趙娟娟 吳榮榮

(衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北 衡水 053000)

發(fā)酵型核桃乳生產(chǎn)專用鏈球菌的選育

趙娟娟 吳榮榮

(衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北 衡水 053000)

從發(fā)酵面包、白芥絲、泡菜、醬黃瓜中，分離到14株鏈球菌，經(jīng)過(guò)產(chǎn)酸特性測(cè)試，菌株HsS5、HsS6、HsS8、HsS9適合核桃乳發(fā)酵。通過(guò)菌落形態(tài)、菌體形態(tài)、生化特性和16S rRNA 基因序列分析，確定4株鏈球菌均為嗜熱鏈球菌。采用菌株HsS5、HsS6、HsS8、HsS9分別與實(shí)驗(yàn)室保存的嗜酸乳桿菌 LA 共同發(fā)酵，發(fā)酵型核桃乳感官評(píng)價(jià)分別為96，91，93，86分；且4個(gè)發(fā)酵核桃乳中9種氨基酸都有不同程度的提高，其中HsS5氨基酸含量增幅最大，由0.67%增加到1.75%。綜上所述，菌株HsS5適宜核桃乳的發(fā)酵生產(chǎn)。

發(fā)酵核桃乳；鏈球菌；分離；鑒定

核桃營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，其中含有大量蛋白質(zhì)，較高的不飽和脂肪酸，豐富的維生素 B 和 E 及鈣、磷、鐵等多種人體需要的微量元素，常食用對(duì)動(dòng)脈硬化、高血壓、抗衰老有良好的保健作用[1-2]。發(fā)酵型核桃乳是以核桃乳為原料，經(jīng)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵來(lái)提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善風(fēng)味，提高食品的保藏性和適口性。發(fā)酵過(guò)程中，核桃乳中的蛋白質(zhì)被分解成肽、氨基酸，礦物質(zhì)、B族維生素等物質(zhì)，賦予食品特殊的香氣和風(fēng)味，并增加了產(chǎn)品的腸道保健功能[3-5]。

目前關(guān)于發(fā)酵的核桃乳產(chǎn)品，主要是以牛乳或其他為主要原料，添加一定比例的核桃乳發(fā)酵制成發(fā)酵核桃酸奶。真正用純核桃乳發(fā)酵的很少，僅局限在配方上，且沒(méi)有研究純核桃乳的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，主要是由于缺少專門發(fā)酵純核桃乳的商品發(fā)酵劑。

本研究擬從不同來(lái)源的材料中分離鏈球菌，并通過(guò)形態(tài)特征、生理生化和16S rDNA序列分析，確定其分類地位，將鑒定后的菌株進(jìn)行產(chǎn)酸特性和核桃乳發(fā)酵試驗(yàn)，從而確定適合核桃乳發(fā)酵的鏈球菌菌株[6]，旨在為發(fā)酵核桃乳產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

發(fā)酵面包、白芥絲、泡菜、醬黃瓜：市售。

1.2 培養(yǎng)基

MC培養(yǎng)基：酵母粉3.0 g/L，牛肉粉3.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，大豆蛋白胨5.0 g/L，乳糖20.0 g/L，碳酸鈣10.0 g/L，1%中性紅溶液5.0 g/L，加入1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入中性紅溶液。分裝后121 ℃高壓滅菌15～20 min。固體培養(yǎng)基需加入瓊脂1.3%～1.5%；

PY培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g/L，胰酶水解酪蛋白5.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，鹽溶液40.0 g/L，無(wú)水CaCl20.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.48 g/L，K2HPO41.0 g/L NaHCO310.0 g/L，NaCl 2.0 g/L。分裝后121 ℃高壓滅菌20 min；

碳水化合物發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，吐溫80 0.1 g/L，酵母膏2.5 g/L，1.6%的溴甲酚紫液1.0 g/L，分別按表1加入不同碳源，調(diào)pH=6.8，分裝試管后按其相應(yīng)的時(shí)間在114 ℃高壓蒸氣滅菌。

