邵金華 馬永強 何福林 黎 濤 楊宇翔

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076；2. 湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 永州 425100；3. 湖南科技學(xué)院，湖南 永州 425100)

虎舌紅多糖超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性評價

邵金華1,2,3馬永強1何福林2,3黎 濤2,3楊宇翔2,3

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076；2. 湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 永州 425100；3. 湖南科技學(xué)院，湖南 永州 425100)

以虎舌紅為原料，蒸餾水為提取劑，對超聲波輔助提取虎舌紅多糖的工藝進行優(yōu)化，并對虎舌紅多糖的抗氧化性進行評價。結(jié)果表明：虎舌紅多糖最佳提取工藝為提取溫度65 ℃，提取時間20 min，料液比1∶15(g/mL)，提取次數(shù)4 次，該條件下虎舌紅多糖得率為(3.42±0.28) mg/g?；⑸嗉t多糖有較好的抗氧化活性，當(dāng)多糖濃度達到4 mg/mL時，對DPPH清除率強于相同濃度BHT；0.5%多糖對豬油抗氧化效果與相同濃度BHT相當(dāng)。

虎舌紅；多糖；超聲波輔助提?。豢寡趸钚?/p>

虎舌紅(ArdisiamamillataHance)，是紫金?？?Myrsinaceae)紫金牛屬(ArdisiaSwartz)植物，又叫天仙紅衣、金絲紅珠、紅毛氈、毛涼傘、寶鼎紅等，原產(chǎn)于中國，分布于湖南、廣西、四川、江西等地[1]。該植物多供藥用，具清熱利濕、止咳化痰、抗癌、消腫解毒、活血止血等功效[2]。目前，對于虎舌紅活性成分的研究，主要集中于虎舌紅揮發(fā)油[3]、生物堿[4]、黃酮類成分[5-6]的研究。

多糖是一種重要的活性成分，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗凝血的功能[7]。目前，對虎舌紅多糖的研究較少，僅有一篇[8]關(guān)于虎舌紅分離純化與性質(zhì)研究，在80 ℃下加熱回流水提取。關(guān)于虎舌紅多糖超聲波輔助提取工藝及其抗氧化活性的研究，未見有相關(guān)報道。加熱回流水提，能量消耗大、提取時間長、得率較低，而且多糖在提取的過程中容易造成降解，活性降低[9]。超聲波輔助提取法具有效率高、耗能低、溶劑用量少等特點，已應(yīng)用于多種植物有效成分提取[10-11]，但在虎舌紅多糖提取方面未見應(yīng)用報道。本研究擬采用超聲波輔助水提法提取虎舌紅多糖，考察各個因素對虎舌紅多糖得率的影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用正交試驗對試驗條件進行優(yōu)化，并對其抗氧化活性進行評價，旨在為虎舌紅多糖進一步研究提供理論基礎(chǔ)，為新型抗氧化劑開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 材料與試劑

虎舌紅：采摘自湖南省永州湖南科技學(xué)院西山；

豬油：本實驗室用市售豬板油制得；

葡萄糖、抗壞血酸、硫酸、苯酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：分析純，天津博迪化工股份有限公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

超聲波細胞粉碎機：scient29s-IIIN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

可見分光光度計：H722B型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

電熱真空干燥箱：DZF-6020型，北京中科環(huán)試儀器有限公司；

電子天平：JA3003型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R201D-Ⅱ型，鄭州長城科工貿(mào)易有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ型，鞏義市予博儀器設(shè)備貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖提取流程

虎舌紅全草→切成1 cm小段→60 ℃烘干、粉碎，過60目篩→乙醚回流脫脂[料液比1∶25(g/mL)，回流脫脂3 h]→脫脂后的殘渣烘干(真空干燥60 ℃)、粉碎(40目)→超聲波輔助蒸餾水提取→紗布過濾后抽濾→上清液(粗提取液)→活性炭脫色(2.5%攪拌40 min)→抽濾→上清液真空濃縮(75 ℃)為原體積的1/4→加入無水乙醇，至乙醇的終體積分數(shù)為75%→靜置36 h后取沉淀→65 ℃真空干燥→虎舌紅粗多糖

1.3.2 虎舌紅多糖含量測定 采用苯酚—硫酸法[12]。

(1) 葡萄糖標準曲線繪制：精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品50 mg，置于500 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得葡萄糖對照品貯備液。準確量取上述對照品貯備液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，再分別各取1 mL加濃硫酸7.5 mL和5%苯酚1.5 mL，在490 nm波長處測定吸光度(A490 nm)。

(2) 樣品多糖的含量測定：將濃縮的虎舌紅多糖提取液置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，取1 mL加濃硫酸7.5 mL和5% 苯酚1.5 mL，在490 nm波長處測定吸光度(A490 nm)?；⑸嗉t多糖得率按式(1)計算：

(1)

