郭 勇 彭龍開?

缺氧抑制RABEP1基因表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞786-O凋亡及增殖的影響

郭 勇 彭龍開?

目的 探討缺氧對(duì)RABEP1表達(dá)水平的影響及其表達(dá)情況對(duì)腎癌細(xì)胞786-O增殖及凋亡能力的影響。方法 常氧及缺氧條件下培養(yǎng)人腎癌細(xì)胞786-O，熒光定量RT-PCR及蛋白印跡法檢測(cè)RABEP1的表達(dá)情況；在缺氧條件下過表達(dá)RABEP1基因，MTT實(shí)驗(yàn)及Hoechst實(shí)驗(yàn)檢測(cè)786-O細(xì)胞的增殖及凋亡情況。結(jié)果 相對(duì)常氧培養(yǎng)的786-O細(xì)胞，缺氧可抑制細(xì)胞內(nèi)RABEP1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，p值分別為0.0015及0.008；在第3、4及5天，相對(duì)786-OMOCK細(xì)胞，缺氧條件下786-OpcDNA-RABEP1細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，P值均＜0.001；同樣，相對(duì)786-OMOCK細(xì)胞，缺氧條件下786-OpcDNA-RABEP1細(xì)胞的凋亡明顯增加。結(jié)論 缺氧可抑制Rabaptin-5的表達(dá)，缺氧環(huán)境下過表達(dá)Rabaptin-5可抑制腎癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

腎細(xì)胞癌 增殖 凋亡 缺氧 RABEP1

腎癌的發(fā)病率在我國泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中占第二位，僅次于膀胱腫瘤。腎腺癌（renal cell carcinoma，RCC）占腎癌的80%～90%，為起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤［1］。隨著以手術(shù)為首選治療的綜合治理方案在臨床中廣泛應(yīng)用，腎癌的預(yù)后得以明顯改善。腫瘤的侵犯及轉(zhuǎn)移情況是影響5年生存率的關(guān)鍵因素，腫瘤局限在腎內(nèi)可達(dá)92%，合并周圍淋巴轉(zhuǎn)移則下降至65%，一旦出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則為12%［2］。研究證明，缺氧是RCC生長微環(huán)境的重要特點(diǎn)，缺氧誘導(dǎo)的HIF可調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成及能量代謝等［3］。故研究缺氧調(diào)節(jié)的基因能為防治腎細(xì)胞癌提供理論依據(jù)，為臨床治療提供可能的靶標(biāo)。研究報(bào)道，缺氧可抑制RABEP1表達(dá)，進(jìn)而降低Rab5介導(dǎo)的內(nèi)體融合，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4-5］。但是，目前尚未見缺氧調(diào)節(jié)RABEP1基因表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞增殖與凋亡影響的相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧處理 人腎腺癌細(xì)胞786-O培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素（100U/ml）及鏈霉素（100U/ ml）的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，常氧培養(yǎng)條件： 37℃、20% 氧氣、5%二氧化碳、75% 氮?dú)?。缺氧培養(yǎng)條件：37℃、1% 氧氣、5%二氧化碳、94%氮?dú)猓ǚρ跖囵B(yǎng)箱提供缺氧細(xì)胞培養(yǎng)的條件）。

1.2 熒光定量RT-PCR 將對(duì)數(shù)生長期的786-O細(xì)胞按照上述的缺氧誘導(dǎo)條件處理，使用omega公司一步法RNA抽提試劑盒提取總RNA，具體參照說明書；酶標(biāo)儀法測(cè)定RNA的純度，反轉(zhuǎn)錄后按SYBR Green法進(jìn)行RT-PCR，參照TAKARA說明書。β-actin 做為定量計(jì)算RABEP1 表達(dá)水平的內(nèi)參基因，用2-△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。引物序列為： RABEP1（human），sense，5'- TCGTGACTATGAGCACCAGTT-3'，5'-ATCACAACGGACCGAAGTTTC-3'；β-actin（human），sense，5'-GCACCACACCTTCTACAATGAGC-3'，antisense 5'- GGATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3'。