表1 碳水化合物發(fā)酵培養(yǎng)基

1.3 儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀：Takara Thermal Cycler Dice TP600型，日本TaKaRa公司；

電泳儀：Mupid型，美國(guó)Major Science公司；

電泳成像裝置：ImageMaster VDS型，安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司；

DNA測(cè)序儀：ABI PRISM3730XL DNA Sequencer型，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

pH計(jì)：MP-6100型，鹽城澳鼎儀器制造有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 鏈球菌的分離純化 上述的植物源產(chǎn)品過(guò)濾后吸取1 mL(面包為1 g)，用無(wú)菌生理鹽水按10倍稀釋至10-5，10-6，10-7。取0.1 mL稀釋液涂布在MC培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，劃線分離純化獲得菌株，經(jīng)鏡檢為純培養(yǎng)物后轉(zhuǎn)入固體斜面上，一部分于甘油保存，一部分在4 ℃冰箱中保存。

1.4.2 菌種的染色和形態(tài)觀察 將菌種接種于MC培養(yǎng)基上，觀察菌落的形態(tài)。用無(wú)菌接種環(huán)取一環(huán)菌染色后用油鏡進(jìn)行觀察，觀察菌株的形態(tài)。

1.4.3 鏈球菌代謝特性

(1) 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)：在MC培養(yǎng)基的菌落上滴加3%的H2O2，觀察有無(wú)氣泡產(chǎn)生。

(2) 精氨酸水解試驗(yàn)：將1～2 d MC液體培養(yǎng)物接種于精氨酸水解的培養(yǎng)基，用無(wú)菌的石蠟礦物油密封，倒置37 ℃下培養(yǎng)72 h后，觀察結(jié)果。

(3) 七葉苷水解試驗(yàn)：PY培養(yǎng)基中加入終濃度5 g/L的七葉苷，滅菌。將活化好的培養(yǎng)液接種于試管，37 ℃培養(yǎng)24～72 h后。取少量七葉苷培養(yǎng)液于比色盤內(nèi)，以未接種培養(yǎng)基作為對(duì)照，滴加少量檸檬酸鐵溶液，顯示黑色為陽(yáng)性反應(yīng)，不顯色則為陰性反應(yīng)。

(4) 碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)：按1%接種量，將活化好的培養(yǎng)液接種于不同碳水化合物的培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24～72 h。培養(yǎng)液變黃為陽(yáng)性反應(yīng)，反之為陰性反應(yīng)[7-8]。

1.4.4 鏈球菌的16S rRNA基因序列測(cè)序

(1) 變性：從培養(yǎng)基中挑取菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中變性后離心取上清作為模板。反應(yīng)條件為80 ℃，15 min。

(2) PCR 擴(kuò)增：使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176)，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

(3) 測(cè)序：使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(Code No.9762)切膠回收片段進(jìn)行測(cè)序。

CTG497-S5以SEQ Forward、SEQ Internal和16S SEQF1為引物進(jìn)行DNA測(cè)序；其余樣品均以SEQ Forward、SEQ Internal和SEQ Reverse為引物進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.4.5 核桃乳的發(fā)酵試驗(yàn)及質(zhì)量評(píng)定

(1) 酸度測(cè)定：取乳樣10 mL，加入20 mL蒸餾水和2～3滴酚酞試劑，用標(biāo)定過(guò)的0.100 4 mol/L NaOH溶液進(jìn)行滴定，酸度以吉爾涅爾度(T)表示。

(2) 感官評(píng)定：以色澤、香氣、滋味以及形態(tài)作為核桃乳感官評(píng)分指標(biāo)，邀請(qǐng)10人進(jìn)行試飲評(píng)判。評(píng)分結(jié)果取其平均值計(jì)算。具體評(píng)定細(xì)則見(jiàn)表2。

表2 口感外觀評(píng)分的標(biāo)準(zhǔn)

(3) 氨基酸的評(píng)定：采用分離獲得的鏈球菌與實(shí)驗(yàn)室保存的嗜酸乳桿菌LA，進(jìn)行核桃乳發(fā)酵試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵后氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，并與未發(fā)酵核桃乳的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈球菌的分離

