李 普 夏秋琴 劉貴梅 盧永翎 呂麗爽

(南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097)

賴氨酸在Maillard 反應(yīng)中形成有害產(chǎn)物AGEs的研究

李 普 夏秋琴 劉貴梅 盧永翎 呂麗爽

(南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097)

模擬食品加工條件，構(gòu)建賴氨酸—還原糖和精氨酸—賴氨酸—還原糖體系，分析各影響因素在體系發(fā)生Maillard反應(yīng)中產(chǎn)生有害AGEs(晚期糖基化終末產(chǎn)物)的作用，比較兩個(gè)體系添加和不添加黃酮條件下對(duì)AGEs形成量的影響。用熒光光譜法(λex /λem =370 / 440 nm)測(cè)定AGEs的含量，考察不同因素如還原糖種類、濃度、金屬離子、溫度、pH和染料木素對(duì)有害AGEs形成的影響，以及賴氨酸/精氨酸并存對(duì)AGEs形成量的影響。結(jié)果表明：在賴氨酸發(fā)生Maillard反應(yīng)過(guò)程中，溫度越高、還原糖中核糖，糖濃度越大、pH 9.2，形成的AGEs越多；不同的金屬離子對(duì)AGEs的作用各異，Mg2+和Fe2+能促進(jìn)AGEs的形成，Ca2+抑制AGEs的形成；抑制劑染料木素濃度越大(9 mmol/L)，AGEs抑制效果越好；賴氨酸/精氨酸混合體系中AGEs形成量主要由賴氨酸來(lái)決定。各影響因素對(duì)賴氨酸Maillard反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生AGEs均有一定作用，時(shí)間是最主要因素，其次是pH和溫度；而賴氨酸/精氨酸混合體系中AGEs的形成量取決于賴氨酸的含量。

熒光性晚期糖基化終末產(chǎn)物；賴氨酸；美拉德反應(yīng)；熒光光譜法

加工和貯藏過(guò)程中所發(fā)生的一些化學(xué)變化不僅改變了食品的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些有害物質(zhì)。美拉德反應(yīng)(又稱非酶糖基化)對(duì)于食品風(fēng)味、色澤的形成皆具重要作用[1]；但是非酶糖基化反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的晚期糖基化終末產(chǎn)物[2]，AGEs是一類物質(zhì)的總稱，目前已發(fā)現(xiàn)20多種AGEs，在體內(nèi)以多種不同的形式存在，包括羧甲基賴氨酸(CML)、吡咯素、戊糖素、羧乙基賴氨酸(CEL)等[3-4]。AGEs通過(guò)在體內(nèi)蓄積[5-6]可以導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，如阿茲海默癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病病癥、慢性心臟衰竭等[7-9]。人體試驗(yàn)[10]研究發(fā)現(xiàn)，高AGEs膳食與低AGEs膳食相比，能更為嚴(yán)重地?fù)p傷II型糖尿病患者的血管功能。

Goldberg等[11]研究表明，肉類以及肉類替代品中AGEs的含量平均可以達(dá)到43 kU/g；脂肪類食品中AGEs可達(dá)到100 kU/g(1 U≈1.660×10-27kg)，平均含量最高，碳水化合物類食品中AGEs僅為3.4 kU/g，平均含量最低。房紅娟等[12]研究發(fā)現(xiàn)油炸類食品(如麻花、油條等)的AGEs含量均在100 AU之上，麻花、油條分別達(dá)到(186.365±1.337)，(100.553±1.981) AU。Koschinsky等[13]研究認(rèn)為，大約10%的食源性AGEs與體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)和組織中的AGEs有著密切聯(lián)系。其中賴氨酸含有兩個(gè)氨基(伯)，因此由賴氨酸及蛋白質(zhì)賴氨酸殘基引發(fā)的糖基化反應(yīng)最為普及，廣泛引起食品界關(guān)注，所以，構(gòu)建賴氨酸還原糖體系并研究不同因素對(duì)該體系中熒光性AGEs形成的影響，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

部分AGEs具有一定的熒光吸收，其熒光強(qiáng)度隨著體系中AGEs濃度的增大而增大[14]。熒光光譜法(λex = 340～370 nm和λem = 420～440 nm)可以較為直觀地表征Maillard反應(yīng)中熒光性AGEs的總含量。本試驗(yàn)針對(duì)還原糖濃度、金屬離子、溫度、pH和染料木素等各影響因素，分析各因素對(duì)賴氨酸—還原糖體系中AGEs形成的影響，并確定主要因素。進(jìn)而結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期精氨酸—還原糖試驗(yàn)結(jié)果[15]，分析賴氨酸—精氨酸—還原糖體系中決定AGEs形成關(guān)鍵因素。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑與儀器