1.3 蛋白印跡法（Western blot） 采用強(qiáng)裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，總上樣量為50μg，采用流程為：電泳（恒壓100V，90min）、轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)，恒壓120V，90min）、封閉（5%脫脂奶粉的TBST，常溫2h）、孵育一抗（4℃，過夜）、洗膜（5min×3次）、孵育二抗（常溫，2h）、洗膜（10min×3次）、ECL顯色。（RABEP1，1：500；β-actin，1：1000，英國Abcam公司）。

1.4 過表達(dá)RABEP1基因 6孔中接種細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待目的細(xì)胞融合度達(dá)約30%，加入空載體及慢病毒pcDNA-RABEP1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體參照制造商的協(xié)議。利用蛋白印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染的情況。過表達(dá)慢病毒pcDNA-RABEP1購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 接種上述細(xì)胞至96孔板，放進(jìn)37℃ 5%CO2乏氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從鋪板的第2天開始，培養(yǎng)終止前4h每孔加MTT溶液，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)。每孔加100μl DMSO，振蕩10min。選擇490nm，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值。計(jì)算方法：以day1～day5相對(duì)day1的OD490比值定義為OD490/fold（表示各天的增殖倍數(shù)），并繪制細(xì)胞相對(duì)活力曲線。

1.6 Hoechst檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 利用玻璃片制作單層細(xì)胞爬片，以1%鹽酸-70%乙醇溶液浸泡固定5min，PBS漂洗5min，Hoechst 33258工作液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，室溫15min，漂洗3次，5min/次，用甘油與PBS比例為1：9的混合液封片，室溫下晾干，在熒光顯微鏡下觀察，并隨機(jī)拍照熒光顯微鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧抑制RABEP1的表達(dá) 熒光定量RT-PCR 及Western blot結(jié)果顯示，在786-O細(xì)胞缺氧48h培養(yǎng)后，RABEP1mRNA及蛋白的表達(dá)水平均明顯下降，P值分別為0.0015及0.0080，見圖1。

圖1 缺氧對(duì)RABEP1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

2.2 檢測(cè)pcDNA-RABEP1感染786-O細(xì)胞的情況 Western blot檢測(cè)缺氧條件下pcDNA-RABEP1感染786-O細(xì)胞36h后RABEP1蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)pcDNA-RABEP1能明顯提高目標(biāo)蛋白分子的表達(dá)量，與空載組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 過表達(dá)RABEP1后細(xì)胞增殖活力 786-O 、 786-OMOCK及786-OpcDNA-RABEP1在缺氧情況下進(jìn)行培養(yǎng)，連續(xù)5d利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力。結(jié)果顯示：786-OpcDNA-RABEP1的增殖能力明顯受限，尤其在轉(zhuǎn)染pcDNA-RABEP1后第3、4、5天細(xì)胞增殖能力減弱明顯，P值均＜0.001，見圖3-A。

2.4 過表達(dá)RABEP1后細(xì)胞的凋亡情況 786-O 、786-OMOCK及786-OpcDNA-RABEP1在缺氧情況下進(jìn)行培養(yǎng)，786-O組及786-OMOCK組細(xì)胞的核呈均勻的藍(lán)色熒光，786-OpcDNA-RABEP1的細(xì)胞核呈凋亡狀態(tài)，即染色質(zhì)固縮及核碎裂，細(xì)胞質(zhì)則濃縮，呈明亮的藍(lán)色?？梢娺^表達(dá)RABEP1后呈凋亡狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)增加，可判斷缺氧狀態(tài)下過表達(dá)RABEP1基因使786-O細(xì)胞的凋亡增加，見圖3-B。