式中：

P——多糖得率，mg/g；

c——樣品濃度，μg/mL；

n——稀釋倍數(shù)；

v——稀釋體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 虎舌紅多糖提取工藝優(yōu)化

(1) 料液比對虎舌紅多糖得率的影響：準確稱取10.0 g 虎舌紅脫脂后干燥粉末，料液比分別為1∶ 15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35(g/mL)，超聲溫度為55 ℃，提取時間20 min(提取3 s，間隔2 s)，提取次數(shù)1次，考察料液比對多糖提取得率的影響。

(2) 提取時間對虎舌紅多糖得率的影響：準確稱取10.0 g 虎舌紅脫脂后干燥粉末，料液比按1.3.3(1)最優(yōu)值，設(shè)置超聲波提取時間分別為10，15，20，25，30 min(提取3 s，間隔2 s)，提取溫度55 ℃，提取1次，考察提取時間對虎舌紅多糖提取得率的影響。

(3) 提取溫度對虎舌紅多糖得率的影響：準確稱取10.0 g 虎舌紅脫脂后干燥粉末，料液比按1.3.3(1)最優(yōu)值，設(shè)置超聲波提取時間為1.3.3(2)最優(yōu)值，水提，設(shè)置提取溫度為50，55，60，65，70 ℃，提取1次，考察提取溫度對虎舌紅多糖提取得率的影響。

(4) 提取次數(shù)對虎舌紅多糖得率的影響：準確稱取10.0 g 虎舌紅脫脂后干燥粉末，料液比按1.3.3(1)最優(yōu)值，設(shè)置超聲波提取時間為1.3.3(2)最優(yōu)值，提取溫度為1.3.3(3)最優(yōu)值，分別提取1，2，3，4，5次，考察超聲溫度對虎舌紅多糖提取得率的影響。

(5) 正交優(yōu)化設(shè)計：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多糖提取得率為檢測指標，采用L9(34)進行4因素3水平正交試驗，綜合考察多因素對多糖提取得率的影響。

1.3.4 多糖抗氧化活性檢測

(1) DPPH自由基清除能力測定：向試管中依次加入6.5×10-5mol/L DPPH·溶液2.5 mL，分別加入5，10，15，20，25 mg/mL虎舌紅多糖提取液1 mL、相同濃度BHT(陽性對照)，蒸餾水補足到 4 mL，蒸餾水做對照，各管混合均勻，避光保存20 min后，在517 nm 處測定吸光度值[13]。樣品對 DPPH自由基的清除率按式(2)計算：

(2)

式中：

K——DPPH自由基清除率，%；

A0——對照吸光度；

A——樣品吸光度。

(2) 虎舌紅多糖對豬油抗氧化能力測定：將豬油試樣100 g，按照質(zhì)量百分比 0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%加入虎舌紅多糖，以0.5% BHT為對照，攪拌均勻，然后置于(60±2) ℃的烘箱自氧化，每 48 h 取樣測定豬油的過氧化值[14]。按GB/T 5538—2005 測定油脂的過氧化值。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線繪制

由圖1可知，在10～50 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，葡萄糖標準溶液濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 虎舌紅多糖提取工藝優(yōu)化

2.2.1 料液比對虎舌紅多糖得率的影響 由圖2可知，隨著溶劑量的增加，虎舌紅多糖得率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20(g/mL)時，多糖得率最大，之后多糖得率反而降低。在相同條件下，隨著溶劑量的增加，多糖溶出量增加，溶劑量達到一定值后，多糖完全溶出，再增加溶劑的量，多糖得率不再增加，反而下降，可能是隨著溶劑增加，促進了其它物質(zhì)溶出，抑制多糖溶出；再者，溶劑量的增加，為后續(xù)濃縮操作帶來困難，影響脫色劑用量。綜合考慮，確定最佳料液比為1∶20(g/mL)。

不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

Figure 2 Effect of material- liquid ratio on yield of polysaccharides fromArdisiamamillataHance

2.2.2 提取時間對虎舌紅多糖得率的影響 由圖3可知，隨著提取時間的增加，虎舌紅多糖的得率也隨之增大，在25 min時達到一個最大值，之后虎舌紅多糖的得率下降，可能是提取時間過長，虎舌紅多糖分解產(chǎn)生單糖，從而導(dǎo)致虎舌紅多糖得率下降。綜合考慮，確定最佳提取時間為25 min。2.2.3 提取溫度對虎舌紅多糖得率的影響 由圖4可知，隨著提取溫度提高，虎舌紅多糖得率增大，達到60 ℃時，得率最高，之后虎舌紅多糖得率下降?？赡苁请S著提取溫度升高，液體介質(zhì)黏度以及表面張力降低，但液體蒸氣壓增大，因而在液體介質(zhì)中間容易拉開進而形成空化作用，使細胞破碎度增加，促使細胞多糖向外擴散，促使多糖得率增大，但當(dāng)溫度再增加，使細胞破碎度過大，促使多糖外的其它雜質(zhì)被溶出，多糖得率下降。因此，確定60 ℃為最佳提取溫度。

不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

Figure 4 Effect of ultrasonic temperature on yield of polysaccharides fromArdisiamamillataHance