1.1.1 試劑

精氨酸、賴氨酸：分析純，上海生物生工有限公司；

果糖、半乳糖、葡萄糖、核糖：分析純，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；

染料木素：分析純，南京廣潤(rùn)生物制品有限公司

1.1.2 儀器

數(shù)字式pH計(jì)：PHS-3C型，上海三信儀表廠；

TECAN多孔酶標(biāo)儀：Infinite 200Pro型，瑞士帝肯貿(mào)易有限公司；

微型漩渦混合儀：XW-80A型，上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 糖的種類和濃度對(duì)賴氨酸引發(fā)的Maillard反應(yīng)中有害產(chǎn)物AGEs的影響 參照文獻(xiàn)[15]建立賴氨酸—還原糖體系，測(cè)定不同還原糖種類和濃度條件下，λex/λem=370 nm/440 nm處熒光值。

1.2.2 溫度對(duì)賴氨酸引發(fā)的Maillard反應(yīng)中有害產(chǎn)物AGEs的影響 參照文獻(xiàn)[15]的方法模擬食品加工條件構(gòu)建賴氨酸—還原糖反應(yīng)，測(cè)定不同溫度條件下λex/λem=370 nm/440 nm處熒光值，即AGEs的量。

1.2.3 金屬離子對(duì)賴氨酸引發(fā)的Maillard反應(yīng)中有害產(chǎn)物AGEs的影響 參照文獻(xiàn)[15]的方法模擬食品加工條件構(gòu)建賴氨酸—還原糖反應(yīng)，測(cè)定5種金屬離子各自存在時(shí)體系中AGEs量。

1.2.4 pH對(duì)賴氨酸引發(fā)Maillard反應(yīng)中有害產(chǎn)物AGEs的影響 參照文獻(xiàn)[15]的方法模擬食品加工條件構(gòu)建賴氨酸—還原糖反應(yīng)，測(cè)定不同pH條件下，體系中AGEs量。

1.2.5 染料木素含量對(duì)賴氨酸引發(fā)Maillard反應(yīng)中有害產(chǎn)物AGEs的影響 參照文獻(xiàn)[15]的方法模擬食品加工條件構(gòu)建賴氨酸—還原糖體系，測(cè)定添加不同濃度(1.5～9.0 mmol/L)染料木素時(shí)，體系中AGEs的量。

1.2.6 賴氨酸/精氨酸—葡萄糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的測(cè)定 用0.2 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液分別配置濃度為1，2，3 mmol/L的賴氨酸和精氨酸溶液各25 mL，配置濃度為4 mmol/L的葡萄糖溶液50 mL。在不同的10 mL試管中分別加入最終摩爾濃度比為1∶1∶4，1∶2∶4，1∶3∶4，2∶1∶4，3∶1∶4的賴氨酸、精氨酸和葡萄糖溶液各2 mL，再加2 mL PBS。以磷酸鹽緩沖液代替氨基酸溶液做空白對(duì)照，參照文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定體系中AGEs量。

1.2.7 染料木素抑制賴氨酸/精氨酸—葡萄糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的測(cè)定 根據(jù)1.2.6的試驗(yàn)結(jié)果，選取其中熒光值最高的一組濃度(賴氨酸∶精氨酸∶葡萄糖=3∶1∶4)進(jìn)行本組實(shí)驗(yàn)。分別將賴氨酸、精氨酸和葡萄糖溶解于0.2 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，分別取2 mL賴氨酸，2 mL精氨酸，2 mL葡萄糖于10 mL樣品管中，使賴氨酸、精氨酸和葡萄糖的最終濃度分別為3，1，4 mmol/L，加入2 mL染料木黃酮溶液，使其濃度為1.5，3，6，9 mmol/L。參照文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定體系中AGEs量。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel2010、Minitab16分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 賴氨酸—糖體系發(fā)生Maillard反應(yīng)產(chǎn)生有害產(chǎn)物AGEs的研究