圖2 pcDNA-RABEP1感染786-O細(xì)胞后RABEP1蛋白的表達(dá)量

圖3 缺氧情況下分別培養(yǎng)786-O、786-OMOCK及786-OpcDNA-

3 討論

RABEP1，又名Rabaptin-5及Neurocrescin，作為蛋白編碼基因，位于17p13.2，其蛋白分子量約99kD。RABEP1蛋白主要分布在胞漿、細(xì)胞膜和內(nèi)體上，其C端存在兩個(gè)連續(xù)結(jié)構(gòu)域CC1及CC2，作為Rab的功能蛋白，可通過連接γ-adaptin，RAB4A 及RAB5A，促進(jìn)膜融合而介導(dǎo)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、早期內(nèi)體融合及膜內(nèi)吞的作用。研究證明，RABEP1受 Caspase-3信號(hào)通路的特異性調(diào)控［5］，在機(jī)體細(xì)胞內(nèi)保存適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)EGFR等生長及凋亡相關(guān)因子的表達(dá)及活性水平，進(jìn)一步影響下游信號(hào)通路活性，對(duì)維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及細(xì)胞的生物學(xué)功能起重要作用。反之，當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受體外內(nèi)環(huán)境因素刺激，調(diào)控Rabaptin-5表達(dá)的機(jī)制失平衡，則可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。有研究者利用qRT-PCR芯片對(duì)乳腺癌mRNA進(jìn)行高通量分析，發(fā)現(xiàn)RABEP1在癌組織中高表達(dá)且是患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素［6］。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6基因在胃癌細(xì)胞內(nèi)通過抑制Rabaptin-5介導(dǎo)的初級(jí)內(nèi)體融合而延長EGFR活性，最終可增強(qiáng)惡性細(xì)胞的致瘤性［7］。也有研究發(fā)現(xiàn)，PKD可促進(jìn)Rabaptin-5的磷酸化，導(dǎo)致后者與Rab4結(jié)合，進(jìn)而減慢PDGF驅(qū)動(dòng)的Integrin循環(huán)再生，最終抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［8］。總之，Rabaptin-5作為腫瘤發(fā)生及進(jìn)展的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)節(jié)因子，故進(jìn)一步研究調(diào)節(jié)Rabaptin-5表達(dá)的相關(guān)因素對(duì)防治腎癌有重要科學(xué)意義。

缺氧不僅是所有實(shí)體惡性腫瘤的重要微環(huán)境特征之一，亦是腫瘤生物學(xué)行為進(jìn)化的誘發(fā)因素。臨床上常采用栓塞腫瘤滋養(yǎng)血管的方法來治療實(shí)體瘤，如肝細(xì)胞癌及腎癌等。已有基礎(chǔ)及臨床研究均證明，腫瘤組織的缺氧狀態(tài)是患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。缺氧致腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為進(jìn)化的主要機(jī)制是通過誘導(dǎo)惡性細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性、篩選缺乏凋亡能力的細(xì)胞及調(diào)控多類參與腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。缺氧可誘導(dǎo)HIF-1α基因的表達(dá)，而HIF-1α作為唯一在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，不僅能夠上調(diào)多種基因的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)亦可抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與調(diào)控惡性細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、能量代謝及免疫等生物學(xué)行為。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α可抑制Rabaptin-5的表達(dá)，而抑制細(xì)胞的膜內(nèi)吞作用［4］。Wang Y等［9］研究顯示，在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)腎細(xì)胞癌，Rabaptin-5的表達(dá)水平明顯受抑制，與本資料結(jié)果基本一致。與此同時(shí)，為進(jìn)一步分析Rabaptin-5對(duì)缺氧環(huán)境下腎癌細(xì)增殖及凋亡的影響，作者選擇腎癌細(xì)胞在缺氧環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，通過在腎癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Rabaptin-5基因，觀察細(xì)胞的增殖活性及凋亡情況。本資料結(jié)果顯示，在缺氧環(huán)境中過表達(dá)Rabaptin-5，可以顯著抑制786-O細(xì)胞的增殖、并促進(jìn)786-O細(xì)胞的凋亡，此結(jié)果亦是對(duì)Michael Ohh等研究結(jié)果的進(jìn)一步補(bǔ)充。結(jié)合既往文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)缺氧環(huán)境下Rabaptin-5可調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞增殖及凋亡的可能機(jī)制如下：缺氧誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而抑制Rabaptin-5基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白的合成，使Rab4或Rab5驅(qū)動(dòng)的膜內(nèi)吞行為減弱，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞膜上調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、凋亡、遷徙及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)受體的內(nèi)吞減少而受體下游信號(hào)通路持續(xù)激活，這些受體包括EGFR、FGFR及VEGFR等。