由表3可知，共分離到乳酸菌14株，其中來(lái)自市售泡菜的4株，占總分離菌株的29%；來(lái)自市售發(fā)酵面包的3株，占總數(shù)的21%；來(lái)自市售醬黃瓜的2株，占總數(shù)的14%；來(lái)自市售白芥絲的5株，占總數(shù)的36%。鏈球菌形態(tài)，主要以卵圓形，細(xì)胞的排列呈對(duì)狀、短鏈、中等長(zhǎng)鏈、長(zhǎng)鏈等不同的排列方式。

2.2 鏈球菌的初步篩選

將菌株為HsS1～HsS14分別與實(shí)驗(yàn)室保存的嗜酸乳桿菌LA進(jìn)行核桃乳發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵產(chǎn)品酸度結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，經(jīng)過(guò)菌株HsS5、HsS6、HsS8、HsS9分別和嗜酸乳桿菌LA共同發(fā)酵后，產(chǎn)品酸度分別為42，41，43，45T，經(jīng)過(guò)感官評(píng)分，認(rèn)為酸度在40～45T的樣品，酸甜可口，組織狀態(tài)均一，故可作為后續(xù)研究用菌株。

表3 鏈球菌形態(tài)特征

表4 核桃乳樣品酸度測(cè)定結(jié)果

2.3 鏈球菌的鑒定

2.3.1 鏈球菌的形態(tài)特征 由圖1～4可知，從發(fā)酵面包、白芥絲、泡菜、醬黃瓜等分離得到的鏈球菌株，細(xì)胞為球形或卵圓形，直徑0.7～0.9 μm，在顯微油鏡下細(xì)胞的排列呈對(duì)狀、短鏈、中等長(zhǎng)鏈、長(zhǎng)鏈等不同的排列方式。圓形菌落，深紅色，表面光滑，邊緣整齊，直徑約1 mm，革蘭氏陽(yáng)性。

2.3.2 代謝特性試驗(yàn)結(jié)果 將鏈球菌HsS5、HsS6、HsS8、HsS9按照文獻(xiàn)[9]677-679進(jìn)行代謝特性的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，4株菌的過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、精氨酸和七葉苷水解試驗(yàn)陰性，淀粉試驗(yàn)陽(yáng)性；碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)中葡萄糖、乳糖和蔗糖能被鏈球菌利用。以上的代謝特性與文獻(xiàn)[9]694所描述的嗜熱鏈球菌特征一致，因此初步鑒定4株鏈球菌為嗜熱鏈球菌。

圖1 HsS5的菌體和菌落形態(tài)

圖2 HsS6的菌體和菌落形態(tài)

圖3 HsS8的菌體和菌落形態(tài)

圖4 HsS9的菌體和菌落形態(tài)

2.3.3 16S rRNA基因特異性擴(kuò)增結(jié)果 將4個(gè)菌株的16S rDNA 序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ，結(jié)果見(jiàn)圖5。

基因序列比對(duì)和分析結(jié)果為：菌株HsS5與嗜熱鏈球菌(FR875178.1)的片段相似性達(dá)到100%，菌株HsS6與嗜熱鏈球菌(HM059005.1)的片段相似性達(dá)到99%，菌株HsS8與嗜熱鏈球菌(HM058273.1)的片段相似性達(dá)到100%，菌株HsS9與嗜熱鏈球菌(CP002340.1)在66 845～68 289 bp的片段的相似性達(dá)到100%。結(jié)合菌株形態(tài)及代謝特性結(jié)果，確定HsS5、HsS6、HsS8、HsS9均為嗜熱鏈球菌。

表5 鏈球菌的代謝特性?