2.1.1 糖的種類和濃度對(duì)賴氨酸-還原糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的作用 圖1結(jié)果表明，反應(yīng)240 min時(shí)，在4種賴氨酸—還原糖體系中，還原糖的濃度越大，體系中熒光性AGEs的形成量就越多。其中在賴氨酸—核糖模型中形成的熒光性AGEs的量最高，而果糖、半乳糖、葡萄糖誘導(dǎo)產(chǎn)生AGEs的量相差不大；核糖在糖濃度為3 mmol/L時(shí)體系中，產(chǎn)生的AGEs量大約是另外3種糖分別與賴氨酸反應(yīng)形成AGEs量的2倍。原因推測(cè)核糖為五碳糖，果糖、半乳糖、葡萄糖為六碳糖，而五碳糖的反應(yīng)活性和速率遠(yuǎn)大于六碳糖[16]。Bunn等[17]研究表明，葡萄糖99%以上的六元環(huán)結(jié)構(gòu)是高度穩(wěn)定的，相對(duì)于其它糖類不容易受到來(lái)自其他分子的親和攻擊；與此同時(shí)，葡萄糖以其環(huán)狀結(jié)構(gòu)高度穩(wěn)定性，限制蛋白質(zhì)發(fā)生潛在有害的非酶糖基化反應(yīng)。Jalbout等[18]也證實(shí)開(kāi)環(huán)的核糖更易形成Amadori產(chǎn)物，因而比環(huán)狀的六碳糖反應(yīng)要快。

圖1 糖的種類和濃度對(duì)賴氨酸—還原糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的作用

將該試驗(yàn)結(jié)果與本課題組[15]前期報(bào)道的Arg還原糖體系的結(jié)果相對(duì)比，盡管AGEs的總量偏高，但還原糖濃度和種類的變化對(duì)兩種氨基酸體系熒光性AGEs的量帶來(lái)的影響，差異性不顯著。

2.1.2 溫度對(duì)賴氨酸—還原糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的作用 圖2是反應(yīng)時(shí)間為240 min時(shí)，溫度對(duì)賴氨酸—還原糖模擬體系產(chǎn)生熒光性AGEs的影響。由圖2可知，溫度對(duì)賴氨酸—還原糖模型中熒光性AGEs的形成有很大的影響；且溫度越高，產(chǎn)生的熒光性AGEs越多。在較低溫度(37，60 ℃)下，熒光性AGEs形成量無(wú)明顯變化；當(dāng)溫度≥85 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，體系中熒光性AGEs的形成量顯著增加，并在121 ℃時(shí)達(dá)到最高值。很顯然是因?yàn)楦邷卮龠M(jìn)了美拉德反應(yīng)的進(jìn)程。對(duì)比4種不同的還原糖可知，核糖體系產(chǎn)生的熒光性AGEs最多，其他3種還原糖產(chǎn)生的AGEs量差別不大。相比前期發(fā)表的Arg還原糖模型[15]，Lys還原糖模型相同條件下產(chǎn)生的熒光性AGEs含量均高于Arg模型，最高差別約1倍以上；且不同還原糖之間差異較大。

圖2 溫度對(duì)賴氨酸—還原糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的作用

2.1.3 金屬離子對(duì)賴氨酸—還原糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的作用 圖3為賴氨酸—還原糖模擬體系中，金屬離子對(duì)熒光性AGEs形成的影響。由圖3可知，不同金屬離子對(duì)體系中熒光性AGEs的形成影響不同。其中，Ca2+會(huì)抑制體系熒光性AGEs的產(chǎn)生，Mg2+和Fe2+會(huì)促進(jìn)熒光性AGEs的形成，而其他金屬離子的作用效果則不明顯。這是因?yàn)榻饘匐x子可以促進(jìn)氫過(guò)氧化物的降解，從而促進(jìn)自由基生成，而自由基在AGEs的生成中起著重要的作用[19]。Ramonaityte等[20]的研究表明過(guò)渡金屬離子如Fe3+、Fe2+等會(huì)通過(guò)催化作用形成自由基而促進(jìn)AGEs的產(chǎn)生。

但在本課題組[15]前期研究的Arg—還原糖模型中，5種金屬離子均會(huì)增加體系中熒光性AGEs產(chǎn)生的量，而且不同金屬離子在不同還原糖模型體系中的作用效果不同。在核糖和果糖體系中，金屬離子誘導(dǎo)產(chǎn)生的熒光性AGEs量比較大，其次是半乳糖，葡萄糖體系影響最低。金屬離子對(duì)兩種氨基酸糖基化反應(yīng)的差異性原因有待進(jìn)一步研究。