綜上所述，本研究再次明確了缺氧可抑制腎癌細(xì)胞內(nèi)Rabaptin-5的表達(dá)，同時(shí)探明缺氧環(huán)境下過表達(dá)Rabaptin-5可抑制腎癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但是，為進(jìn)一步探明Rabaptin-5對(duì)腎癌細(xì)胞更多生物學(xué)行為的影響，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，需納入臨床病例，探明Rabaptin-5表達(dá)水平的臨床病理意義，為實(shí)現(xiàn)針對(duì)腎癌以Rabaptin-5為防治靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

［1］ Fujioka T, Obara W． Evidence-based clinical practice guideline for renal cell carcinoma: the Japanese Urological Association 2011 update． Int J Urol, 2012, 19(6): 496-503．

［2］ Matsuda T, Hori M． Five-year relative survival rate of kidney and renal pelvis cancer in the USA, Europe and Japan． Jpn J Clin Oncol, 2015, 45(1): 136．

［3］ Shen C, Kaelin WG Jr． The VHL/HIF axis in clear cell renal carcinoma． Semin Cancer Biol, 2013, 23(1): 18-25．

［4］ Troilo A, Alexander I, Muehl S, et al． HIF1alpha deubiquitination by USP8 is essential for ciliogenesis in normoxia． EMBO Rep, 2014, 15(1): 77-85．

［5］ Swanton E, Bishop N, Woodman P． Human rabaptin-5 is selectively cleaved by caspase-3 during apoptosis． J Biol Chem, 1999, 274(53): 37583-37590．

［6］ Andres SA, Brock GN, Wittliff JL． Interrogating differences in expression of targeted gene sets to predict breast cancer outcome．BMC Cancer, 2013, 13: 326．

［7］ Park SJ, Kim JK, Bae HJ, et al． HDAC6 sustains growth stimulation by prolonging the activation of EGF receptor through the inhibition of rabaptin-5-mediated early endosome fusion in gastric cancer．Cancer Lett, 2014, 354(1): 97-106．

［8］ Christoforides C, Rainero E, Brown KK, et al． PKD controls alphavbeta3 integrin recycling and tumor cell invasive migration through its substrate Rabaptin-5． Dev Cell, 2012, 23(3): 560-572．

［9］ Wang Y, Roche O, Yan MS, et al． Regulation of endocytosis via the oxygen-sensing pathway． Nat Med, 2009, 15(3): 319-324．

Objective To explore the expression of RABEP1 in human renal cancer cell 786-O and investigate the influence of RABEP1 expression on proliferation and apoptosis under hypoxia. Methods The human renal cancer cell 786-O was cultured in normoxic and hypoxic condition. The mRNA and protein levels of RABEP1were detected by qRT-PCR and Western blot.The 786-O cell with ectopic expression of RABEP1 was cultured under hypoxia，and MTT and Hoechst tests were applied to investigate proliferation and apoptosis ability of 786-O cell. Results Compared to 786-O cell under normoxia，RABEP1 mRNA and protein expression level were down-regulated under hypoxia，P=0.0015 and 0.008，respectively. Compared to 786-OMOCK under hypoxia from day 3 to day 5，proliferation ability of 786-OpcDNA-RABEP1 cell was inhibited under hypoxia，all the p values were less than 0.001. Then，Compared to 786-OMOCK under hypoxia，apoptosis ability of 786-OpcDNA-RABEP1 cell was enhanced under hypoxia. Conclusions Hypoxia could inhibit RABEP1 expression，and ectopic expression of RABEP1 could suppress proliferation and enhance apoptosis of human renal cancer 786-O under hypoxia.

Human renal cancer cell Proliferation Apoptosis Hypoxia RABEP1

410011 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院泌外器官移植科

*通信作者