? +表示陽(yáng)性；-表示陰性。

M. DNA Marker DL2 000 1. HsS5的16S rRNA基因 2. HsS6的16S rRNA 基因 3. HsS8的16S rRNA基因 4. HsS9的16S rRNA 基因 +. 陽(yáng)性對(duì)照 -. 陰性對(duì)照

圖5 鏈球菌的16S rRNA基因

Figure 5 16S rRNA of streptococcus

2.4 鏈球菌的核桃乳發(fā)酵試驗(yàn)

2.4.1 發(fā)酵核桃乳的感官評(píng)定結(jié)果 將菌株HsS5、HsS6、HsS8和HsS9與實(shí)驗(yàn)室保存的嗜酸乳桿菌LA進(jìn)行核桃乳發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵后核桃乳樣品分別標(biāo)記為樣品5、6、8、9，感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可知，菌株HsS5與實(shí)驗(yàn)室保存的嗜酸乳桿菌LA共同發(fā)酵的樣品5，具有核桃香氣，滋味酸甜適口、乳酸味濃且柔和，色澤略顯灰色，所形成的形態(tài)均勻一致。感官評(píng)定結(jié)果為96分，相比其它菌株的感官評(píng)分結(jié)果高。

表6 感官評(píng)分結(jié)果

2.4.2 發(fā)酵核桃乳的氨基酸測(cè)定結(jié)果 將菌株HsS5、HsS6、HsS8和HsS9與實(shí)驗(yàn)室保存的嗜酸乳桿菌LA進(jìn)行核桃乳發(fā)酵試驗(yàn)，不同菌株發(fā)酵的核桃乳樣品的分別標(biāo)記為樣品5、6、8、9，氨基酸測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 氨基酸測(cè)定結(jié)果

由表7可知，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后的核桃乳的9種氨基酸含量均有不同程度的提高。其中經(jīng)菌株HsS5搭配嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵后賴氨酸的含量高達(dá)0.35%，是未發(fā)酵前賴氨酸含量(0.05%)的7倍；亮氨酸的含量，由原來(lái)的0.17%提高到了0.52%，是未發(fā)酵核桃乳的3倍；因此，菌株HsS5更適宜用在核桃乳發(fā)酵中。賴氨酸是核桃的第一限制性氨基酸，亮氨酸有助于血糖控制，重點(diǎn)考慮了這兩種，綜合感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)，選擇了HsS5。

3 結(jié)論

本研究從特定植物來(lái)源的材料中，采用選擇性分離培養(yǎng)基，獲得了HsS5、HsS6、HsS8、HsS9 4株鏈球菌菌株。通過(guò)生理生化特性和16S rRNA基因序列分析，上述菌株均為嗜熱鏈球菌。對(duì)鑒定后的菌株進(jìn)行發(fā)酵研究，結(jié)果表明，采用菌株HsS5與實(shí)驗(yàn)室保存的嗜酸乳桿菌LA發(fā)酵得到的純核桃發(fā)酵乳，感官評(píng)價(jià)最高，且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。后續(xù)將進(jìn)一步分析純核桃發(fā)酵乳其它營(yíng)養(yǎng)成分的指標(biāo)，促進(jìn)該菌株的廣泛應(yīng)用。

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Screening of streptococcus used for the fermented walnut mink drink

ZHAO Juan-juanWURong-rong

(DepartmentofLifeScience,HengshuiUnivercity,Hengshui,Hebei053000,China)

In this study, 14Streptococcusstrains were isolated from sourdough bread, white silk mustard, pickles and cucumber sauce. Among those strains, four strains marked as HsS5, HsS6, HsS8, HsS9 could be used for the fermentation of the walnut milk after acid feature test, and they were identified asStreptococcusthermophilusthrough their morphologic, physiological biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence. The scores of sensory evaluation of these fermented walnut milks produced by HsS5, HsS6, HsS8, HsS9 withLactobacillusacidophilusLA were 96, 91, 93, 86, respectively. Moreover, the contents of nine kinds of amino acid were found increased at different degrees in these four kinds fermented walnut milk, especially in HsS5, increased most significantly from 0.67% to 1.75%. According to the above results, strain HsS5 was more valuable for fermented walnut milk production than other strains.

fermented walnut milk; streptococcus; separation; identification

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.013

趙娟娟(1982—)，女，衡水學(xué)院講師，碩士。 E-mail：zhaojuanjuan456@163.com

2016-05-13