王 剛 鞠海星? 邱彭年 付志旋 陳寅波

·論著·

MACC1蛋白在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)及其臨床意義

王 剛 鞠海星? 邱彭年 付志旋 陳寅波

目的 探討MACC1蛋白在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)水平及其臨床意義。方法 采用ELISA法檢測(cè)172例結(jié)直腸癌患者及119例正常人群的血清MACC1蛋白表達(dá)情況，并分析血清中MACC1的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果 結(jié)直腸癌患者血清中的MACC1的表達(dá)水平顯著高于正常人的表達(dá)水平（P＜0.05）。結(jié)直腸癌患者血清中的MACC1表達(dá)水平與性別（P=0.004）、CA19-9表達(dá)情況（P=0.039）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（P＜0.001）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況（P=0.014）、神經(jīng)侵犯情況（P=0.019）、癌結(jié)節(jié)（P=0.014）及TNM分期（P＜0.001）等密切相關(guān)，而與年齡、腫瘤家族史、腫瘤位置、浸潤深度、脈管瘤栓、病理分型及分化程度無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。此外，MACC1高表達(dá)組的結(jié)直腸癌患者總生存率（OS）明顯低于低表達(dá)組，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.466，P=0.002）。結(jié)論 MACC1在結(jié)直腸癌患者血清中表達(dá)升高，并且其表達(dá)量與結(jié)直腸癌的惡性演變及臨床預(yù)后密切相關(guān)，有望成為結(jié)直腸癌診斷及預(yù)后的血清學(xué)指標(biāo)。

MACC1 結(jié)直腸癌 血清 預(yù)后

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響人類的健康，其發(fā)病率和病死率已上升至常見腫瘤的第 3位［1］。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，是在環(huán)境因素和遺傳因素的共同作用下，經(jīng)過多階段復(fù)雜的生物學(xué)演變而形成的惡性疾病。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子 1（MACC1）是2009年Stein等［2］新發(fā)現(xiàn)的致癌基因，定位于7號(hào)染色體（7p21.1），是HGF/Met信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮著重要作用。后續(xù)研究表明，MACC1過表達(dá)與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲密切相關(guān)［3-4］。前期研究成果顯示，MACC1可作為腫瘤預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子［5］。另外，作者首先在胰腺癌患者血清中檢測(cè)到MACC1蛋白的表達(dá)，提示MACC1可作為胰腺癌早期診斷和預(yù)后判斷的敏感指標(biāo)。然而，在結(jié)直腸癌中，尚未有類似研究。因此，本研究通過ELISA法檢測(cè)MACC1在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)情況，分析其與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的相關(guān)性，并進(jìn)一步探討其與預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 觀察對(duì)象 收集本院自2011年8月至2012年8月期間收治的結(jié)直腸癌患者的術(shù)前血清標(biāo)本172例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究已經(jīng)征得患者知情同意和本院倫理委員會(huì)允許。（2）均經(jīng)病理學(xué)確診。（3）術(shù)前未行放化療等新輔助治療手段。（4）患者之前未被診斷為其他惡性腫瘤。同時(shí)收集同期本院體檢中心健康體檢者的血清標(biāo)本119例。對(duì)照組人群經(jīng)本院系統(tǒng)檢查后均排除惡性腫瘤的可能性。172例結(jié)直腸癌患者血清中，男115例，女57例，平均年齡（59.66±10.86）歲；正常對(duì)照組平均年齡（62.52±9.35）歲。兩組人群在年齡、性別等方面均無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)直腸癌患者依據(jù)2010年美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）結(jié)直腸癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期［6］。

1.2 檢測(cè)方法 結(jié)直腸癌患者于手術(shù)麻醉前抽取約5ml靜脈血，室溫凝集，3000r/min離心20min，取其上清液，以200μl每小份分裝并標(biāo)記，置于-80℃超低溫冰箱，集中檢測(cè)。血清標(biāo)本于使用前緩慢均衡恢復(fù)至室溫狀態(tài)。使用酶聯(lián)免疫吸附分析法檢測(cè)血清中MACC1表達(dá)量。試劑盒購自武漢優(yōu)爾生科技公司（E81667Hu），嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 臨界值（Cut-Off值）采用ROC曲線分析，超過臨界值則判定為MACC1高表達(dá)。

1.4 隨訪 隨訪為門診+電話隨訪。終點(diǎn)事件定義為死亡，自確診日期開始計(jì)算總生存期（OS），末次隨訪時(shí)間為2016年8月3日，失訪者以最后一次有效隨訪日期作為截尾數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0及GraphPad Prism v5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用乘積極限法（Kaplan-Meier）進(jìn)行單因素生存分析，并繪制生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌患者血清中MACC1的表達(dá)狀態(tài) 血清中MACC1表達(dá)量診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線下面積為0.859，其95%可信區(qū)間為（0.817，0.902），與0.5比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖1。