2.1.4 pH對(duì)賴氨酸—還原糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的作用 圖4為反應(yīng)240 min時(shí)，pH對(duì)賴氨酸—還原糖模擬體系熒光性AGEs的影響。由圖4可知，在本研究設(shè)定的4種pH(4.0，6.5，7.4，9.2)條件下，pH越偏堿性，體系的熒光性AGEs的形成量就越高，pH 9.2時(shí)產(chǎn)生的熒光性AGEs含量最高，而pH 4.0時(shí)產(chǎn)生量較少。這是由于在偏酸性條件下，Maillard的前體物質(zhì)N-葡萄糖胺容易被水解，從而導(dǎo)致反應(yīng)速率降低[21]；堿性條件能顯著促進(jìn)美拉德反應(yīng)尤其是其后期反應(yīng)的進(jìn)行[22]。在4種還原糖模型中，形成熒光性AGEs量最大的體系為賴氨酸—核糖，反應(yīng)強(qiáng)度最大，其他糖反應(yīng)活性依次排序?yàn)楣?、半乳糖和葡萄糖。該反?yīng)趨勢(shì)與前期精氨酸試驗(yàn)[15]結(jié)果相一致。

圖3 金屬離子對(duì)賴氨酸—還原糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的影響

圖4 pH對(duì)賴氨酸—還原糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的影響

2.1.5 染料木素對(duì)賴氨酸—核糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的影響 圖5為賴氨酸—還原糖模擬體系中，染料木素對(duì)熒光性AGEs形成的影響。由圖5可知，染料木黃酮的濃度越大、反應(yīng)的時(shí)間越長(zhǎng)，其抑制效果越好。當(dāng)時(shí)間為240 min、染料木素濃度為9 mmol/L時(shí)，熒光性AGEs的抑制率達(dá)到96%，效果良好。該試驗(yàn)結(jié)果與前期研究[15]精氨酸—糖體系的抑制率95%相一致。表明黃酮對(duì)不同的糖基化體系均能達(dá)到顯著的抑制效果。Jung D. H等[23]研究發(fā)現(xiàn)染料木素能阻斷AGEs與多種不同的細(xì)胞表面受體RAGE的結(jié)合，AGE—RAGE交聯(lián)導(dǎo)致病變。染料木素含量越高，阻斷效果越好。2.1.6 各影響因素對(duì)體系中有害產(chǎn)物AGEs的貢獻(xiàn)值分析 如表1所示，在賴氨酸—還原糖模擬體系中，影響熒光性AGEs產(chǎn)生的因素，第一位是時(shí)間，其次是pH，第三是溫度。而其他因素對(duì)體系熒光性AGEs的形成所占比例較低且相差不大。對(duì)照前期研究[15]精氨酸—還原糖體系，前3個(gè)主要影響因素依次為時(shí)間、還原糖種類和pH。由此，不同氨基酸發(fā)生糖基化反應(yīng)過(guò)程中，對(duì)比各影響因素的貢獻(xiàn)值發(fā)現(xiàn)，時(shí)間是關(guān)鍵因素，其次是對(duì)pH的敏感性，而溫度和還原糖種類相差較大。

圖5 染料木素對(duì)賴氨酸—核糖體系中有害產(chǎn)物AGEs的影響

因素貢獻(xiàn)值因素貢獻(xiàn)值時(shí)間41.04溫度×?xí)r間2.62溫度9.86還原糖×?xí)r間0.82還原糖0.95還原糖濃度×?xí)r間2.95還原糖濃度6.30pH×?xí)r間8.44pH13.84金屬離子×?xí)r間0.68金屬離子2.04染料木黃酮×?xí)r間0.01染料木黃酮0.19誤差5.27

