張廣才

(山東省博興畜牧獸醫(yī)局，山東 濱州 256500)

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一株鴨病毒性肝炎的分離和鑒定

張廣才

(山東省博興畜牧獸醫(yī)局，山東 濱州 256500)

為確定發(fā)病鴨場(chǎng)的致病原，并對(duì)病原進(jìn)行分離與鑒定，將組織病料接種SPF雞胚成功分離到了1株病毒，分離株病毒對(duì)1%雞紅細(xì)胞無凝集性，分離株病毒的ELD50為10-4.83/0.1 mL，分離株病毒攻擊的雛鴨表現(xiàn)出鴨病毒性肝炎病毒感染的典型臨床癥狀和病理變化，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示分離株病毒為基因A型鴨甲肝病毒。

鴨；病毒性肝炎；分離；鑒定

鴨病毒性肝炎主要感染1周齡內(nèi)雛鴨，以發(fā)病急、傳播快、病程短、發(fā)病率和死亡率高為主要特征[1]，每年都給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害著養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。在我國，該病的致病原主要是鴨甲肝病毒中的基因A型和C型[2]?，F(xiàn)對(duì)山東博興1例疑似感染鴨病毒性肝炎的病例進(jìn)行了臨床診斷，并采集病死鴨的肝臟等組織進(jìn)行了病毒的分離與鑒定，為發(fā)病鴨場(chǎng)找到了致病原因，也為基因A型鴨甲肝病毒新型疫苗、診斷試劑、卵黃抗體的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

病料樣品來源：病料樣品采自山東博興某發(fā)病鴨場(chǎng)病死鴨的肝臟組織。主要試劑盒：病毒基因組RNA提取試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。臨床診斷：觀察發(fā)病鴨場(chǎng)鴨的臨床癥狀和病理變化。病毒分離：無菌取死亡鴨的肝臟組織與滅菌生理鹽水以1∶3比例混合，研磨成組織勻漿，反復(fù)凍融3次，12000r/min離心10min，上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾除菌，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，棄去24 h內(nèi)死亡胚，死胚隨時(shí)取出放4℃保存，120 h后，收獲全部死胚尿囊液，連續(xù)傳3代，-20℃保存。分離毒株的血凝性測(cè)定：按常規(guī)方法測(cè)定第3代分離毒株的尿囊液對(duì)1%雞紅細(xì)胞的凝集性。分離毒ELD50測(cè)定：用滅菌生理鹽水將第3代分離毒的尿囊液做10倍系列稀釋，取10-4、10-5，10-63個(gè)稀釋度分別接種10日齡SPF雞胚，每個(gè)稀釋度接5枚，0.1 mL/胚，按Reed-Muench法測(cè)定分離毒株的ELD50。

致病性試驗(yàn)：取第3代分離毒的尿囊液按100 ELD50的接種劑量接種7日齡健康雛鴨10只，接種方法為頸部皮下注射，接種劑量為0.2 mL/只，取10只雛鴨接種滅菌生理鹽水作為對(duì)照。2組試驗(yàn)鴨均隔離飼養(yǎng)，觀察14天，觀察記錄試驗(yàn)鴨的發(fā)病、死亡情況，對(duì)死亡雛鴨剖檢，觀察病理變化。

RT-PCR檢測(cè)：根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]分別設(shè)計(jì)合成檢測(cè)鴨病毒性肝炎病毒I型和新型特異性檢測(cè)引物，利用病毒基因組RNA提取試劑盒提取第3代分離毒株尿囊液的病毒基因組RNA，以提取的RNA為模板，參照參考文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行鴨病毒性肝炎病毒I型和新型的RT-PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

臨床診斷結(jié)果：病鴨表現(xiàn)精神沉郁，采食減少或不食，喜臥，發(fā)病2～3天后出現(xiàn)死亡，死亡雛鴨呈角弓反張。對(duì)病死鴨剖檢可見肝表面有針尖大小出血點(diǎn)、肝臟極度腫大、質(zhì)脆。病毒分離結(jié)果：臨床病料接種SPF雞胚后48～72 h出現(xiàn)死亡，120 h后全部死亡，死亡雞胚胚體全身出血，肝臟嚴(yán)重出血、有明顯的壞死灶或壞死點(diǎn)。將無菌收集的第3代死亡鴨胚尿囊液-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血凝性測(cè)定結(jié)果：分離毒株對(duì)1%雞紅細(xì)胞無血凝性。ELD50的測(cè)定結(jié)果：按Reed-Muench法測(cè)定第3代分離毒的ELD50為10-4.83/0.1mL。致病性試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)鴨在攻毒后24h開始出現(xiàn)食欲廢絕、精神萎靡、兩腳痙攣等臨床表現(xiàn)，至96h已死亡9只，致死率高達(dá)90%，死亡鴨呈現(xiàn)典型的角弓反張姿勢(shì)。解剖病死鴨可見肝臟出血、腫大、具有出血斑等典型的病理變化。對(duì)照組10只雛鴨全部健康，食欲、精神狀態(tài)均正常。分離毒株具有較強(qiáng)的致病性。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：按照參考文獻(xiàn)[3]的方法對(duì)第3代分離毒尿囊液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)， RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳可見大小為317 bp的擴(kuò)增條帶，與鴨病毒性肝炎I型的預(yù)期大小一致，即檢測(cè)結(jié)果為鴨病毒性肝炎I型陽性。

3 討論

鴨病毒性肝炎是危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要病毒性傳染病，該病主要感染雛鴨，發(fā)病率和死亡率都很高。本研究分離毒株的獲得為鴨病毒性肝炎多價(jià)疫苗和多價(jià)高免卵黃抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)本研究顯示，利用10日齡SPF雞胚可以進(jìn)行鴨病毒性肝炎病毒的分離，表明鴨病毒性肝炎地方流行株適應(yīng)在SPF雞胚中繁殖。各型病毒引起鴨病毒性肝炎的臨床癥狀相似，給鴨病毒性肝炎的分型檢測(cè)增加了難度，本研究也證實(shí)RT-PCR檢測(cè)方法可以進(jìn)行鴨病毒性肝炎的分型檢測(cè)，可在分離毒株的分型鑒定和臨床鑒別診斷中推廣應(yīng)用。

[1] 于京平，曲曉杰. 鴨病毒性肝炎研究進(jìn)展[J].家禽科學(xué)，2015(12)：52-56.

[2] 張占龍，李敏，宋永鴻，等. 鴨甲肝病毒基因A型和C型雙價(jià)卵黃抗體的研制與保護(hù)效果研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015(9)：22-24.

[3] 柴順秀，馬花，韓英，等. 應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)鴨病毒性肝炎新型和I型病毒[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，34(11)：64-67.

2016-09-26

張廣才(1984-)，男，山東濱州人，本科，助理獸醫(yī)師，從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣工作。

10.19369/j.cnki.2095-9737.2016.12.098

S858.32

B

2095-9737(2016)12-0109-01