胡元春，王　巖，邴　睿

（1.河南省新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266000；3.甘肅省隴南市畜牧獸醫(yī)局，甘肅 隴南 746000）

牛結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究

胡元春1，王巖2，邴睿3

（1.河南省新鄉(xiāng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266000；3.甘肅省隴南市畜牧獸醫(yī)局，甘肅 隴南 746000）

牛結(jié)核病是一種重要的人獸共患病，可感染多種動(dòng)物。OIE將其定義為必須通報(bào)的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。近年來，隨著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的迅速擴(kuò)張，此病已嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，并嚴(yán)重威脅了公共衛(wèi)生安全。防控牛結(jié)核病是當(dāng)務(wù)之急，本文從細(xì)菌學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)三方面對(duì)該病實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行了闡述。

牛結(jié)核?。辉\斷

牛結(jié)核病由牛分枝桿菌引起，呈世界性分布，一年四季均可發(fā)生。此病潛伏期較長(zhǎng)，偶見急性感染，通常無臨床癥狀，晚期臨床癥狀顯著，包括漸進(jìn)性消瘦、食欲不振、虛弱、波動(dòng)熱等。常見氣溶膠感染，也有牛因攝入受污染的飼料感染此病?！秶?guó)家動(dòng)物疫病防治中長(zhǎng)期規(guī)劃（2012-2020）》將奶牛結(jié)核病列為優(yōu)先防治的國(guó)內(nèi)動(dòng)物疫病（16種）之一，并制定了奶牛結(jié)核病的綜合防治措施。我國(guó)控制牛結(jié)核病的基本策略是“檢疫—撲殺”。因此病早期幾乎無臨床癥狀，所以實(shí)驗(yàn)室診斷在牛結(jié)核病防控中占有重要位置。目前，國(guó)際上通用的牛結(jié)核病診斷方法有三種：細(xì)菌學(xué)方法、免疫學(xué)方法及分子生物學(xué)方法。

1　細(xì)菌學(xué)方法

目前，細(xì)菌學(xué)方法主要有涂片檢查和細(xì)菌培養(yǎng)。

涂片鏡檢應(yīng)用廣泛，主要采用萋尼氏（Niehl-Neelson）染色法。染色呈陽(yáng)性的細(xì)菌，可初步判定為分枝桿菌。但此法敏感性和特異性較差，只能檢測(cè)大于10000CFU/mL的細(xì)菌，且不能鑒定其種屬。分離培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基有小川培養(yǎng)基、丙酮酸鈉培養(yǎng)基、羅氏培養(yǎng)基等。此菌生長(zhǎng)期為2～8周，之后還需2～4周的生化試驗(yàn)以鑒定菌種，若進(jìn)行藥敏試驗(yàn)還需2～4周。傳統(tǒng)的菌種鑒定方法繁瑣、時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本較高，但檢出率低，且易受客觀因素影響造成鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確，并非特別理想的牛分枝桿菌檢測(cè)方法。

2　分子生物學(xué)方法

PCR方法特異性和敏感性均高于傳統(tǒng)方法，且在排除假陽(yáng)性和假陰性方面效果顯著。常見方法有間隔區(qū)寡核苷酸基因分型（Spoligotyping）、可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)序列分析（VNTR）和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）。

RFLP方法耗時(shí)耗力、不易成功，且需進(jìn)行大量細(xì)菌培養(yǎng)，對(duì)DNA純度要求很高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能數(shù)字化。VNTR方法與之比較，操作更簡(jiǎn)單迅速，需菌量少、分析結(jié)果可數(shù)字化，實(shí)用性更強(qiáng)。

3　免疫學(xué)方法

免疫學(xué)方法包括皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、γ-干擾素試驗(yàn)及膠體金方法等。目前我國(guó)通用的方法為皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)。

許多國(guó)家利用皮內(nèi)變態(tài)方法根除了牛結(jié)核病。但此法操作繁瑣，結(jié)果不穩(wěn)定，可重復(fù)性差，敏感性和特異性差，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。γ-干擾素實(shí)驗(yàn)被澳大利亞、愛爾蘭和新西蘭等國(guó)家正式認(rèn)可為可行性試驗(yàn)。與皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)相比，該法操作快速簡(jiǎn)單，敏感性更高，且可排除部分禽分枝桿菌或其他NTM引起的假陽(yáng)性。但由于該試劑盒價(jià)格高，我國(guó)只有部分地區(qū)采用此法。

4　小　結(jié)

牛結(jié)核病早期并無明顯臨床癥狀，所以實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法尤其重要。建議臨床上采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行初篩，并對(duì)陽(yáng)性牛進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測(cè)和PCR技術(shù)檢測(cè)。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2016.09.037