2.2 不同人群血清中MACC1蛋白的表達(dá)分布 根據(jù)正確診斷指數(shù)=靈敏度+特異度-1，在本ROC曲線中，分界點(diǎn)2.79對(duì)應(yīng)的正確診斷指數(shù)最大，因此，將2.79ng/ml作為最佳診斷分界點(diǎn)（Cut-off值）。即當(dāng)MACC1濃度＞2.79ng/ml時(shí)，認(rèn)為MACC1表達(dá)為高表達(dá)。反之，則為低表達(dá)。在85例早期結(jié)直癌患者血清標(biāo)本中，有45例呈MACC1高表達(dá)，高表達(dá)率為52.9%；在87例中晚期結(jié)直腸癌患者血清標(biāo)本中，則有68例呈MACC1高表達(dá)，高表達(dá)率升高至78.2%；相反，在119例正常人群血清標(biāo)本中，只有18例檢測(cè)到MACC1高表達(dá)，高表達(dá)率僅為15.1%。結(jié)直腸癌患者中MACC1的表達(dá)水平顯著高于正常人群的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=83.724，P＜0.001）。見圖2。

圖1 MACC1用于診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線

圖2 不同人群血清中MACC1蛋白的表達(dá)分布

2.3 血清中MACC1的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 通過對(duì)血清中MACC1的表達(dá)狀態(tài)和其臨床病理資料進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MACC1表達(dá)狀態(tài)與患者年齡、吸煙史、家族史、飲酒史、HBsAg感染史、CEA表達(dá)量、Ferrtin表達(dá)量、腫瘤的位置、局部浸潤的深度、有無脈管瘤栓、病理分型及病理分化程度等不存在顯著相關(guān)性（P＞0.05）。但是，與女性患者比較，男性患者血清中MACC1存在明顯高表達(dá)狀態(tài)（P=0.004）。而伴隨著CA199的高表達(dá)狀態(tài)，MACC1表達(dá)情況也同樣存在陽性結(jié)果（P=0.039）。另外，MACC1的表達(dá)狀態(tài)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及較晚的腫瘤分期差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P=0.014，P＜0.001）。MACC1的高表達(dá)狀態(tài)和神經(jīng)侵犯及癌結(jié)節(jié)形成也具有密切相關(guān)性，且結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019，P=0.014）。

2.4 血清中MACC1的表達(dá)水平對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響 截止到2016年8月，本研究中172例結(jié)直腸癌患者共有56例死亡，10例失訪，Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，MACC1蛋白高表達(dá)患者總生存期（OS）均低于其低表達(dá)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.466，P=0.002），見圖3。

圖3 MACC1表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者總生存期的關(guān)系

3 討論

隨著生活水平的提高及飲食習(xí)慣的改變，目前結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。其異質(zhì)性較高，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，并且極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，對(duì)人類的健康和生命安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，對(duì)結(jié)直腸癌的早期診斷發(fā)現(xiàn)和有效控制轉(zhuǎn)移具有重要意義。目前臨床上結(jié)直腸癌的診斷主要是依靠腸鏡檢查，但是其廣泛普及用于篩查受限，而腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)因其簡(jiǎn)單、方便、無痛等特點(diǎn)，在結(jié)直腸癌的早期篩查診斷中越來越重要。目前主要應(yīng)用CEA及CA19-9進(jìn)行結(jié)直腸癌的早期篩查，然而，其敏感度和準(zhǔn)確度均十分有限。因此，尋找敏感特異的腫瘤學(xué)血清標(biāo)志物，已成為目前研究的熱點(diǎn)。

MACC1首次發(fā)現(xiàn)于結(jié)直腸癌中，并被證實(shí)其組織中的表達(dá)水平是預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷的獨(dú)立指標(biāo)［2］。作為HGF/met信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，MACC1參與腫瘤細(xì)胞生長、細(xì)胞遷移和侵襲、腫瘤血管生成及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等重要病理生理過程，并且能夠形成正反饋環(huán)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲。而MACC1通過調(diào)控Ras/ERK信號(hào)通路的激活參與胰腺癌化療耐藥過程。另外，后續(xù)研究也提示，MACC1在Akt/β-catenin、PI3K/AKT及TWIST1/ VEGF-A等信號(hào)傳導(dǎo)通路中均扮演著重要角色［7-8］。如前所述，MACC1不僅在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)較高，在其他惡性腫瘤中也存在異常表達(dá)狀態(tài)，并且和腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)［8-9］。而前期的一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果亦表明，MACC1的高表達(dá)狀態(tài)和腫瘤患者更短的總生存期及無復(fù)發(fā)生存期具有顯著相關(guān)性（P均＜0.001）［5］。早在MACC1發(fā)現(xiàn)之初，Stein等2009年通過對(duì)人結(jié)腸癌腫瘤組織、轉(zhuǎn)移灶及正常組織中的MACC1蛋白水平進(jìn)行差異性分析，證明了MACC1在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶組織中表達(dá)最高，相反，在正常結(jié)腸黏膜組織中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)。同時(shí)，Stein等在基因水平上也進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果一致［2］。而MACC1在結(jié)直腸癌患者血清中的蛋白表達(dá)情況尚未有過報(bào)道。

