274114)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000