2.2.4 提取次數(shù)對虎舌紅多糖得率的影響 由圖5可知，隨著提取次數(shù)增加，多糖得率逐漸增加，提取次數(shù)達到3次后再增加提取次數(shù)時，多糖得率變化不大?？赡苁翘崛?次后，多糖已經(jīng)完全浸出，固液相達到了平衡，再者，提取次數(shù)增加，能量消耗增大。綜合考慮，虎舌紅多糖提取次數(shù)選擇3次。

不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

Figure 5 Effect of extraction times on yield of polysaccharides fromArdisiamamillataHance

2.2.5 正交試驗 正交試驗因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表2可知，影響虎舌紅多糖得率因素的次序為：C>A>B>D，最佳工藝參數(shù)為：A3B1C1D3，即超聲溫度為65 ℃，超聲時間為20 min，料液比為1∶15(g/mL)，提取次數(shù)為4次。由表3方差分析可知，超聲溫度、超聲時間、料液比對虎舌紅多糖得率都有顯著影響。由于正交表中無A3B1C1D3試驗組，對此試驗組進行了3次驗證實驗，此條件下，虎舌紅多糖得率為(3.42±0.28) mg/g，得率高于其它試驗組。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果表

表3 方差分析表?

?F臨界值19.000；*表示差異顯著，P<0.05。

2.3 虎舌紅多糖抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定 由圖6可知，隨著虎舌紅多糖、BHT濃度增大，對DPPH清除率逐漸增大，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，當(dāng)虎舌紅多糖濃度達到4 mg/mL時，其對DPPH清除率效果強于BHT。

2.3.2 虎舌紅多糖對豬油抗氧化能力測定 由表4可知，隨著多糖含量增加，對豬油的抗氧化效果增強，0.05% 多糖與0.05% BHT抗氧化效果較接近，此時，BHT抗氧化效果好于多糖；當(dāng)多糖濃度達到0.07%，多糖的抗氧化效果好于BHT。由此可見，虎舌紅多糖抗氧化效果較好，但是因為其是粗多糖，需要進一步純化，純化后的抗氧化效果可能好于BHT。

不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

Figure 6 Inhibitory effects of polysaccharides fromArdisiamamillataHance and BHT on DPPH

表4 虎舌紅多糖、BHT對豬油抗氧化作用

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，虎舌紅多糖超聲輔助提取工藝的最佳條件為提取溫度65 ℃，提取時間20 min，料液比1∶15(g/mL)，提取4次，該條件下虎舌紅多糖得率為(3.42±0.28) mg/g。

通過本試驗證明虎舌紅多糖具有較好的抗氧化活性，粗多糖濃度達到5 mg/mL時，對DPPH清除率強于相同濃度BHT，在對豬油抗氧化試驗過程中發(fā)現(xiàn)，粗多糖濃度達到0.7%時，對豬油的抗氧化效果強于對照0.5% BHT。虎舌紅粗多糖的后續(xù)純化、結(jié)構(gòu)分析以及其結(jié)構(gòu)與抗氧化性構(gòu)效關(guān)系研究還有待進一步研究。

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Ultrasonic-assisted extraction of polysaccharide from ardisia mamillata and the evaluation of its antioxidant activity

SHAO Jin-hua1,2,3MAYong-qiang1HEFu-lin2,3LITao2,3YANGYu-xiang2,3

(1.HarbinUniversityofCommerce,Harbin,Heilongjiang150076,China; 2.KeyLaboratoryofComprehensiveUtilizationofAdvantagePlantsResourcesinHunanSouth,Yongzhou,Hunan425100,China; 3.HunanUniversityofScienceandTechnology,Yongzhou,Hunan425100,China)

A orthogonal test was utilized to optimize the ultrasonic-assisted extraction process of the polysaccharide inArdisiamamillatabased on the single-factor experiment, and its antioxidant activity was evaluated. The results demonstrated that the polysaccharide inArdisiamamillatacould be extracted best by using distilled water as the extracting agent, with the solid-liquid ratio 1∶15(g/mL)was treated , ultrasonated at 65 ℃ for 20 min, for 4 times. Thus the extracting rate of the polysaccharide fromArdisiamamillatawas (3.42±0.28) mg/g. Moreover, it was also found that the polysaccharide formArdisiamamillatapossessed good antioxidant activity. It was tested that the polysaccharide showed stronger clear ability of DPPH than that of BHT at concentration 4 mg/mL, and 0.5% polysaccharide had comparable antioxidant effect on lard with that of BHT.

Ardisiamamillata; polysaccharide, ultrasonic-assisted extraction, antioxidant activity

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.036

湖南省教育廳重點項目(編號：16A904)

邵金華，女，湖南科技學(xué)院高級實驗師，哈爾濱商業(yè)大學(xué)在讀博士研究生。

馬永強(1963—)，男，哈爾濱商業(yè)大學(xué)教授，博士。 E-mail: qyma163@126.com

2016—09—30