本研究采用ELISA法對(duì)血清中的MACC1蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血清中的MACC1表達(dá)水平明顯高于正常人群，這是首次對(duì)MACC1的蛋白表達(dá)情況在血清中進(jìn)行了研究和驗(yàn)證。作者結(jié)合患者的臨床病理特征進(jìn)行了進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示MACC1的高表達(dá)狀態(tài)與多種臨床特征相關(guān)，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、神經(jīng)侵犯情況、癌結(jié)節(jié)存在狀態(tài)及高TNM分期等，這些數(shù)據(jù)再次表明，MACC1的過度表達(dá)和結(jié)直腸癌的惡性行為和腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。而通過對(duì)這些患者進(jìn)行生存分析研究，數(shù)據(jù)表明，血清中異常表達(dá)的MACC1蛋白水平可以作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的生物學(xué)指標(biāo)。這些數(shù)據(jù)和結(jié)論和前期學(xué)者的觀點(diǎn)基本保持一致，然而不同的是，作者是通過分析結(jié)直腸癌患者血清中的MACC1蛋白表達(dá)得出的結(jié)論，而這具有重要的臨床實(shí)用價(jià)值。與組織學(xué)腫瘤特異性指標(biāo)檢測(cè)的方法比較，血清標(biāo)本的獲得更加方便，易于臨床推廣和應(yīng)用，這對(duì)腫瘤患者的早期篩查及長期隨訪和檢測(cè)具有更好的可行性。同時(shí)，由于本研究所納入的樣本量較少，隨訪時(shí)間較短，未將術(shù)后輔助治療方案等因素考慮在內(nèi)，所以該研究結(jié)果具有一定的局限性。因此，需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并積極進(jìn)行臨床研究驗(yàn)證。

綜上所述，MACC1的異常表達(dá)與結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)，檢測(cè)血清中的MACC1的表達(dá)水平對(duì)結(jié)直腸癌的早期診斷、惡性程度評(píng)估及預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要臨床價(jià)值。其取樣方便、檢測(cè)快捷、結(jié)果穩(wěn)定，是較理想的評(píng)價(jià)指標(biāo)。進(jìn)一步探討MACC1在結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中的分子機(jī)制和作用，有助于為結(jié)直腸癌的診療和隨訪提供新的思路。

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Objective In this study，the expression of serum MACC1 protein was investigated in patients with colorectal cancer，and the clinical relevance was explored. Methods We retrospectively analyzed 172 patients with colorectal cancer in our center during the period of Aug 2011 through Aug 2012. 119 healthy serums were used as control. Serum was isolated by Centrifugation and the expression of MACC1 protein was tested by ELISA. Relationship between the expression level of MACC1 and clinical characteristics of colorectal cancer was analyzed by SPSS 18.0 analysis software. Results The expression of serum MACC1 protein in colorectal cancer patients was signifcantly higher than that in normal controls （P＜0.05）. Then the analysis was done in patients divided by risk stratifcation. In our research，we found that in colorectal cancer patients，serum MACC1 protein expression had a closely relationship with gender （P=0.004），CA19-9 level （P=0.039），lymph node metastasis （P＜0.001），distant metastasis（P=0.014），neural invasion （P=0.019），cancer nodules（P=0.014） and TNM stage （P＜0.001）. But there was no significant correlation with patient age，family tumor history，tumor location，depth of tumor invasion，vascular tumor thrombus，and pathological type （P＞0.05）. In addition，overall survival rate（OS） in patients with high expression of MACC1 was signifcantly lower than that in the low expression group（χ2=9.466，P=0.002）. Conclusion The expression of serum MACC1 protein was increased in patients with colorectal cancer. And the expression level was closely related to the malignant evolution and clinical prognosis in colorectal cancer. The serum MACC1 protein may be a good serological marker for diagnosis and prognosis of colorectal cancer.

MACC1 Colorectal cancer Serum Prognosis

浙江省自然科學(xué)基金（Y15H160027），錢江人才項(xiàng)目（2013R10079）

310022 浙江省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科

*通信作者