2.2 賴氨酸/精氨酸—葡萄糖體系產(chǎn)生熒光性AGEs的研究

2.2.1 賴氨酸/精氨酸—葡萄糖體系熒光性AGEs的產(chǎn)生情況 鑒于不同氨基酸發(fā)生糖基化反應(yīng)的差異性，以及在食品體系中多種氨基酸的共存，選取兩種易于與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的氨基酸，賴氨酸(兩個(gè)伯氨基)、精氨酸(多氨基)，建立賴氨酸/精氨酸—葡萄糖體系。由圖6可知，賴氨酸/精氨酸—葡萄糖體系中，相對(duì)熒光值RFU隨著賴氨酸比例的增大而提高，但精氨酸比例提高則幾乎沒(méi)變化。本課題的前期研究[15]表明在精氨酸—葡萄糖體系中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)熒光值RFU在240 min即可達(dá)到20 000。而當(dāng)兩種氨基酸共存發(fā)生Maillard反應(yīng)時(shí)，體系中AGEs的產(chǎn)生主要由賴氨酸的含量來(lái)決定，推測(cè)其原因可能是，兩分子賴氨酸可以發(fā)生交聯(lián)作用(賴氨酸—賴氨酸—糖)[24]，另外賴氨酸與精氨酸也進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)(賴氨酸—精氨酸—糖)[24]。

2.2.2 染料木素對(duì)賴氨酸/精氨酸—葡萄糖體系A(chǔ)GEs形成的影響 圖7是染料木素對(duì)賴氨酸/精氨酸—葡萄糖體系產(chǎn)生熒光性AGEs的影響。由圖7可知，在添加染料木素后，賴氨酸/精氨酸—葡萄糖體系中相對(duì)熒光值RFU明顯下降，3組試驗(yàn)的RFU在反應(yīng)前2 h均下降到了半值以下。且其抑制率與染料木素的添加量呈量效關(guān)系，染料木素的濃度越大，抑制率越高，說(shuō)明染料木素對(duì)賴氨酸/精氨酸共存體系中熒光性 AGEs的產(chǎn)生有明顯的抑制作用。

圖6 賴氨酸/精氨酸—葡萄糖體系A(chǔ)GEs的產(chǎn)生

圖7 染料木素對(duì)賴氨酸/精氨酸—葡萄糖體系A(chǔ)GEs形成的影響

3 結(jié)論

各種影響因素對(duì)于賴氨酸—還原糖體系中熒光性AGEs的產(chǎn)生皆有明顯的影響。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為定值時(shí)，溫度、還原糖濃度和pH越高，產(chǎn)生熒光性AGEs的量就越高；染料木素的濃度越大對(duì)熒光性AGEs的抑制效果越好，且有顯著抑制作用。通過(guò)分析各個(gè)影響因素的貢獻(xiàn)值，反應(yīng)時(shí)間是賴氨酸—還原糖體系產(chǎn)生熒光性AGEs的決定性因素，其次為pH；第三為溫度，其他因素對(duì)熒光性AGEs產(chǎn)生的影響較小且差別不大。當(dāng)賴氨酸和精氨酸共存時(shí)，賴氨酸含量決定混合體系精氨酸/賴氨酸—葡萄糖反應(yīng)中產(chǎn)生AGEs的量，精氨酸含量的高低影響不大。

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Studies on formation of AGEs by lysine in maillard reaction

LI PuXIAQiu-qinLIUGui-meiLUYong-lingLULi-shuang

(GinlingCollege,NanjingNormalUniversity,Nanjing,Jiangsu210097,China)

[Purpose] The different influencing factors are investigated on producing AGEs by Lysine in Maillard reaction, and the different between single amino acid (Lysine, or Argine) -reducing and mixed Lys- Arg -reducing sugar system are compared. [Method] Fluorescence spectrometry (λex /λem =370 / 440 nm) is used to detect the amount of AGEs, the factors of sort and concentration of sugar, metal ion, temperature, pH and genistein concentration in Maillard reaction and proportion of lysine and arginine in Lys/Arg-reducing sugar system was discussed. [Result] The increasing of sugar concentration, pH, or temperature, the more amounts of AGEs was produced. Fe2+and Mg2+could promote the formation of AGEs. But metal ion (Ca2+) could inhibit the formation of AGEs; at the present of 9 mmol/L genistein, the inhibitory ratio is the best. The lysine played an important role on the Lys-Arg cross-linking with glucose in Lys/Arg-reducing sugar system. [Conclusion] All the factors have a little bit impact on the formation of AGEs, and genistein can significantly suppress the formation of AGEs. The reaction time is the main point on the formation of AGEs, the second is pH and temperature. Additionally, the lysine played an important role on the formation of fluorescent AGEs in Lys-Arg-glucose system.

advanced glycation end products; lysine; maillard reaction; fluorescence spectrometry

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.006

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(編號(hào)：31571783)

李普，男，南京師范大學(xué)在讀碩士研究生。

呂麗爽(1969—)，南京師范大學(xué)副教授，博士。 E-mail: lishuanglv@126.com

2016-09-26